Summary
I denne protokol anvendes et biomimetisk mikrofluidassay, som kan reproducere et fysiologisk relevant mikrovaskulært miljø og reproducere hele leukocytadhæsionen / migrationskaskaden, til at studere leukocyt-endotelcelleinteraktioner i inflammatorisk sygdom.
Abstract
Leukocyt-endotelcelleinteraktioner spiller en vigtig rolle i inflammatoriske sygdomme som sepsis. Under betændelse kan overdreven migration af aktiverede leukocytter over det vaskulære endotel til nøgleorganer føre til organsvigt. Et fysiologisk relevant biomimetisk mikrofluidisk assay (bMFA) er blevet udviklet og valideret ved hjælp af flere eksperimentelle og beregningsmæssige teknikker, som kan reproducere hele leukocytvalsnings-/vedhæftnings-/migrationskaskaden for at studere leukocyt-endotelcelleinteraktioner. Mikrovaskulære netværk opnået fra in vivo-billeder hos gnavere blev digitaliseret ved hjælp af en Geografisk Information System (GIS) tilgang og mikrofabrikeret med polydimethylsiloxan (PDMS) på et mikroskop dias. For at studere effekten af forskydningshastighed og vaskulær topologi på leukocyt-endotelcelleinteraktioner blev der udviklet en CFD-model (Computational Fluid Dynamics) for at generere et tilsvarende kort over forskydningshastigheder og hastigheder i hele netværket. BMFA muliggør kvantificering af leukocyt-endotelcelleinteraktioner, herunder rullehastighed, antal klæbede leukocytter som reaktion på forskellige forskydningshastigheder, antal migrerede leukocytter, endotelcellepermeabilitet, adhæsionsmolekyleekspression og andre vigtige variabler. Ved at anvende humanrelaterede prøver, såsom humane endotelceller og leukocytter, giver bMFA desuden et værktøj til hurtig screening af potentielle terapier for at øge deres kliniske oversættelighed.
Introduction
Inflammation er værtsresponset på infektion og skade, og endotelet spiller en vigtig rolle i det inflammatoriske respons 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering er den underliggende årsag til en række sygdomspatologier som sepsis, hjerte-kar-sygdomme, astma, inflammatorisk tarmsygdom, kræft og COVID-19. Leukocyt-endotelcelleinteraktioner spiller en central rolle i disse inflammatoriske sygdomme. Under inflammation aktiverer frigivelsen af PAMPS (patogen-associerede molekylære mønstre) fra patogener eller DAMPS (skadesrelaterede molekylære mønstre) fra skadede væv immunceller til at frigive cytokiner / kemokiner og andre proinflammatoriske mediatorer, der fører til aktivering af endotel, hvilket resulterer i ændringer i vaskulær endotelbarrierefunktion og øget permeabilitet 3,4 . Øget aktivering af endotelceller under inflammation resulterer i forbedret leukocyt-endotelcelleinteraktion, der fører til overdreven migration af aktiverede leukocytter over det vaskulære endotel til nøgleorganer 1,5,6,7.
Rekrutteringen af leukocytter initieres af kemisk forskelligartede kemotiltrækkende stoffer sammensat af bioaktive lipider, cytokiner, kemokiner og komplementkomponenter 8,9. Leukocytrekruttering er en flertrinsproces, der omfatter fem diskrete trin: 1) leukocytmargen og indfangning/fastgørelse, 2) rulning, 3) fast anholdelse, 4) spredning og gennemsøgning og 5) ekstravasation/migration (figur 1). Hvert trin i denne proces kræver krydstale mellem leukocytter og endotelceller for at orkestrere dette dynamiske fænomen 1,9. I sidste ende ekstravaserer arresterede leukocytter til betændte væv på tværs af endotel via en flertrinsproces styret af samtidige kemotiltrækkende signaler, klæbende hændelser og hæmodynamiske forskydningskræfter 1,9,10,11,12.
