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Bioengineering

Um sistema microfisiológico para estudar a interação das células leucócitos-endoteliais durante a inflamação

Published: December 9, 2021 doi: 10.3791/63312
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 1,2,6
1Department of Mechanical Engineering, Temple University, 2Department of Bioengineering, Temple University, 3Department of Bioengineering, University of Toledo, 4Biomedical Technology, CFD Research Corporation, 5Center for Inflammation and Lung Research, Department of Microbiology, Immunology and Inflammation, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 6Department of Radiation Oncology, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

Summary

Neste protocolo, um ensaio biomimético de microfluido, que pode reproduzir um ambiente microvascular fisiologicamente relevante e reproduzir toda a cascata de adesão/migração leucócito, é empregado para estudar interações células leucócitos-endoteliais em doenças inflamatórias.

Abstract

As interações leucócito-endotelial desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, como a sepse. Durante a inflamação, a migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave pode levar à falência de órgãos. Um ensaio microfluido biomimético fisiologicamente relevante (bMFA) foi desenvolvido e validado utilizando várias técnicas experimentais e computacionais, que podem reproduzir toda a cascata de rolagem/adesão/migração leucócitos para estudar interações células leucócitos-endoteliais. Redes microvasculares obtidas a partir de imagens in vivo em roedores foram digitalizadas usando uma abordagem do Sistema de Informações Geográficas (SIG) e microfabricadas com polidimtilsiloxano (PDMS) em um slide de microscópio. Para estudar o efeito da taxa de corte e topologia vascular nas interações leucócito-endotelial, foi desenvolvido um modelo de Dinâmica de Fluidos Computacionais (CFD) para gerar um mapa correspondente de taxas de corte e velocidades em toda a rede. O bMFA permite a quantificação de interações leucócito-endotelial, incluindo velocidade de rolamento, número de leucócitos aderidos em resposta a diferentes taxas de tesoura, número de leucócitos migrados, permeabilidade de células endoteliais, expressão de molécula de adesão e outras variáveis importantes. Além disso, utilizando amostras relacionadas ao homem, como células endoteliais humanas e leucócitos, a BMFA fornece uma ferramenta para uma triagem rápida de potenciais terapêuticas para aumentar sua tradução clínica.

Introduction

A inflamação é a resposta do hospedeiro à infecção e lesão, e o endotélio desempenha um papel importante na resposta inflamatória 1,2,3. A desregulação inflamatória é a causa básica de uma série de patologias da doença, como sepse, doenças cardiovasculares, asma, doença inflamatória intestinal, câncer e COVID-19. As interações leucócito-endotelial desempenham um papel central nessas doenças inflamatórias. Durante a inflamação, a liberação de PAMPS (padrões moleculares associados ao patógeno) de patógenos ou DAMPS (padrões moleculares associados a danos) de tecidos feridos ativam células imunes para liberar citocinas/quimiocinas e outros mediadores proinflamatórios que levam à ativação do endotélio, resultando em alterações na função de barreira de endotélio vascular e aumento da permeabilidade 3,4 . O aumento da ativação das células endoteliais durante a inflamação resulta em uma interação leucócito-endotelial aprimorada levando à migração excessiva de leucócitos ativados através do endotélio vascular em órgãos-chave 1,5,6,7.

O recrutamento de leucócitos é iniciado por quimioattractants quimicamente diversos compostos por lipídios bioativos, citocinas, quimiocinas e componentes complementares 8,9. O recrutamento de leucócitos é um processo de várias etapas que inclui cinco passos discretos: 1) margem leucócito e captura/apego, 2) rolamento, 3) prisão firme, 4) espalhamento e rastreamento e 5) extravasão/migração (Figura 1). Cada etapa desse processo requer conversa cruzada entre leucócitos e células endoteliais para orquestrar esse fenômeno dinâmico 1,9. Em última análise, leucócitos presos extravasam para tecidos inflamados através de endotélio através de um processo de várias etapas controlado por sinais quimiócitos, eventos adesivos e hemodinâmicas de tesoura 1,9,10,11,12.

