Summary
In questo protocollo, un test microfluido biomimetico, in grado di riprodurre un ambiente microvascolare fisiologicamente rilevante e riprodurre l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria, viene impiegato per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale nella malattia infiammatoria.
Abstract
Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo importante nelle malattie infiammatorie come la sepsi. Durante l'infiammazione, l'eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l'endotelio vascolare negli organi chiave può portare a insufficienza d'organo. Un saggio microfluidico biomimetico fisiologicamente rilevante (bMFA) è stato sviluppato e validato utilizzando diverse tecniche sperimentali e computazionali, in grado di riprodurre l'intera cascata di rotolamento/adesione/migrazione leucocitaria per studiare le interazioni leucocitaria-cellula endoteliale. Le reti microvascolari ottenute da immagini in vivo nei roditori sono state digitalizzate utilizzando un approccio Geographic Information System (GIS) e microfabbricate con polidimetilsilossano (PDMS) su un vetrino per microscopio. Per studiare l'effetto della velocità di taglio e della topologia vascolare sulle interazioni leucocita-cellula endoteliale, è stato sviluppato un modello di fluidodinamica computazionale (CFD) per generare una mappa corrispondente delle velocità e delle velocità di taglio in tutta la rete. Il bMFA consente la quantificazione delle interazioni leucociti-cellule endoteliali, tra cui la velocità di rotolamento, il numero di leucociti aderenti in risposta a diverse velocità di taglio, il numero di leucociti migrati, la permeabilità delle cellule endoteliali, l'espressione della molecola di adesione e altre variabili importanti. Inoltre, utilizzando campioni correlati all'uomo, come cellule endoteliali umane e leucociti, bMFA fornisce uno strumento per lo screening rapido di potenziali terapie per aumentare la loro traducibilità clinica.
Introduction
L'infiammazione è la risposta dell'ospite a infezioni e lesioni e l'endotelio svolge un ruolo importante nella risposta infiammatoria 1,2,3. La disregolazione infiammatoria è la causa alla base di una serie di patologie come sepsi, malattie cardiovascolari, asma, malattie infiammatorie intestinali, cancro e COVID-19. Le interazioni leucocita-cellula endoteliale svolgono un ruolo centrale in queste malattie infiammatorie. Durante l'infiammazione, il rilascio di PAMPS (pathogen-associated molecular patterns) da patogeni o DAMPS (pattern molecolari associati al danno) da tessuti danneggiati attiva le cellule immunitarie per rilasciare citochine/chemochine e altri mediatori proinfiammatori che portano all'attivazione dell'endotelio, con conseguenti alterazioni della funzione di barriera dell'endotelio vascolare e aumento della permeabilità 3,4 . L'aumento dell'attivazione delle cellule endoteliali durante l'infiammazione si traduce in una maggiore interazione leucocita-cellula endoteliale che porta a un'eccessiva migrazione dei leucociti attivati attraverso l'endotelio vascolare negli organi chiave 1,5,6,7.
Il reclutamento dei leucociti è iniziato da chemioattrattivi chimicamente diversi composti da lipidi bioattivi, citochine, chemochine e componenti del complemento 8,9. Il reclutamento dei leucociti è un processo in più fasi che comprende cinque fasi discrete: 1) marginazione e cattura/attaccamento dei leucociti, 2) rotolamento, 3) arresto fermo, 4) diffusione e strisciamento e 5) stravaso/migrazione (Figura 1). Ogni fase di questo processo richiede una diafonia tra leucociti e cellule endoteliali per orchestrare questo fenomeno dinamico 1,9. In definitiva, i leucociti arrestati si estfusionano ai tessuti infiammati attraverso l'endotelio attraverso un processo a più fasi controllato da segnali chemioattratturanti-dipendenti concorrenti, eventi adesivi e forze di taglio emodinamiche 1,9,10,11,12.