I betragtning af den centrale rolle, som forskydningsstress spiller i reguleringen af endotelcellefunktionen og betydningen af leukocyt-endotelcelleinteraktionerne13, er der i løbet af de sidste par årtier udviklet flere in vitro-modeller for at studere forskellige aspekter af leukocytmigrationskaskaden i et mere kontrolleret miljø14. Traditionelle fluidiske anordninger til undersøgelse af leukocyt-endotelcelleinteraktioner kan klassificeres i to brede kategorier14: a) anordninger til undersøgelse af leukocytvalsning, vedhæftning og adhæsionsmolekyleekspression såsom parallelle pladestrømningskamre og b) anordninger til undersøgelse af leukocytmigration under statiske forhold såsom transwellkamre. Systemer som parallelle pladestrømningskamre er blevet brugt til at studere adhæsionsmolekylernes og deres liganders roller i vedhæftningskaskaden under forskydningskræfter15. En væsentlig ulempe er imidlertid, at disse forenklede, idealiserede enheder (f.eks. Lige kanal) ikke er i stand til at reproducere skalaen og geometrien af in vivo-mikrovaskulaturen (f.eks. Successive vaskulære bifurkationer, vaskulær morfologi) og de resulterende strømningsbetingelser (f.eks. Konvergerende eller divergerende strømme ved bifurkationer). Som følge heraf kan disse enheder kun modellere vedhæftning, men ikke transmigration. Transwellkamre kan kun studere transmigration under statiske forhold uden at tage hensyn til in vivo geometriske træk og strømningsbetingelser. Således efterligner disse traditionelle modeller ikke mikromiljø af levende væv eller løser vedhæftnings- og migrationskaskade i et enkelt assay6.
For at imødegå denne begrænsning har vi udviklet og omfattende valideret et nyt 3D-biomimetisk mikrofluidisk assay (bMFA) (figur 2), som realistisk gengiver in vivo-mikrovaskulære netværk på en chip 16,17,18. Protokollen til mikrofabrikation af denne enhed er blevet offentliggjort tidligere17 og er kun kort beskrevet her. Mikrovaskulaturen af musens cremastermuskel blev digitaliseret ved hjælp af en modificeret Geografisk Information System (GIS) tilgang19. Derefter blev det syntetiske mikrovaskulære netværk genereret på polydimethylsiloxan (PDMS) ved hjælp af bløde litografiprocesser baseret på det digitaliserede mikrovaskulære netværk 14,17,20,21,22. Kort fortalt blev de digitaliserede netværksbilleder trykt på Mylar-film, som derefter blev brugt som en maske til at mønstre en SU-8 positiv fotoresist oven på en siliciumskive for at skabe mestrene til fremstilling. Mikrofabrikerede søjler (10 μm diameter, 3 μm høje) blev brugt til at skabe de 3 μm høje og 100 μm brede porer, en optimal størrelse til leukocytmigration 23,24,25, der forbinder de vaskulære kanaler og vævsrum. PDMS blev udarbejdet i henhold til producentens anvisninger og hældt over de udviklede mestre. Endvidere blev PDMS afgasset og fik lov til at hærde natten over i en ovn (65 °C) for at skabe komplementære mikrokanaler i PDMS. Efterfølgende blev den hærdede PDMS skrællet fra SU-8 masteren, efterfulgt af stanseporte til indløb/udløb. Derefter blev PMDS plasmabundet til et glasglas. Overfladen af den mikrofluidiske enhed består af indbygget glas og PDMS. For at fremme cellefastgørelse, spredning og spredning kræves ekstracelluar matrix (ECM) belægning. bMFA omfatter et mikrovaskulært netværk og et vævsrum forbundet via 3 μm høje og 100 μm brede porer (figur 2). Dette mikrofluidiske system reproducerer hele leukocytadhæsions-/migrationskaskaden i et fysiologisk relevant 3D-miljø i et komplet mikrovaskulært netværk med sammenkoblede beholdere og bifurkationer, herunder cirkulation, margen, rullning, vedhæftning og migration af leukocytter til det ekstravaskulære vævsrum i et enkelt system 14,16,17,21,26.