Dado o papel central do estresse da cisalhamento na regulação da função celular endotelial e o significado das interações células leucócito-endotélio13, vários modelos in vitro foram desenvolvidos durante as últimas décadas para estudar vários aspectos da cascata de migração leucócito em um ambiente mais controlado14. Dispositivos fluidos tradicionais para estudar interações células leucócitos-endoteliais podem ser classificados em duas grandes categorias14: a) dispositivos para estudar a expressão de moléculas de rolamento, adesão e adesão de leucócitos, como câmaras de fluxo de placas paralelas e b) dispositivos para estudar a migração de leucócitos em condições estáticas, como câmaras transwell. Sistemas como câmaras de fluxo de placas paralelas têm sido usados para estudar os papéis das moléculas de adesão e seus ligantes na cascata de aderência sob as forçasde cisalhamento 15. No entanto, uma desvantagem significativa é que esses dispositivos simplistas e idealizados (por exemplo, canal reto) não são capazes de reproduzir a escala e a geometria da microvasculatura in vivo (por exemplo, bifurcações vasculares sucessivas, morfologia vascular) e as condições de fluxo resultantes (por exemplo, fluxos convergentes ou divergentes em bifurcações). Como resultado, esses dispositivos só podem modelar a adesão, mas não a transmigração. As câmaras transwell só podem estudar a transmigração em condições estáticas sem considerar as características geométricas in vivo e as condições de fluxo. Assim, esses modelos tradicionais não imitam o microambiente dos tecidos vivos nem resolvem a adesão e a cascata migratória em um único ensaio6.

Para lidar com essa limitação, desenvolvemos e validamos extensivamente um novo ensaio microfluido biomimetético 3D (bMFA) (Figura 2), que reproduz realisticamente redes microvasculares in vivo em um chip 16,17,18. O protocolo de microfabricção deste dispositivo foi publicado anteriormente17 e é apenas brevemente descrito aqui. A microvasculatura do músculo cremaster do rato foi digitalizada usando uma abordagem modificada do Geographic Information System (GIS)19. Em seguida, a rede microvascular sintética foi gerada em polidimtilsiloxano (PDMS) utilizando processos de litografia suave com base na rede microvascular digitalizada 14,17,20,21,22. Resumidamente, as imagens digitalizadas da rede foram impressas no filme Mylar, que foi então usado como uma máscara para padronizar um fotoresist positivo SU-8 em cima de um wafer de silício para criar os mestres para fabricação. Pilares microfabricados (10 μm de diâmetro, 3 μm de altura) foram utilizados para criar os poros de 3 μm de altura e 100 μm de largura, um tamanho ideal para a migração de leucócitos 23,24,25, conectando os canais vasculares e compartimentos teciduais. O PDMS foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e derramado sobre os mestres desenvolvidos. Além disso, o PDMS foi desgaseado e autorizado a curar durante a noite em um forno (65 °C) para criar microcanais complementares em PDMS. Posteriormente, o PDMS curado foi descascado do mestre SU-8, seguido de portas perfuradoras para entradas/tomadas. Então, o PMDS foi ligado a um deslizamento de vidro. A superfície do dispositivo microfluido compreende vidro nativo e PDMS. Para promover o apego da célula, a disseminação e a proliferação, é necessário o revestimento da matriz extraceluar (ECM). O bMFA inclui uma rede microvascular e um compartimento de tecido conectado através de poros de 3 μm de altura e 100 μm de largura (Figura 2). Este sistema microfluido reproduz toda a cascata de adesão/migração leucócito em um ambiente 3D fisiologicamente relevante de uma rede microvascular completa com vasos interligados e bifurcações, incluindo circulação, margem, rolamento, adesão e migração de leucócitos para o compartimento vascular extra-tecido em um único sistema 14,16,17,21,26.

Deve-se notar que mesmo quando a taxa de fluxo na entrada de bMFA é fixada, as condições de fluxo na rede variam em diferentes locais e não podem ser calculadas por uma fórmula matemática simples. Um modelo baseado em dinâmica de fluidos computacionais (CFD) foi desenvolvido para calcular diferentes parâmetros de fluxo (por exemplo, estresse de cisalhamento, taxa de cisalhamento, velocidade) em diferentes locais da rede. Este modelo cfd foi utilizado para simular os padrões de perfusão de corante e parâmetros de fluxo no bMFA. A validação cruzada com resultados experimentais sugeriu que as resistências de fluxo em toda a rede são bem previstas pelo modelo computacional (Figura 3)17. Este modelo de CFD foi então utilizado para estimar o perfil de velocidade e taxa de cisalhamento em cada vaso de bMFA (Figura 4), permitindo a análise dos efeitos do fluxo de cisalhamento e geometria sobre rolamento de leucócitos, adesão e migração16. Leucócitos preferencialmente aderem perto de bifurcações e em regiões de baixa tesoura in vivo, e esses padrões espaciais de adesão leucócito foram demonstrados com sucesso na BMFA usando neutrófilos (Figura 5)16. Este artigo descreve o protocolo de preparação da BMFA para estudar a interação leucócito-endotelial sob condições inflamatórias usando células endoteliais pulmonares humanas (HLMVEC) e neutrófilos humanos. Sistemas microfisiológicos, como o bMFA, podem ser usados para estudar interações celulares endoteliais com diferentes tipos de células, como neutrófilos, monócitos, linfócitos e células tumorais 18,27,28,29,30. O bMFA pode ser semeado com células endoteliais primárias de diferentes órgãos (por exemplo, pulmão vs. cérebro) e diferentes espécies (por exemplo, células endoteliais humanas vs. murinas), bem como linhas de células endoteliais 21,27,31,32. O bMFA pode ser usado para estudar múltiplas respostas celulares, interações célula-células, função de barreira, entrega de drogas e toxicidade de drogas.