Dato il ruolo centrale dello stress da taglio nella regolazione della funzione delle cellule endoteliali e il significato delle interazioni leucocita-cellule endotelio13, negli ultimi decenni sono stati sviluppati diversi modelli in vitro per studiare vari aspetti della cascata di migrazione dei leucociti in un ambiente più controllato14. I dispositivi fluidici tradizionali per studiare le interazioni leucocita-cellula endoteliale possono essere classificati in due grandi categorie14: a) dispositivi per lo studio del rotolamento dei leucociti, dell'adesione e dell'espressione delle molecole di adesione come le camere di flusso a piastre parallele e b) dispositivi per lo studio della migrazione dei leucociti in condizioni statiche come le camere transwell. Sistemi come le camere di flusso a piastre parallele sono stati utilizzati per studiare i ruoli delle molecole di adesione e dei loro ligandi nella cascata di adesione sotto le forze di taglio15. Tuttavia, uno svantaggio significativo è che questi dispositivi semplicistici e idealizzati (ad esempio, canale dritto) non sono in grado di riprodurre la scala e la geometria della microvascolarizzazione in vivo (ad esempio, biforcazioni vascolari successive, morfologia vascolare) e le condizioni di flusso risultanti (ad esempio, flussi convergenti o divergenti a biforcazioni). Di conseguenza, questi dispositivi possono solo modellare l'adesione ma non la trasmigrazione. Le camere Transwell possono studiare la trasmigrazione solo in condizioni statiche senza considerare le caratteristiche geometriche in vivo e le condizioni di flusso. Pertanto, questi modelli tradizionali non imitano il microambiente dei tessuti viventi o risolvono l'adesione e la migrazione a cascata in un singolo saggio6.
Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato e ampiamente convalidato un nuovo saggio microfluidico biomimetico 3D (bMFA) (Figura 2), che riproduce realisticamente reti microvascolari in vivo su un chip 16,17,18. Il protocollo per la microfabbricazione di questo dispositivo è stato pubblicato in precedenza17 ed è solo brevemente descritto qui. La microvascolarizzazione del muscolo cremaster del topo è stata digitalizzata utilizzando un approccio GIS (Geographic Information System) modificato19. Quindi, la rete microvascolare sintetica è stata generata sul polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando processi di litografia morbida basati sulla rete microvascolare digitalizzata 14,17,20,21,22. In breve, le immagini di rete digitalizzate sono state stampate su pellicola Mylar, che è stata poi utilizzata come maschera per modellare un fotoresist positivo SU-8 sopra un wafer di silicio per creare i master per la fabbricazione. I pilastri microfabbricati (diametro 10 μm, 3 μm di altezza) sono stati utilizzati per creare i pori alti 3 μm e larghi 100 μm, una dimensione ottimale per la migrazione dei leucociti 23,24,25, collegando i canali vascolari e i compartimenti tissutali. PDMS è stato preparato secondo le istruzioni del produttore e versato sui master sviluppati. Inoltre, il PDMS è stato degassato e lasciato polimerizzare durante la notte in un forno (65 ° C) per creare microcanali complementari in PDMS. Successivamente, il PDMS polimerizzato è stato staccato dal master SU-8, seguito da porte di punzonatura per ingressi / uscite. Quindi, il PMDS è stato plasmato legato a un vetrino. La superficie del dispositivo microfluidico comprende vetro nativo e PDMS. Al fine di promuovere l'attaccamento, la diffusione e la proliferazione cellulare, è necessario il rivestimento a matrice extracellulare (ECM). Il bMFA comprende una rete microvascolare e un compartimento tissutale collegato tramite pori alti 3 μm e larghi 100 μm (Figura 2). Questo sistema microfluidico riproduce l'intera cascata di adesione/migrazione leucocitaria in un ambiente 3D fisiologicamente rilevante di una rete microvascolare completa con vasi interconnessi e biforcazioni, tra cui circolazione, marginazione, rotolamento, adesione e migrazione dei leucociti nel compartimento tissutale extra-vascolare in un unico sistema 14,16,17,21,26.
Va notato che anche quando la portata all'ingresso di bMFA è fissa, le condizioni di flusso nella rete variano in posizioni diverse e non possono essere calcolate con una semplice formula matematica. È stato sviluppato un modello basato sulla fluidodinamica computazionale (CFD) per calcolare diversi parametri di flusso (ad esempio, sforzo di taglio, velocità di taglio, velocità) in diverse posizioni della rete. Questo modello CFD è stato utilizzato per simulare i modelli di perfusione del colorante e i parametri di flusso nel bMFA. La convalida incrociata con i risultati sperimentali ha suggerito che le resistenze di flusso attraverso la rete sono ben previste dal modello computazionale (Figura 3)17. Questo modello CFD è stato quindi utilizzato per stimare la velocità e il profilo della velocità di taglio in ogni vaso di bMFA (Figura 4), consentendo l'analisi degli effetti del flusso di taglio e della geometria sul rotolamento, l'adesione e la migrazione dei leucociti16. I leucociti aderiscono preferenzialmente in prossimità di biforcazioni e in regioni a basso taglio in vivo, e questi modelli spaziali di adesione leucocitaria sono stati dimostrati con successo in bMFA usando neutrofili (Figura 5)16. Questo documento descrive il protocollo per la preparazione di bMFA per studiare l'interazione leucocita-cellula endoteliale in condizioni infiammatorie utilizzando cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVEC) e neutrofili umani. I sistemi microfisiologici, come il bMFA, possono essere utilizzati per studiare le interazioni delle cellule endoteliali con diversi tipi di cellule come neutrofili, monociti, linfociti e cellule tumorali 18,27,28,29,30. Il bMFA può essere seminato con cellule endoteliali primarie di diversi organi (ad esempio, polmone vs cervello) e diverse specie (ad esempio, cellule endoteliali umane vs murine), nonché linee cellulari endoteliali 21,27,31,32. Il bMFA può essere utilizzato per studiare risposte cellulari multiple, interazioni cellula-cellula, funzione barriera, somministrazione di farmaci e tossicità del farmaco.