Det skal bemærkes, at selv når strømningshastigheden ved bMFA's indløb er fast, varierer strømningsbetingelserne i netværket på forskellige steder og kan ikke beregnes ved hjælp af en simpel matematisk formel. En CFD-baseret model (Computational Fluid Dynamics) blev udviklet til at beregne forskellige flowparametre (f.eks. Forskydningsspænding, forskydningshastighed, hastighed) forskellige steder i netværket. Denne CFD-model blev brugt til at simulere farvestofperfusionsmønstre og flowparametre i bMFA. Krydsvalidering med eksperimentelle resultater antydede, at strømningsmodstandene på tværs af netværket er godt forudsagt af beregningsmodellen (figur 3)17. Denne CFD-model blev derefter brugt til at estimere hastighed og forskydningshastighedsprofil i hver beholder af bMFA (figur 4), hvilket ifølge analysen af virkningerne af forskydningsstrøm og geometri på leukocytvalsning, vedhæftning og migration16. Leukocytter klæber fortrinsvis nær bifurkationer og i områder med lav forskydning in vivo, og disse rumlige mønstre af leukocytadhæsion blev med succes demonstreret i bMFA ved anvendelse af neutrofiler (figur 5)16. Dette papir beskriver protokollen til fremstilling af bMFA til undersøgelse af leukocyt-endotelcelleinteraktion under inflammatoriske tilstande ved anvendelse af humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) og humane neutrofiler. Mikrofysiologiske systemer, såsom bMFA, kan bruges til at studere endotelcelleinteraktioner med forskellige typer celler såsom neutrofiler, monocytter, lymfocytter og tumorceller 18,27,28,29,30. BMFA kan podes med primære endotelceller fra forskellige organer (f.eks. Lunge vs. Hjerne) og forskellige arter (f.eks. Human vs. Murine endotelceller) samt endotelcellelinjer 21,27,31,32. bMFA kan bruges til at studere flere cellulære reaktioner, celle-celleinteraktioner, barrierefunktion, lægemiddellevering og lægemiddeltoksicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hepariniseret humant blod opnås til neutrofil isolering fra raske voksne donorer (mænd og kvinder, i alderen mellem 21 og 60 år) efter informeret samtykke som godkendt af Institutional Review Board of Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Priming og belægning af enheden med humant fibronectin
BEMÆRK: bMFA har to indløbsporte og to udløbsporte forbundet til det vaskulære rum. Den har også en port forbundet til vævsrummet (figur 2).
- Indsæt slanger (O.D. på 0,06" og I.D. på 0,02") (Materialetabels) i alle porte undtagen en indløbsport med finpunktstang. Fastgør de to udløbsporte og vævsrumsporten med kæbeklemmer. Sørg for, at hver slange er ~ 1 tommer lang.
- Fortynd humant fibronectin til 100 μg/ml med PBS fra fibronectin stamopløsning (1 mg/ml). Læg en 1 ml sprøjte med fremstillet fibronectinopløsning. Tilslut sprøjten til en 24 G stump nål og en ~ 4-tommer lang slange.
BEMÆRK: For at forhindre tværbinding må du ikke overblandet/pipette humant fibronectin. Andre ekstracellulære matricer (ECM) såsom kollagen kan anvendes til forskellige celletyper. - Indsæt slangen i den åbne indløbsport, skub stemplet, indtil humant fibronectin kommer ud af den anden indløbsport, og fastgør det derefter. Gentag denne proces for resten af portene, indtil alle kanaler, vævsrum og slanger er fyldt med den humane fibronectinopløsning. Fjern nålen, men hold den 4-tommer lange slange indsat og afslampet.
BEMÆRK: Sørg for, at slangen er fyldt med fibronectin, før den er fastspændt. - Til afgasning skal du tilslutte den ubesatte slange til en komprimeret nitrogentank gennem den pneumatiske primer, justere trykket til ~ 5 psi og køre i ~ 15 minutter.