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Protocol

O sangue humano heparinizado é obtido para isolamento de neutrófilos de doadores adultos saudáveis (homens e mulheres, com idade entre 21 e 60 anos), seguindo o consentimento informado, conforme aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Temple University (Filadélfia, PA, EUA).

1. Priming e revestimento do dispositivo com fibronectina humana

NOTA: O bMFA possui duas portas de entrada e duas portas de saída conectadas ao compartimento vascular. Também possui uma porta conectada ao compartimento tecidual (Figura 2).

  1. Inserir tubos (O.D. de 0,06" e I.D. de 0,02") (Tabela de Materials) para todas as portas, exceto uma porta de entrada com fórceps de ponto fino. Fixar as duas portas de saída e a porta do compartimento de tecido com grampos na mandíbula. Certifique-se de que cada tubo tem ~1 polegada de comprimento.
  2. Diluir a fibronectina humana a 100 μg/mL com PBS a partir da solução de estoque de fibronectina (1mg/mL). Carregue uma seringa de 1 mL com solução de fibronectina preparada. Conecte a seringa a uma agulha de 24 G e uma tubulação de ~4 polegadas de comprimento.
    NOTA: Para evitar a ligação cruzada, não misture/pipeta a fibronectina humana. Outras matrizes extracelulares (ECM) como o colágeno podem ser usadas para diferentes tipos de células.
  3. Insira a tubulação na porta de entrada aberta, empurre o êmbolo até que a fibronectina humana saia da outra porta de entrada e, em seguida, aperte-a. Repita este processo para o resto das portas até que todos os canais, compartimento de tecido e tubulação estejam preenchidos com a solução de fibronectina humana. Remova a agulha, mas mantenha a tubulação de 4 polegadas de comprimento inserida e sem arrepiar.
    NOTA: Certifique-se de que a tubulação está cheia de fibronectina antes de ser fixada.
  4. Para desgasear, conecte a tubulação nãoclamped a um tanque de nitrogênio comprimido através do Primer Pneumatic, ajuste a pressão para ~5 psi e execute por ~15 min.
  5. Depois de 15 min, verifique sob o microscópio para ter certeza de que não há bolhas de ar presas no dispositivo. Se houver bolhas de ar presas no canal ou compartimento de tecido, reconecte o dispositivo ao Primer Pneumático para desgassar novamente, ou seja, repita o passo 1.4.
    NOTA: O microscópio invertido é usado em todas as etapas que envolvem microscopia neste protocolo.
  6. Remova o dispositivo do Primer Pneumático. Incubar o dispositivo a 37 °C por 1h, depois lave todos os canais e compartimento de tecido com mídia de cultura HLMVEC pré-aquecida (Tabela de Materiais), semelhante ao passo 1.3. O BMFA está pronto para semeadura celular.
    NOTA: Antes de remover/inserir uma tubulação da porta, primeiro coloque uma gota de água com uma pipeta ao redor da base da tubulação da porta de entrada para evitar que o ar entre no dispositivo.