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Protocol
Il sangue umano eparinizzato è ottenuto per l'isolamento dei neutrofili da donatori adulti sani (maschi e femmine, di età compresa tra 21 e 60 anni), previo consenso informato approvato dall'Institutional Review Board della Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Adescamento e rivestimento del dispositivo con fibronectina umana
NOTA: il bMFA ha due porte di ingresso e due porte di uscita collegate al compartimento vascolare. Ha anche una porta collegata al compartimento del tessuto (Figura 2).
- Inserire tubi (O.D. di 0,06" e I.D. di 0,02") (Tabella dei materialis) su tutte le porte ad eccezione di una porta di ingresso con pinza a punto fine. Bloccare le due porte di uscita e la porta del compartimento del tessuto con morsetti a mascella. Assicurarsi che ogni tubo sia lungo ~ 1 pollice.
- Diluire la fibronectina umana a 100 μg/mL con PBS da soluzione madre di fibronectina (1 mg/mL). Caricare una siringa da 1 mL con una soluzione di fibronectina preparata. Collegare la siringa a un ago smussato da 24 G e a un tubo lungo ~ 4 pollici.
NOTA: Per prevenire la reticolazione, non sovrastare/pipettare la fibronectina umana. Altre matrici extracellulari (ECM) come il collagene possono essere utilizzate per diversi tipi di cellule. - Inserire il tubo nella porta di ingresso aperta, spingere lo stantuffo fino a quando la fibronectina umana non esce dall'altra porta di ingresso, quindi bloccarlo. Ripetere questo processo per il resto delle porte fino a quando tutti i canali, il compartimento tissutale e il tubo sono riempiti con la soluzione di fibronectina umana. Rimuovere l'ago ma mantenere il tubo lungo 4 pollici inserito e sbloccato.
NOTA: Assicurarsi che il tubo sia riempito con fibronectina prima che venga bloccato. - Per il degasaggio, collegare il tubo non clamoroso a un serbatoio di azoto compresso attraverso il primer pneumatico, regolare la pressione a ~ 5 psi e funzionare per ~ 15 minuti.
- Dopo 15 minuti, controllare al microscopio per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate nel dispositivo. Se ci sono bolle d'aria intrappolate nel canale o nel compartimento tissutale, ricollegare il dispositivo al primer pneumatico per il degassamento di nuovo, cioè ripetere il passaggio 1.4.
NOTA: Il microscopio invertito viene utilizzato in tutte le fasi che coinvolgono la microscopia in questo protocollo. - Rimuovere il dispositivo dal primer pneumatico. Incubare il dispositivo a 37 °C per 1 ora, quindi lavare tutti i canali e il compartimento tissutale con terreni di coltura HLMVEC (Table of Materials) preriscaldati, simili al passaggio 1.3. Il bMFA è ora pronto per la semina cellulare.
NOTA: prima di rimuovere/inserire un tubo dalla porta, posizionare una goccia d'acqua con una pipetta attorno alla base del tubo della porta di ingresso per impedire all'aria di entrare nel dispositivo.
2. Semina bMFA con HLMVEC
- Coltura HLMVEC al 60% - 80% di confluenza secondo il protocollo del fornitore in un pallone T-25.
- Aspirare i terreni di coltura HLMVEC dal pallone di coltura cellulare. Lavare due volte con PBS.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata (37 °C) nel matraccio T-25. Incubare per 3-5 minuti in un incubatore (37 °C, 5% CO2) fino a quando la maggior parte delle cellule non si stacca dal pallone.
NOTA: Il tempo di incubazione può variare per diversi tipi di cellule e la concentrazione di tripsina-EDTA. - Aggiungere 2 mL di soluzione di neutralizzazione della tripsina (TNS, 37 °C) al matraccio per neutralizzare la tripsina-EDTA.