- Efter 15 minutter skal du kontrollere under mikroskopet for at sikre, at der ikke er nogen luftbobler fanget i enheden. Hvis der er luftbobler fanget i kanalen eller vævsrummet, skal du tilslutte enheden igen til den pneumatiske primer til afgasning igen, dvs. gentag trin 1.4.
BEMÆRK: Omvendt mikroskop bruges i alle de trin, der involverer mikroskopi i denne protokol. - Fjern enheden fra den pneumatiske primer. Inkubere enheden ved 37 °C i 1 time, og skyl derefter alle kanaler og vævsrum med forvarmede HLMVEC-kulturmedier (Table of Materials), svarende til trin 1.3. bMFA er nu klar til cellesåning.
BEMÆRK: Før du fjerner/indsætter en slange fra porten, skal du først placere en dråbe vand med en pipette omkring bunden af indløbsportrøret for at forhindre luft i at komme ind i enheden.
2. Såning af bMFA med HLMVEC
- Kultur HLMVEC til 60% - 80% sammenløb i henhold til leverandørens protokol i en T-25 kolbe.
- Aspirerende HLMVEC-kulturmedier fra cellekulturkolbe. Vask to gange med PBS.
- Der tilsættes 2 ml forvarmet trypsin-EDTA-opløsning (37 °C) i T-25-kolben. Inkuber i 3-5 minutter i en inkubator (37 °C, 5 % CO2), indtil de fleste celler er løsrevet fra kolben.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere for forskellige celletyper og trypsin-EDTA-koncentration. - Der tilsættes 2 ml Trypsinneutraliseringsopløsning (TNS, 37 °C) til kolben for at neutralisere trypsin-EDTA.
- Tryk forsigtigt på kolben for at hjælpe med at adskille cellerne. Overfør derefter cellesuspensionsopløsningen til et 15 ml konisk rør.
- Centrifuge i 5 minutter ved 150 x g for at pelletere endotelcellerne. Fjern supernatant- og resuspendcellerne i 3 ml cellekulturmedier. Tæl antallet af celler med et hæmocytometer.
- Centrifugering igen i 5 minutter ved 150 x g for at pelletere cellerne. Fjern supernatanten, og resuspend cellerne til den ønskede såtæthed på 20 x 106/ml.
BEMÆRK: Afhængigt af celletyper og sammenløb kan ca. 2 x 106 endotelceller opsamles fra to T-25-kolber, og med en såtæthed på 20 x 106/ml er 100 μL af cellesuspensionen (2 x 106 endotelceller) tilstrækkelig til at frø 5 enheder. - Monter en 1 ml sprøjte i den programmerbare sprøjtepumpe, fastgør slangen til den stumpe nål.
- Træk ~ 20 μL af cellesuspensionen ind i slangen, og sørg for, at cellesuspensionen kun er i slangen, ikke i sprøjtetønden.
- Tag klemmen af en udløbsport på enheden. Tilslut slangen til et indløb af enheden. Sørg for, at der ikke indføres luftbobler i kanalen.
- Start pumpen med en strømningshastighed på 4-8 μL/min. Overhold enheden under et mikroskop.
- Når kanalerne er fyldt med celler, skal du stoppe pumpen, klemme udløbet og skære indløbsslangen.
BEMÆRK: Pas på ikke at indføre luftbobler i enheden. - Sæt enheden i inkubatoren i 4 timer ved 5% CO2 og 37 °C.
- Efter 4 timers inkubation skal du forberede en anden sprøjte fyldt med friske cellekulturmedier. Monter sprøjten på en sprøjtepumpe, tilslut sprøjten til indløbsporten, og fjern klemmen fra en udløbsport.
- Kør friske medier gennem enheden i ca. 5 minutter ved 4-8 μL/min for at vaske flydende/ikke-fastgjorte celler ud.