2. Semeadura bMFA com HLMVEC

  1. Cultura HLMVEC para 60%- 80% de confluência de acordo com o protocolo do fornecedor em um frasco T-25.
  2. Aspirar mídia cultural HLMVEC a partir de frasco de cultura celular. Lave duas vezes com PBS.
  3. Adicione 2 mL de solução pré-aquecida de trippsin-EDTA (37 °C) no frasco T-25. Incubar por 3-5 min em uma incubadora (37 °C, 5% DE CO2) até que a maioria das células sejam separadas do frasco.
    NOTA: O tempo de incubação pode variar para diferentes tipos de células e concentração de trypsin-EDTA.
  4. Adicione 2 mL de Solução de Neutralização de Trypsin (TNS, 37 °C) ao frasco para neutralizar o trypsin-EDTA.
  5. Toque suavemente no frasco para ajudar a dissociar as células. Em seguida, transfira a solução de suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
  6. Centrifugar por 5 min a 150 x g para pelotar as células endoteliais. Remova as células supernascidas e resuspendas em 3 mL de mídia de cultura celular. Conte o número de células com um hemócito.
  7. Centrifugar novamente por 5 min a 150 x g para pelotar as células. Remova o supernatante e resuspenda as células para a densidade de semeadura desejada de 20 x 106/mL.
    NOTA: Dependendo dos tipos de células e da confluência, cerca de 2 x 106 células endoteliais podem ser coletadas de dois frascos T-25, e com a densidade de semeadura de 20 x 106/mL, 100 μL da célula de suspensão celular (2 x 106 células endoteliais), é suficiente para semear 5 dispositivos.
  8. Monte uma seringa de 1 mL na bomba de seringa programável, conecte tubos à agulha cega.
  9. Desenhe ~20 μL da suspensão da célula para dentro da tubulação, certificando-se de que a suspensão da célula está apenas no tubo, não no barril de seringa.
  10. Tire o grampo de uma porta de saída do dispositivo. Conecte a tubulação a uma entrada do dispositivo. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar seja introduzida no canal.
  11. Inicie a bomba com uma vazão de 4-8 μL/min. Observe o dispositivo sob um microscópio.
  12. Quando os canais estiverem cheios de células, pare a bomba, aperte a saída e corte a tubulação de entrada.
    NOTA: Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar no dispositivo.
  13. Coloque o dispositivo na incubadora por 4h a 5% de CO2 e 37 °C.
  14. Após a incubação de 4h, prepare outra seringa cheia de mídia de cultura celular fresca. Monte a seringa em uma bomba de seringa, conecte a seringa à porta de entrada e remova o grampo de uma porta de saída.
  15. Execute uma nova mídia através do dispositivo por cerca de 5 min a 4-8 μL/min para lavar células flutuantes/nãoectadas.

3. Cultura celular sob fluxo por 48 h

  1. Prepare uma seringa cheia de mídia de cultura celular fresca. Monte a seringa em uma bomba de seringa, conecte a seringa a uma porta de entrada e mantenha uma saída aberta. Coloque o dispositivo na incubadora (5% DE CO2, 37 °C).
  2. Programe a bomba de seringa para cultivar células endoteliais sob fluxo usando as seguintes instruções mencionadas na Tabela 1.
  3. Verifique o bMFA sob um microscópio após 48 horas de cultura sob fluxo. O HLMVEC deve abranger canais vasculares formando um lúmen completo (Figura 6).
    NOTA: Outros regimes de fluxo podem ser necessários para diferentes tipos de células.

4. Citocina e/ou tratamento terapêutico

NOTA: Como exemplo, esta seção descreve o uso do bMFA para estudar o impacto do tratamento das células com fator-alfa de necrose tumoral (TNF-α) e um novo inibidor anti-inflamatório (inibidor de peptídeos proteína Kinase C delta-TAT, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.

  1. Prepare três dispositivos bMFA diferentes usando o protocolo acima (seção 1-3).
  2. Carregue três seringas de 1 mL com mídia de cultura celular(TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM), respectivamente.
    NOTA: As citocinas são reconstituídas em meios de cultura celular.
  3. Conecte as três seringas a três dispositivos bMFA. Trate o HLMVEC com tampão TNF-α ou inibidor TNF-α + por 4 h a 0,1 μL/min.
    NOTA: Com base em requisitos específicos de estudo, outros coquetéis de citocinas ou citocinas (por exemplo, TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gama (IFN-γ)), podem ser usados para tratar células endoteliais.