- Picchiettare delicatamente il pallone per aiutare a dissociare le cellule. Quindi, trasferire la soluzione di sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare per 5 min a 150 x g per pellettizzare le cellule endoteliali. Rimuovere le cellule surnatante e risospese in 3 ml di terreno di coltura cellulare. Contare il numero di cellule con un emocitometro.
- Centrifugare nuovamente per 5 minuti a 150 x g per pellettare le celle. Rimuovere il surnatante e risospese le cellule alla densità di semina desiderata di 20 x 106/ml.
NOTA: A seconda dei tipi di cellule e della confluenza, circa 2 x 106 cellule endoteliali possono essere raccolte da due palloni T-25 e, con la densità di semina di 20 x 106 / mL, 100 μL della sospensione cellulare (2 x 106 cellule endoteliali), è sufficiente per seminare 5 dispositivi. - Montare una siringa da 1 mL nella pompa a siringa programmabile, collegare il tubo all'ago smussato.
- Aspirare ~ 20 μL della sospensione cellulare nel tubo, assicurandosi che la sospensione cellulare sia solo nel tubo, non nella canna della siringa.
- Togliere il morsetto da una porta di uscita del dispositivo. Collegare il tubo a un ingresso del dispositivo. Assicurarsi che nel canale non vengano introdotte bolle d'aria.
- Avviare la pompa con una portata di 4-8 μL/min. Osservare il dispositivo al microscopio.
- Quando i canali sono pieni di celle, arrestare la pompa, bloccare l'uscita e tagliare il tubo di ingresso.
NOTA: Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nel dispositivo. - Mettere il dispositivo nell'incubatore per 4 ore al 5% di CO2 e 37 °C.
- Dopo 4 ore di incubazione, preparare un'altra siringa riempita con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa su una pompa a siringa, collegare la siringa alla porta di ingresso e rimuovere il morsetto da una porta di uscita.
- Eseguire fluidi freschi attraverso il dispositivo per circa 5 minuti a 4-8 μL / min per lavare le celle galleggianti / non attaccate.
3. Coltura cellulare sotto flusso per 48 ore
- Preparare una siringa riempita con terreni di coltura cellulare freschi. Montare la siringa in una pompa a siringa, collegare la siringa a una porta di ingresso e tenere aperta un'uscita. Mettere il dispositivo nell'incubatore (5% CO2, 37 °C).
- Programmare la pompa a siringa per la coltura di cellule endoteliali sotto flusso seguendo le seguenti istruzioni menzionate nella Tabella 1.
- Controllare bMFA al microscopio dopo 48 ore di coltura sotto flusso. HLMVEC deve coprire i canali vascolari che formano un lume completo (Figura 6).
NOTA: potrebbero essere necessari altri regimi di flusso per diversi tipi di celle.
4. Citochine e/o trattamento terapeutico
NOTA: Ad esempio, questa sezione descrive l'uso di bMFA per studiare l'impatto del trattamento delle cellule con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e un nuovo inibitore antinfiammatorio (inibitore del peptide delta-TAT della proteina chinasi C, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.
- Preparare tre diversi dispositivi bMFA utilizzando il protocollo precedente (sezione 1-3).
- Caricare tre siringhe da 1 mL con terreni di coltura cellulare (TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM), rispettivamente.
NOTA: Le citochine vengono ricostituite in terreni di coltura cellulare. - Collegare le tre siringhe a tre dispositivi bMFA. Trattare HLMVEC con tampone TNF-α o TNF-α + inibitore per 4 ore a 0,1 μL/min.
NOTA: Sulla base di specifiche esigenze dello studio, altre citochine o cocktail di citochine (ad esempio, TNF-α + Interleuchina 1 beta (IL1-β) + Interferone-gamma (IFN-γ)), possono essere usati per trattare le cellule endoteliali.
5. Isolamento dei neutrofili umani
- Utilizzare tutti i reagenti a temperatura ambiente (RT). I reagenti includono mezzi di isolamento leucocitario, 1x tampone HEPES con Ca2+/Mg2+ (Tabella 2), 6% destro in soluzione salina normale (0,9% NaCl), soluzione di NaCl al 3,6% e acqua deionizzata (DI).
- Pipettare 20 mL di mezzi di isolamento leucocitario in un tubo conico da 50 mL e stratificare accuratamente 25 mL di sangue sul mezzo di isolamento dei leucociti. Centrifuga per 40 min a 427 x g a RT.
NOTA: Eseguire questo passaggio lentamente e con attenzione per evitare di mescolare il mezzo di isolamento del sangue e dei leucociti. - Aspirare fino a ~ 5 mL sopra lo strato di globuli rossi (RBC). Lo strato di buffy bianco sulla parte superiore del RBC è prevalentemente neutrofilo.