3. Cellekultur under flow i 48 timer
- Forbered en sprøjte fyldt med friske cellekulturmedier. Monter sprøjten i en sprøjtepumpe, tilslut sprøjten til en indløbsport, og hold et udløb åbent. Sæt enheden i inkubatoren (5% CO2, 37 °C).
- Sprøjtepumpen programmeres til dyrkning af endotelceller under strømning ved hjælp af følgende instruktioner, der er nævnt i tabel 1.
- Kontroller bMFA under et mikroskop efter 48 timers kultur under flow. HLMVEC bør dække vaskulære kanaler, der danner et komplet lumen (figur 6).
BEMÆRK: Andre flowregimer kan være nødvendige for forskellige celletyper.
4. Cytokin og/eller terapeutisk behandling
BEMÆRK: Som et eksempel beskriver dette afsnit brugen af bMFA til at studere virkningen af behandling af cellerne med tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) og en ny antiinflammatorisk hæmmer (Protein Kinase C delta-TAT peptidhæmmer, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.
- Forbered tre forskellige bMFA-enheder ved hjælp af protokollen ovenfor (afsnit 1-3).
- Læg tre 1 ml sprøjter med cellekulturmedier ( TNF-α) (10 ng / ml), TNF-α (10 ng / ml) + PKCδ-i (5 μM), henholdsvis.
BEMÆRK: Cytokiner rekonstitueres i cellekulturmedier. - Tilslut de tre sprøjter til tre bMFA-enheder. HLMVEC behandles med buffer TNF-α eller TNF-α + hæmmer i 4 timer ved 0,1 μL/min.
BEMÆRK: Baseret på specifikke undersøgelseskrav kan andre cytokiner eller cytokincocktails (f.eks. TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)) anvendes til behandling af endotelceller.
5. Human neutrofil isolering
- Brug alle reagenser ved stuetemperatur (RT). Reagenser omfatter leukocytisoleringsmedier, 1x HEPES-buffer med Ca2+/Mg2+ (tabel 2), 6% Dextran i normalt saltvand (0,9% NaCl), 3,6% NaCl-opløsning og deioniseret vand (DI) vand.
- Pipette 20 ml leukocytisoleringsmedier i et 50 ml konisk rør og lag forsigtigt 25 ml blod over leukocytisoleringsmediet. Centrifuge i 40 min ved 427 x g ved RT.
BEMÆRK: Udfør dette trin langsomt og omhyggeligt for at undgå at blande blod- og leukocytisoleringsmedierne. - Aspirer ned til ~ 5 ml over røde blodlegemer (RBC) lag. Det hvide buffylag oven på RBC er overvejende neutrofiler.
- Tilføj HEPES-buffer for at fordoble den aktuelle lydstyrke (eksisterende volumen: HEPES-buffer = 1:1).
- Tilføj et beløb på 6% Dextran, hvilket vil være 20% af det endelige volumen. (nuværende volumen/4 = volumen på tilføjet 6% Dextran).
- Vend røret forsigtigt et par gange for at blande godt og lad RBC sedimentet (~ 25 minutter).
- Pipetter forsigtigt det øverste lag (neutrofilrigt lag) og overføres til et nyt 50 ml rør, pas på ikke at forurene med sedimenteret RBC.
- Centrifuge i 10 minutter ved 315 x g ved RT. Fjern supernatanten, og ophæben igen pelleten i 8 ml HEPES-buffer.
- For at lyse den resterende RBC tilsættes 24 ml DI-vand og blandes forsigtigt i 50 s. Tilsæt straks 8 ml 3,6% NaCl-opløsning, bland og centrifuger i 10 minutter ved 315 x g ved RT.
- Fjern supernatanten, vask cellepillen med 15 ml HEPES-buffer og centrifuge i 5 minutter ved 315 x g. Genophænp pillen i HEPES-buffer.
6. Neutrofiladhæsions- og migrationseksperiment med bMFA
- Resuspend de isolerede humane neutrofiler (15 millioner) i 999 μL HEPES-buffer.