5. Isolamento de neutrófilos humanos

  1. Use todos os reagentes à temperatura ambiente (RT). Os reagentes incluem mídia de isolamento leucócito, 1x tampão HEPES com Ca2+/Mg2+ (Tabela 2), 6% Dextran em soro fisiológico normal (0,9% NaCl), solução de NaCl de 3,6% e água desordenada (DI).
  2. Pipeta 20 mL de mídia de isolamento de leucócitos em um tubo cônico de 50 mL e cuidadosamente camada 25 mL de sangue sobre a mídia de isolamento de leucócitos. Centrífuga por 40 min a 427 x g no RT.
    NOTA: Faça este passo devagar e com cuidado para evitar misturar a mídia de isolamento de sangue e leucócito.
  3. Aspire até ~5 mL acima da camada de glóbulos vermelhos (RBC). A camada branca de buffy em cima da RBC é predominantemente neutrófilos.
  4. Adicione o buffer HEPES para dobrar o volume atual (volume existente: buffer HEPES = 1:1).
  5. Adicione uma quantidade de 6% de Dextran, que será de 20% do volume final. (volume atual/4 = volume de acréscimo de 6% de Dextran).
  6. Inverta o tubo suavemente algumas vezes para misturar bem e deixe o sedimento RBC (~25 min).
  7. Pipete cuidadosamente a camada superior (camada rica em neutrófilos) e transfira para um novo tubo de 50 mL, tenha cuidado para não contaminar com RBC sedimentado.
  8. Centrifugar por 10 min a 315 x g em RT. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 8 mL de tampão HEPES.
  9. Para lise o RBC residual, adicione 24 mL de água DI e misture suavemente por 50 s. Imediatamente, adicione 8 mL de solução NaCl de 3,6%, misture e centrífuga por 10 min a 315 x g no RT.
  10. Remova o supernasce, lave a pelota celular com 15 mL de tampão HEPES e centrífuga por 5 min a 315 x g. Resuspend a pelota no buffer HEPES.

6. Experimento de adesão e migração de neutrófilos com bMFA

  1. Resuspend os neutrófilos humanos isolados (15 milhões) em 999 μL de tampão HEPES.
  2. Adicione 1 μL CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) solução de estoque de corante (10 mM) à suspensão de neutrófilo para obter uma concentração de trabalho de 10 μM CFDA-SE e incubar por 10 minutos na RT. Lave as células duas vezes com tampão HEPES por centrifugação por 5 min a 315 x g.
  3. Conte os neutrófilos usando um hemótmetro e resuspende em 2 milhões de neutrófilos/mL com mídia de cultura celular, TNF-α (10 ng/mL) e TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM), respectivamente; incubar por 15 min no RT antes do início do experimento.
  4. Prepare uma seringa preenchida com 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), o quimioattractant para o estudo, na mídia de cultura celular. Pegue bMFA e abra uma porta de entrada e uma porta de saída.
    NOTA: Estas condições experimentais são usadas para imitar as condições de sepse que incluem uma resposta inflamatória sistêmica com altos níveis de citocinas/quimioterapias circulantes. Além disso, fMLP, um peptídeo gram-negativo derivado de bactérias, é usado para modelar a presença de bactérias no pulmão (ou seja, compartimento de tecido).
  5. Remova a tubulação da porta do compartimento do tecido e insira a tubulação fMLP. Injete ~20 μL de fMLP no compartimento tecidual para todos os bMFA, exceto aquele tratado apenas com mídia de cultura celular. Em seguida, corte a tubulação e aperte-a.
  6. Encha a seringa com ~200 μL de suspensão de neutrófilo e monte a seringa na bomba de seringa.
  7. Coloque o dispositivo no estágio do microscópio invertido (Tabela de Materiais).
  8. Inicie a bomba a uma vazão de 1 μL/min e espere até que uma pequena gota da suspensão de neutrófilo saia da tubulação. Insira a tubulação na porta de entrada. Consulte a Figura 7 para a configuração.

7. Adquira imagens

  1. Use a função Digitalizar grande imagem no software de análise de imagens do microscópio (Tabela de Materiais) para obter o mapa de adesão em bMFA (Figura 8) 10 min após o início do experimento. A maioria dos neutrófilos entram na BMFA durante os primeiros 10 minutos.
    NOTA: Mantenha a luz da fluorescência desligada ao não tirar imagens para reduzir o fotobleaching.
  2. Durante a próxima hora, faça imagens timelapse (1 imagem a cada 5 minutos) do compartimento de tecido (Figura 8B,C) para análise de migração para obter o mapa de migração.

8. Análise de imagem digital

  1. Para o mapa de adesão, conte o número de neutrófilos aderidos em cada vaso. Para cada bifurcação, crie uma região circular de interesse (ROI) com diâmetro igual a duas vezes o diâmetro do vaso e conte o número de neutrófilos aderidos.
  2. Use a contagem manual ou a função automatizada de contagem de objetos para quantificar o número de neutrófilos que adusinam em cada vaso e região de bifurcação.
  3. Use o mapa de taxa de corte da rede gerada usando simulação CFD17 para determinar a taxa de tesoura em cada vaso. Em seguida, plote o número de neutrófilos aderidos em um determinado vaso contra a taxa de corte naquele vaso para criar um mapa de taxa de corte na bMFA, como mostrado na Figura 9A.
  4. Os neutrófilos são contados como migrados se cruzaram o endotélio para o compartimento tecidual. Conte o número de neutrófilos migrados em 10 minutos, 15 min, 30 min e 60 min. Plote o número de neutrófilos migrados versus o tempo, como mostrado na Figura 9B.