- Aggiungere il buffer HEPES per raddoppiare il volume corrente (volume esistente: buffer HEPES = 1:1).
- Aggiungi una quantità di destrano al 6%, che sarà il 20% del volume finale. (volume corrente/4 = volume del 6% di destrano aggiunto).
- Capovolgere delicatamente il tubo un paio di volte per mescolare bene e lasciare sedimentare il RBC (~ 25 min).
- Pipettare con cura lo strato superiore (strato ricco di neutrofili) e trasferirlo in un nuovo tubo da 50 ml, fare attenzione a non contaminare con RBC sedimentati.
- Centrifugare per 10 minuti a 315 x g a RT. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 8 mL di tampone HEPES.
- Per lisare il RBC residuo, aggiungere 24 ml di acqua DI e mescolare delicatamente per 50 s. Aggiungere immediatamente 8 mL di soluzione naCl al 3,6%, mescolare e centrifugare per 10 minuti a 315 x g a RT.
- Rimuovere il surnatante, lavare il pellet cellulare con 15 mL di tampone HEPES e centrifugare per 5 minuti a 315 x g. Sostituire il pellet nel tampone HEPES.
6. Esperimento di adesione e migrazione dei neutrofili con bMFA
- Sospendere i neutrofili umani isolati (15 milioni) in 999 μL di tampone HEPES.
- Aggiungere 1 μL di CFDA-SE (carbossifluoresceina diacetato succinimidyl estere) soluzione madre colorante (10 mM) alla sospensione di neutrofili per ottenere una concentrazione di lavoro di 10 μM CFDA-SE e incubare per 10 min a RT. Lavare le cellule due volte con tampone HEPES centrifugando per 5 min a 315 x g.
- Contare i neutrofili usando un emocitometro e risospendere a 2 milioni di neutrofili/mL con terreni di coltura cellulare, TNF-α (10 ng/mL) e TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM), rispettivamente; incubare per 15 minuti a RT prima dell'inizio dell'esperimento.
- Preparare una siringa riempita con 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), il chemioattrattivo per lo studio, in terreni di coltura cellulare. Prendi bMFA e apri una porta di ingresso e una porta di uscita.
NOTA: Queste condizioni sperimentali sono utilizzate per imitare le condizioni di sepsi che includono una risposta infiammatoria sistemica con alti livelli di citochine / chemochine circolanti. Inoltre, fMLP, un peptide derivato da batteri Gram-negativi, viene utilizzato per modellare la presenza di batteri nel polmone (cioè il compartimento tissutale). - Rimuovere il tubo della porta del compartimento in tessuto e inserire il tubo fMLP. Iniettare ~ 20 μL di fMLP nel compartimento tissutale per tutti i bMFA, ad eccezione di quello trattato con i soli terreni di coltura cellulare. Quindi tagliare il tubo e bloccarlo.
- Riempire la siringa con ~200 μL della sospensione per neutrofili e montare la siringa sulla pompa della siringa.
- Posizionare il dispositivo sullo stadio del microscopio invertito (Tabella dei materiali).
- Avviare la pompa a una portata di 1 μL/min e attendere che una piccola goccia della sospensione dei neutrofili esca dal tubo. Inserire il tubo nella porta di ingresso. Vedere la Figura 7 per l'installazione.
7. Acquisisci immagini
- Utilizzare la funzione Scan Large Image nel software di analisi delle immagini al microscopio (Table of Materials) per ottenere la mappa di adesione in bMFA (Figura 8) 10 minuti dopo l'inizio dell'esperimento. La maggior parte dei neutrofili entra in bMFA durante i primi 10 minuti.
NOTA: tenere spenta la luce di fluorescenza quando non si scattano immagini per ridurre il fotosbiancamento. - Durante l'ora successiva, scatta immagini timelapse (1 immagine ogni 5 minuti) del compartimento tissutale (Figura 8B, C) per l'analisi della migrazione per ottenere la mappa di migrazione.
8. Analisi delle immagini digitali
- Per la mappa di adesione, contare il numero di neutrofili aderenti in ogni vaso. Per ogni biforcazione, creare una regione circolare di interesse (ROI) con un diametro pari a due volte il diametro del vaso e contare il numero di neutrofili aderenti.
- Utilizzare il conteggio manuale o la funzione automatica Object Count per quantificare il numero di neutrofili aderenti in ogni vaso e regione di biforcazione.