- Der tilsættes 1 μL CFDA-SE (carboxyfluoresceindiacetate succinimidylester) farvestofopløsning (10 mM) til neutrofilsuspension for at opnå en arbejdskoncentration på 10 μM CFDA-SE og inkuberes i 10 minutter ved RT. Vask cellerne to gange med HEPES-buffer ved centrifugering i 5 minutter ved 315 x g.
- Neutrofilerne tælles ved hjælp af et hæmocytometer og resuspend ved 2 millioner neutrofiler/ml med cellekulturmedier, henholdsvis TNF-α (10 ng/ml) og TNF-α (10 ng/ml) +PKCδ-i (5 μM) inkubere i 15 minutter ved RT inden forsøgets start.
- Forbered en sprøjte fyldt med 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), kemotiltrækkemidlet til undersøgelsen, i cellekulturmedier. Tag bMFA og åbn en indløbsport og en udløbsport.
BEMÆRK: Disse eksperimentelle tilstande bruges til at efterligne betingelserne for sepsis, der inkluderer et systemisk inflammatorisk respons med høje niveauer af cirkulerende cytokin / kemokiner. Desuden anvendes fMLP, et gramnegativt bakterieafledt peptid, til at modellere tilstedeværelsen af bakterier i lungen (dvs. vævsrummet). - Fjern vævsrummets portrør, og indsæt fMLP-slangen. Injicer ~ 20 μL fMLP i vævsrummet for al bMFA, undtagen den, der behandles med cellekulturmedier alene. Skær derefter slangen og fastgør den.
- Fyld sprøjten med ~200 μL neutrofilsuspensionen, og monter sprøjten på sprøjtepumpen.
- Sæt enheden på det omvendte mikroskoptrin (Table of Materials).
- Start pumpen med en strømningshastighed på 1 μL/min, og vent, indtil en lille dråbe neutrofilsuspension kommer ud af slangen. Indsæt slangen i indløbsporten. Se figur 7 for opsætningen.
7. Erhverv billeder
- Brug funktionen Scan Large Image i mikroskopets billedanalysesoftware (Table of Materials) til at få vedhæftningskortet i bMFA (figur 8) 10 minutter efter påbegyndelse af eksperimentet. De fleste neutrofiler kommer ind i bMFA i løbet af de første 10 minutter.
BEMÆRK: Hold fluorescenslyset slukket, når du ikke tager billeder for at reducere fotoblegning. - I løbet af den næste time skal du tage timelapse-billeder (1 billede hvert 5. minut) af vævsrummet (figur 8B,C) til migrationsanalyse for at få migrationskortet.
8. Analyse af digitalt billede
- For vedhæftningskortet skal du tælle antallet af klæbede neutrofiler i hver beholder. For hver bifurcation skal du oprette et cirkulært område af interesse (ROI) med en diameter svarende til to gange beholderdiameteren og tælle antallet af klæbede neutrofiler.
- Brug manuel optælling eller den automatiserede objekttællingsfunktion til at kvantificere antallet af klæbende neutrofiler i hvert fartøj og bifurcationsområde.
- Brug forskydningshastighedskortet over det netværk, der genereres ved hjælp afCFD-simulering 17 , til at bestemme forskydningshastigheden i hvert fartøj. Plot derefter antallet af klæbede neutrofiler i et givet fartøj mod forskydningshastigheden i det pågældende fartøj for at oprette et forskydningshastighedskort i bMFA som vist i figur 9A.
- Neutrofiler tælles som migrerede, hvis de har krydset endotelet ind i vævsrummet. Tæl antallet af migrerede neutrofiler på 10 min, 15 min, 30 min og 60 min. Plot antallet af migrerede neutrofiler versus tid som vist i figur 9B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 48 timers dyrkning under forskydningsstrøm i bMFA dækkede endotelceller overfladen af de vaskulære kanaler i bMFA og justerede i strømningsretningen (figur 6). Konfokal mikroskopi viste, at alle overflader af de vaskulære kanaler var dækket af endotelceller, der dannede et komplet 3D-lumen i bMFA18.