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Representative Results

Após 48h de cultura sob fluxo de cisalhamento na BMFA, as células endoteliais cobriam a superfície dos canais vasculares na BMFA e se alinhavam na direção do fluxo (Figura 6). A microscopia confocal indicou que todas as superfícies dos canais vasculares estavam cobertas por células endoteliais, formando um lúmen 3D completo em bMFA18.

Usando este protocolo, um mapa de adesão de neutrófilos pode ser adquirido, mostrando que há uma adesão significativa de neutrófilos às células endoteliais na BMFA (Figura 8). Correlacionar a distribuição espacial de neutrófilos neste mapa de adesão com o mapa da taxa de corte gerado a partir do modelo CFD mostra que a adesão de neutrófilos é dependente de tesoura, e os neutrófilos preferencialmente aderem em baixas regiões de corte e bifurcação (Figura 9A). A adesão de neutrófilos às células endoteliais ativadas pela TNF α aumentou significativamente. A análise de imagens timelapse indicou que a ativação α TNF das células endoteliais aumenta a migração de neutrófilos em resposta ao quimioattractant fMLP (Figura 9B). Como dito acima, a BMFA pode ser usada para testar rapidamente a eficácia de um novo terapêutico para o tratamento de doenças inflamatórias. Por exemplo, o tratamento de células endoteliais e neutrófilos com PKCδ-i reduziu significativamente a adesão e migração de neutrófilos (Figura 9A,B)27.