- Utilizzare la mappa della velocità di taglio della rete generata utilizzando la simulazione CFD17 per determinare la velocità di taglio in ciascuna nave. Quindi tracciare il numero di neutrofili aderenti in un dato vaso rispetto alla velocità di taglio in quella nave per creare una mappa della velocità di taglio in bMFA come mostrato nella Figura 9A.
- I neutrofili sono contati come migrati se hanno attraversato l'endotelio nel compartimento tissutale. Contare il numero di neutrofili migrati a 10 min, 15 min, 30 min e 60 min. Tracciare il numero di neutrofili migrati rispetto al tempo come mostrato nella Figura 9B.
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Representative Results
Dopo 48 ore di coltura sotto flusso di taglio in bMFA, le cellule endoteliali coprivano la superficie dei canali vascolari in bMFA e si allineavano nella direzione del flusso (Figura 6). La microscopia confocale ha indicato che tutte le superfici dei canali vascolari erano coperte da cellule endoteliali, formando un lume 3D completo in bMFA18.
Utilizzando questo protocollo, è possibile acquisire una mappa di adesione dei neutrofili, che mostra che esiste un'adesione significativa dei neutrofili alla cellula endoteliale in bMFA (Figura 8). Correlando la distribuzione spaziale dei neutrofili in questa mappa di adesione con la mappa della velocità di taglio generata dal modello CFD, l'adesione dei neutrofili è dipendente dal taglio e i neutrofili aderiscono preferenzialmente in regioni a bassa velocità di taglio e biforcazione (Figura 9A). L'adesione dei neutrofili alle cellule endoteliali attivate dal TNF-α è aumentata in modo significativo. L'analisi delle immagini timelapse ha indicato che l'attivazione del TNF-α delle cellule endoteliali aumenta la migrazione dei neutrofili in risposta al chemioattrattante fMLP (Figura 9B). Come detto sopra, bMFA può essere utilizzato per testare rapidamente l'efficacia di una nuova terapia per il trattamento della malattia infiammatoria. Ad esempio, il trattamento delle cellule endoteliali e dei neutrofili con PKCδ-i ha ridotto significativamente l'adesione e la migrazione dei neutrofili (Figura 9A,B)27.
Figura 1: Attivazione delle cellule endoteliali durante l'infiammazione. (A) In condizioni normali, l'endotelio vascolare è coperto dal glicocalice e forma una barriera stretta che regola la permeabilità della barriera, la migrazione dei leucociti e le difese antinfiammatorie. (B) Durante l'infiammazione, i leucociti e le cellule endoteliali vengono attivati da PAMPS e DAMPS per produrre citochine e chemioattrattivi, portando all'elevata espressione di molecole di superficie sia sui leucociti che sulle cellule endoteliali, migliorando le interazioni leucocita-endoteliale. Le interazioni di E/P-selectina sulle cellule endoteliali e sui loro ligandi (ad esempio, PSGL-1) sui leucociti sono coinvolte nel rotolamento, che rallenta il neutrofilo. L'adesione ferma è regolata da molecole di adesione espresse dall'endotelio, tra cui ICAM-1, ICAM-2 e VCAM-1, e dai loro ligandi, le integrine β2. In risposta ai gradienti chemioattrattari, i leucociti aderenti migrano attraverso giunzioni endoteliali regolate da PECAM-1 e BIM. I leucociti attivati migrano verso i tessuti, dove rilasciano citochine, specie reattive di ossigeno / azoto e proteasi per combattere le infezioni. Tuttavia, la migrazione disregolata dei leucociti può danneggiare il tessuto degli organi, con conseguente insufficienza d'organo. Durante l'infiammazione, il glicocalice viene degradato, le giunzioni strette delle cellule endoteliali sono danneggiate e vi è un aumento dell'apoptosi delle cellule endoteliali, portando a una funzione di barriera danneggiata e ad una maggiore permeabilità. Questa cifra è stata modificata da Yang et al.2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica del bMFA. (A) Le immagini del muscolo cremaster del topo sono ottenute e (B) digitalizzate utilizzando il sistema GIS per fabbricare la rete su PDMS. (C) L'immagine in campo luminoso della rete bMFA mostra che in bMFA i canali vascolari sono collegati al compartimento tissutale attraverso una barriera di 3 μm (l'inserto schematico nel pannello C). È indicata la direzione del flusso dei canali vascolari. (D) Un chip bMFA, costituito da uno strato PDMS legato a un vetrino per microscopio, è allo stadio del microscopio. Il tubo è inserito in due porte di ingresso, due porte di uscita e una porta del compartimento tissue. (C: barra della scala = 500 μm) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Studi di perfusione transitoria che confrontano i risultati sperimentali e di simulazione in bMFA. (A) La rete di bMFA che mostra la direzione di ingresso, uscita e flusso. (B) Pannello superiore: profili di perfusione CFD. Pannello inferiore: Profili di perfusione sperimentali. Le immagini sono pseudo-colorate per mostrare sfumature. La scala è normalizzata con blu (nessuna perfusione; 0) e magenta (perfusione completa; 1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Profilo delle velocità e delle velocità di taglio in bMFA dalle simulazioni CFD. (A) Distribuzione delle grandezze di velocità (Vmag) attraverso la rete. (B) La distribuzione della velocità di taglio indica velocità di taglio eterogenee nella rete. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I modelli di adesione dei neutrofili in bMFA sono simili ai modelli di adesione dei neutrofili in vivo. Le distribuzioni del numero di neutrofili aderenti in vivo e del numero di neutrofili in bMFA sono entrambe inclinate a sinistra, indicando che i neutrofili aderiscono preferenzialmente vicino alle biforcazioni con il picco che si verifica in un vaso o diametro del canale dalla biforcazione più vicina (media ± SEM; N = 3). La distanza dei neutrofili aderenti alla biforcazione più vicina è stata normalizzata da quanto segue: distanza normalizzata = distanza dal centro della biforcazione/ diametro più vicina del canale. Questa cifra è stata modificata da Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, ulteriori autorizzazioni relative al materiale estratto dovrebbero essere indirizzate all'American Chemical Society). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Le cellule endoteliali formano un lume 3D completo nel bMFA. (A) Le immagini a contrasto di fase mostrano che le cellule endoteliali sono allineate nella direzione del flusso. (B) Le immagini di fluorescenza mostrano che le cellule endoteliali coprono il canale vascolare; La F-actina è etichettata come verde usando la falloidina e i nuclei sono etichettati come rossi usando Draq5. (A: barra di scala = 100 μm, B: barra di scala = 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Un microscopio a fluorescenza invertita controllato da computer viene utilizzato per studiare le interazioni neutrofilo-endoteliale in bMFA. Uno stadio controllato da computer con uno scaldino viene utilizzato per mantenere il bMFA a 37 °C. Il bMFA è collegato a una pompa a siringa programmabile attraverso il tubo. Il microscopio a fluorescenza invertita è dotato di una videocamera per scattare immagini / video per ulteriori analisi offline sul computer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini rappresentative dell'adesione dei neutrofili e della mappa di migrazione. (A) Mappa dell'adesione dei neutrofili in bMFA. L'immagine è stata scattata 10 minuti dopo l'inizio dell'esperimento utilizzando la funzione "Scan large map" del software Nikon. I punti bianchi nella mappa sono neutrofili etichettati in modo fluorescente con CFDA-SE. Il limite del canale vascolare è etichettato digitalmente (barra di scala = 100 μm). (B) Mappa della migrazione dei neutrofili in bMFA senza attivazione del TNF-α. L'immagine è stata scattata 60 minuti dopo l'inizio dell'esperimento. (C) Mappa della migrazione dei neutrofili in bMFA con attivazione del TNF-α. L'immagine è stata scattata 60 minuti dopo l'inizio dell'esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Modelli di adesione e migrazione dei neutrofili in bMFA durante l'infiammazione. (A) Il trattamento con TNF-α ha aumentato significativamente l'adesione dei neutrofili umani alle cellule endoteliali microvascolari polmonari umane, che è stata inibita dopo il trattamento con un inibitore PKCδ. L'adesione dei neutrofili si è verificata preferenzialmente in vasi con bassa velocità di taglio e vicino a biforcazioni in bMFA. (B) In risposta alla fMLP, la migrazione dei neutrofili umani attraverso le cellule endoteliali attivate dal TNF-α è aumentata significativamente rispetto alle cellule non trattate. Il trattamento con l'inibitore PKCδ ha ridotto la migrazione a livelli non trattati. n = 4, media ± SEM, ANOVA unidirezionale, ** p < 0,01 e *** p < 0,001). La figura è stata modificata da Soroush et al.27. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passaggio 1: tasso costante | Commenti | |
| Modo | Infondere | |
| Portata | 1 μL/min | |
| Ore | 10 minuti | |
| Passaggio 2: ritardo (nessun flusso) | ||
| Modo | Ritardo | |
| Ore | 4 ore | |
| Passaggio 3: ripetere | Il passaggio 1 e il passaggio 2 verranno ripetuti 6 volte prima di passare al passaggio 4. | |
| Modo | Ripetere | |
| Ripeti da | Fase 1 | |
| Ripetere | 6 volte | |
| Fase 4: Portata costante | ||
| Modo | Infondere | |
| Portata | 0,1 μL/min | |
| Ore | 48 ore |
Tabella 1: Programma della pompa a siringa
| Formula | Nome | MW | Aggiungere | Concentrazione | 10x buffer HEPES (Aggiungere acqua DI a 1000 mL e regolare il pH a 7,3. Diluire a 1x prima dell'uso) |
| NaCl | Cloruro di sodio | 58.44 | 87,66 g | 1,5 M | |
| KOH | Idrossido di potassio | 56.11 | 2,81 g | 50 metri quadrati | |
| Hepes · | Hepes · | 238.3 | 23,83 g | 100 metri | |
| MgCl2 | Cloruro di magnesio | 203.31 | 2,44 g | 12 mM | |
| CaCl2 · | Cloruro di calcio | 147.62 | 1,90 g | 12,9 mM |
Tabella 2: Composizione tampone HEPES.