Figure 1
Figura 1: Ativação celular endotelial durante a inflamação. (A) Em condições normais, o endotélio vascular é coberto pelo glicóclee e forma uma barreira apertada que regula a permeabilidade da barreira, migração de leucócitos e defesas anti-inflamatórias. (B) Durante a inflamação, leucócitos e células endoteliais são ativados pelo PAMPS e PELAMPS para produzir citocinas e quimioattractants, levando à expressão elevada de moléculas superficiais em ambas as células leucócitos e endoteliais, aumentando as interações leucócito-endotelial. Interações de E/P-selectin em células endoteliais e seus ligantes (por exemplo, PSGL-1) em leucócitos estão envolvidas no rolamento, o que retarda o neutrófilo. A adesão firme é regulada por moléculas de adesão expressas por endotélio, incluindo ICAM-1, ICAM-2 e VCAM-1, e seus ligantes, β2 integrins. Em resposta aos gradientes de quimioattractant, os leucócitos aderidos migram através de junções endoteliais reguladas por PECAM-1 e JAMs. Leucócitos ativados migram para o tecido, onde liberam citocinas, espécies reativas de oxigênio/nitrogênio e proteases para combater a infecção. No entanto, a migração disregulada de leucócitos pode danificar o tecido dos órgãos, resultando em falência de órgãos. Durante a inflamação, o glicoscopcalyx é degradado, as junções apertadas das células endoteliais são danificadas e há aumento da apoptose celular endotelial, levando à função da barreira danificada e aumento da permeabilidade. Este número foi modificado de Yang et al.2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Visão geral do bMFA. (A) As imagens do músculo cremaster do mouse são obtidas e (B) digitalizadas usando o sistema GIS para fabricar a rede em PDMS. (C) A imagem de campo brilhante da rede bMFA mostra que, no bMFA, os canais vasculares são conectados ao compartimento tecidual através de uma barreira de 3 μm (a inserção esquemática no Painel C). A direção de fluxo dos canais vasculares é indicada. (D) Um chip bMFA, consistindo de uma camada PDMS ligada a um slide de microscópio, está no estágio do microscópio. A tubulação é inserida em duas portas de entrada, duas portas de saída e uma porta com compartimento de tecido. (C: barra de escala = 500 μm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Estudos transitórios de perfusão comparando resultados experimentais e simulados em bMFA. (A) A rede de bMFA mostrando a direção de entrada, saída e fluxo. (B) Painel superior: perfis de perfusão cfd. Painel inferior: Perfis experimentais de perfusão. As imagens são pseudocoloridas para mostrar gradientes. A escala é normalizada com azul (sem perfusão; 0) e magenta (perfusão completa; 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Perfil de taxas de velocidade e tesoura em bMFA a partir de simulações CFD. (A) Distribuição de magnitudes de velocidade (Vmag) em toda a rede. (B) A distribuição da taxa de corte indica taxas heterogêneas de corte na rede. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Padrões de adesão de neutrófilos na bMFA são semelhantes aos padrões de adesão de neutrófilos in vivo. As distribuições do número de neutrófilos aderidos in vivo e o número de neutrófilos na BMFA são ambos distorcidos para a esquerda, indicando que os neutrófilos preferencialmente aderem perto de bifurcações com o pico ocorrendo em um vaso ou diâmetro de canal a partir da bifurcação mais próxima (média ± SEM; N = 3). A distância dos neutrófilos aderidos à bifurcação mais próxima foi normalizada pelo seguinte: distância normalizada = distância ao centro da bifurcação/diâmetro mais próximo do canal. Este valor foi modificado a partir de Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, outras permissões relacionadas ao material extraído devem ser direcionadas à American Chemical Society). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: As células endoteliais formam um lúmen 3D completo no bMFA. (A) Imagens de contraste de fase mostram que as células endoteliais estão alinhadas na direção do fluxo. (B) As imagens de fluorescência mostram que as células endoteliais cobrem o canal vascular; F-actin é rotulado de verde usando falooidina e núcleos são rotulados como vermelhos usando Draq5. (A: barra de escala = 100 μm, B: barra de escala = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Um microscópio de fluorescência invertida controlado por computador é usado para estudar interações neutrófilos-endoteliais na BMFA. Um estágio controlado por computador com um aquecedor é usado para manter o bMFA a 37 °C. O bMFA está conectado a uma bomba de seringa programável através da tubulação. O microscópio de fluorescência invertida é equipado com uma câmera de vídeo para tirar imagens/vídeo para análises offline adicionais no computador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Imagens representativas da adesão de neutrófilos e mapa de migração. (A) Mapa de adesão de neutrófilos em bMFA. A imagem foi tirada 10 minutos após o início do experimento usando a função "Scan big map" do software Nikon. Os pontos brancos no mapa são neutrófilos fluorescentes com CFDA-SE. O limite do canal vascular é rotulado digitalmente (barra de escala = 100 μm). (B) Mapa de migração de neutrófilos em bMFA sem ativação de α TNF. A imagem foi tirada 60 minutos após o início do experimento. (C) Mapa de migração de neutrófilos em bMFA com ativação de α TNF. A imagem foi tirada 60 minutos após o início do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Padrões de adesão de neutrófilos e migração na BMFA durante a inflamação. (A) O tratamento de α TNF aumentou significativamente a adesão de neutrófilos humanos às células endoteliais pulmonares humanas, que foi inibida após o tratamento com um inibidor PKCδ. A adesão ao neutrófilo ocorreu preferencialmente em vasos com baixa taxa de corte e quase bifurcações na BMFA. (B) Em resposta ao fMLP, a migração de neutrófilos humanos através de células endoteliais ativadas pelo TNF-α foi significativamente aumentada em comparação com as células não tratadas. O tratamento com o inibidor PKCδ reduziu a migração para níveis não tratados. n = 4, Média ± SEM, ANOVA unidirecional, ** p < 0,01, e *** p < 0,001). O número foi modificado a partir de Soroush et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Passo 1: Taxa constante Comentários
Modo Infundir
Vazão 1 μL/min
Hora 10 min.
Passo 2: Atraso (sem fluxo)
Modo Atraso
Hora 4h
Passo 3: Repita O passo 1 e o passo 2 serão repetidos 6 vezes antes de ir para o Passo 4.
Modo Repetir
Repita de Passo 1
Repetir 6 vezes
Passo 4: Taxa de fluxo constante
Modo Infundir
Vazão 0,1 μL/min
Hora 48 h

Tabela 1: Programa de bomba de seringa

Fórmula Nome MW Adicionar Concentração Tampão HEPES 10x
(Adicione água DI a 1000 mL e ajuste o pH para 7,3. Diluir para 1x antes do uso)
NaCl Cloreto de sódio 58.44 87,66 g 1,5 M
KOH Hidróxido de potássio 56.11 2,81 g 50 mM
Hepes Hepes 238.3 23,83 g 100 mM
MgCl2 Cloreto de Magnésio 203.31 2,44 g 12 mM
CaCl2 Cloreto de Cálcio 147.62 1,90 g 12,9 mM

Tabela 2: Composição do buffer HEPES.

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Discussion

O bMFA reproduz as condições de topografia e fluxo das redes microvasculares in vivo e pode ser usado para estudar a interação celular leucócito-endotelial e a função endotelial in vitro em condições fisiologicamente realistas. Na microvasculatura de camundongos ou humanos, a geometria das redes microvasculares são auto-similares e fractais, e o número reynolds << 1, indicando que a geometria vascular não afeta significativamente os padrões de fluxo. Portanto, o bFMA pode ser usado para estudar interações leucócito-endotelial para diferentes espécies, incluindo humanos, embora a microvasculatura do músculo cremaster do rato tenha sido mapeada para a fabricação de bMFA.