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Discussion
Il bMFA riproduce la topografia e le condizioni di flusso delle reti microvascolari in vivo e può essere utilizzato per studiare l'interazione leucocita-cellula endoteliale e la funzione endoteliale in vitro in condizioni fisiologicamente realistiche. Nella microvascolarizzazione di topo o uomo, la geometria delle reti microvascolari è auto-simile e frattale, e il numero di Reynolds << 1, indicando che la geometria vascolare non influisce in modo significativo sui modelli di flusso. Pertanto, il bFMA può essere utilizzato per studiare le interazioni leucocita-endoteliali per diverse specie, compresi gli esseri umani, sebbene la microvascolarizzazione del muscolo cremaster di topo sia stata mappata per produrre bMFA.
Il bMFA consente la valutazione in tempo reale delle singole fasi della cascata di migrazione dei neutrofili in un singolo test, tra cui il rotolamento, l'adesione ferma, la diffusione e la migrazione dei neutrofili nel compartimento tissutale. Le cellule umane primarie e i campioni clinicamente rilevanti possono essere utilizzati in bMFA per aumentare la traducibilità e per esaminare rapidamente potenziali terapie. Rispetto ai sistemi fluidici tradizionali come le camere di flusso a piastre parallele, bMFA ha il vantaggio di utilizzare meno del 95% dei reagenti37 grazie alle sue piccole dimensioni dei vasi e al fatto che può studiare l'intera cascata di migrazione dei neutrofili in un unico test. Tuttavia, questa piccola dimensione richiede anche agli utenti di lavorare con un volume molto piccolo di reagenti, che può essere impegnativo e richiede una pratica approfondita. Il problema più comune con questo protocollo è la presenza di bolle d'aria in bMFA, che possono bloccare il canale e alterare i modelli di flusso. Pertanto, è necessario prestare molta attenzione quando si rimuovono o si inseriscono tubi nelle porte e una goccia d'acqua deve essere posizionata alla base del tubo alle porte per impedire all'aria di entrare nel canale ogni volta che il tubo viene rimosso da bMFA.
Oltre all'applicazione di bMFA per lo studio delle interazioni neutrofilo-endoteliale, il bMFA è stato utilizzato anche per studiare l'integrità dell'endotelio durante l'infiammazione misurando variabili come la permeabilità e la resistenza endoteliale transendoteliale (TEER)27. Inoltre, funzionalizzando le microparticelle con anticorpi specifici, bMFA può essere utilizzato per studiare l'espressione di molecole di adesione su cellule endoteliali27. È stato dimostrato che la risposta infiammatoria potrebbe anche essere sovraregolata da altri stimoli nel bMFA, come le radiazioni ionizzanti, e bMFA è stato utilizzato per studiare il danno delle cellule endoteliali indotto dalle radiazioni e le interazioni neutrofilo-endoteliale29. Un altro vantaggio di questo dispositivo è che le cellule endoteliali, i neutrofili e/o altre cellule del sangue o particelle portatrici di farmaci possono essere isolate dai canali microvascolari e/o dal compartimento tissutale per ulteriori analisi. Inoltre, le cellule/particelle che non hanno interagito con le cellule endoteliali del dispositivo possono essere isolate dall'effluente che esce dal dispositivo. I periciti e i corrispondenti tipi di tessuto possono anche essere coltivati nel dispositivo per rappresentare meglio le condizioni in vivo . In conclusione, il protocollo qui presentato fornisce un ambiente fisiologicamente rilevante in bMFA per studiare le interazioni leucocita-cellule endoteliali durante l'infiammazione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 e GM134701 (M.F.K. e L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), e Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. e L.E.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