A bMFA permite a avaliação em tempo real das etapas individuais da cascata de migração de neutrófilos em um único ensaio, incluindo rolagem, adesão firme, disseminação e migração de neutrófilos para o compartimento tecidual. Células humanas primárias e amostras clinicamente relevantes podem ser usadas na BMFA para aumentar a tradução e para testar rapidamente as terapêuticas potenciais. Em comparação com sistemas fluidos tradicionais, como câmaras de fluxo de placas paralelas, a BMFA tem a vantagem de usar menos de 95% dos reagentes37 devido ao seu pequeno tamanho de vaso e ao fato de que pode estudar toda a cascata de migração de neutrófilos em um único ensaio. No entanto, esse pequeno tamanho também exige que os usuários trabalhem com um volume muito pequeno de reagentes, o que pode ser desafiador e requer uma prática extensiva. O problema mais comum com este protocolo é a presença de bolhas de ar no bMFA, que podem bloquear o canal e alterar os padrões de fluxo. Portanto, deve-se tomar muito cuidado ao remover ou inserir tubos nas portas, e uma gota de água deve ser colocada na base da tubulação nos portos para evitar que o ar entre no canal sempre que a tubulação for removida da BMFA.

Além da aplicação da BMFA para o estudo de interações neutrófilo-endotelial, a bMFA também tem sido utilizada para estudar a integridade do endotélio durante a inflamação, medindo variáveis como permeabilidade e resistência endotelial transetotelial (TEER)27. Além disso, ao funcionalizar micropartículas com anticorpos específicos, a BMFA pode ser usada para estudar a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais27. Foi demonstrado que a resposta inflamatória também poderia ser regulada por outros estímulos na BMFA, como a radiação ionizante, e a BMFA tem sido usada para estudar danos celulares endoteliais induzidos por radiação e interações endoteliais de neutrófilos29. Outra vantagem deste dispositivo é que células endoteliais, neutrófilos e/ou outras células sanguíneas ou partículas portadoras de drogas podem ser isoladas de canais microvasculares e/ou compartimento de tecido para análise posterior. Além disso, células/partículas que não interagiram com as células endoteliais no dispositivo podem ser isoladas do efluente que sai do dispositivo. Pericytes e os tipos de tecidos correspondentes também podem ser cultivados no dispositivo para representar melhor as condições in vivo . Em conclusão, o protocolo aqui apresentado fornece um ambiente fisiologicamente relevante na BMFA para estudar interações leucócito-endotelial durante a inflamação.

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Disclosures

Os autores não declaram conflito de interesses.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Número de Subvenção: GM114359 e GM134701 (M.F.K. e L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), e Agência de Redução de Ameaças de Defesa, Número de Subvenção: HDTRA11910012 (M.F.K. e L.E.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe Fisher Scientific 14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA) SynVivo SMN1-C001 Exclusive at SynVivo
Blunt needle Jensen Global JG24-0.5
Calcium Chloride Fisher Scientific C70-500
CFDA, SE ThermoFisher C1157
Dextran, 250,000, Powder Spectrum Chemical Mfg. Corp DE-130
Ficoll-Paque Premium GE Health Care 17-5442-02 Leukocyte isolation media
fMLP Sigma-Aldrich F3506
Hepes Fisher Scientific AAJ1692630
Human fibronectin Fisher Scientific 33-016-015 use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza cc-3202 Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells Lonza cc-2527 use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride Fisher Scientific BP214-500
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments Inc. Microscope
NIS-elements, 5.20.01 Nikon Instruments Inc. Imaging software
PBS Fisher Scientific MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3007 Syringe Pump
Potassium Hydroxide Fisher Scientific 02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha R&D Systems 210-TA
Slide clamp SynVivo
Sodium Chloride Fisher Scientific S640-500
Synvivo Pneumatic Primer SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) Lonza cc-5034
Tygon tubing Fisher Scientific 50-206-8921 Tubing

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References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  2. Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
  3. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
  4. Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
  5. Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
  6. Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
  7. Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
  8. Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
  9. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  10. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
  11. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  12. Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
  13. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
  14. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  15. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
  16. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
  17. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
  18. Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
  19. Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
  20. Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
  21. Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  22. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
  23. Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
  24. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
  25. Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
  26. Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
  27. Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
  28. Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
  29. Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
  30. Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
  31. Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  32. Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
  33. Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
  34. Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
  35. Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
  36. Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
  37. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).

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