Ved hjælp af denne protokol kan der opnås et neutrofiladhæsionskort, der viser, at der er signifikant vedhæftning af neutrofiler til endotelcelle i bMFA (figur 8). Korrelering af den rumlige fordeling af neutrofiler i dette vedhæftningskort med forskydningshastighedskortet genereret fra CFD-modellen viser, at neutrofiladhæsion er forskydningsafhængig, og neutrofiler klæber fortrinsvis i områder med lav forskydningshastighed og bifurcation (figur 9A). Vedhæftningen af neutrofiler til TNF-α-aktiverede endotelceller steg signifikant. Analyse af timelapse-billeder viste, at TNF-α aktivering af endotelceller øger neutrofil migration som reaktion på kemotiltrækkende fMLP (figur 9B). Som nævnt ovenfor kan bMFA bruges til hurtigt at teste effekten af en ny terapeutisk til behandling af inflammatorisk sygdom. For eksempel reducerede behandling af endotelceller og neutrofiler med PKCδ-i signifikant neutrofiladhæsion og migration (figur 9A, B) 27.
Figur 1: Endotelcelleaktivering under inflammation. (A) Under normale forhold er det vaskulære endotel dækket af glycocalyxen og danner en tæt barriere, der regulerer barrierepermeabilitet, leukocytmigration og antiinflammatorisk forsvar. (B) Under inflammation aktiveres leukocytter og endotelceller af PAMPS og DAMPS for at producere cytokiner og kemoattractanter, hvilket fører til forhøjet ekspression af overflademolekyler på både leukocytter og endotelceller, hvilket forbedrer leukocyt-endotelinteraktioner. Interaktioner af E / P-selectin på endotelceller og deres ligander (f.eks. PSGL-1) på leukocytter er involveret i rulning, hvilket bremser neutrofilen. Fast vedhæftning reguleres af endotelekspressionseksiverede adhæsionsmolekyler, herunder ICAM-1, ICAM-2 og VCAM-1, og deres ligander, β2 integriner. Som reaktion på kemotiltrækkende gradienter migrerer klæbede leukocytter gennem endotelkryds reguleret af PECAM-1 og JAM'er. Aktiverede leukocytter migrerer til væv, hvor de frigiver cytokiner, reaktive ilt/nitrogenarter og proteaser for at bekæmpe infektion. Imidlertid kan dysreguleret leukocytmigration beskadige organvæv, hvilket resulterer i organsvigt. Under inflammation nedbrydes glycocalyxen, endotelcelletætte kryds beskadiges, og der er øget endotelcelleapopottose, hvilket fører til beskadiget barrierefunktion og øget permeabilitet. Dette tal er blevet modificeret fra Yang et al.2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over bMFA. (A) Billeder af musens cremastermuskel opnås og (B) digitaliseres ved hjælp af GIS-systemet til at fremstille netværket på PDMS. (C) Lysfeltbillede af bMFA-netværket viser, at i bMFA er vaskulære kanaler forbundet til vævsrummet gennem en 3 μm barriere (den skematiske indsats i panel C). Strømningsretningen af de vaskulære kanaler er angivet. (D) En bMFA-chip, der består af et PDMS-lag bundet til et mikroskopdias, er på mikroskopstadiet. Slangen indsættes i to indløbsporte, to udløbsporte og en vævsrumsport. (C: skalabjælke = 500 μm) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Transient perfusionsundersøgelser, der sammenligner eksperimentelle og simuleringsresultater i bMFA. (A) Netværket af bMFA, der viser indløb, udløb og strømningsretning. (B) Toppanel: CFD-perfusionsprofiler. Nederste panel: Eksperimentelle perfusionsprofiler. Billeder er pseudofarvede for at vise farveforløb. Skalaen normaliseres med blå (ingen perfusion; 0) og magenta (komplet perfusion; 1). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hastigheds- og forskydningshastighedsprofil i bMFA fra CFD-simuleringer. (A) Fordeling af hastighedsstørrelser (Vmag) på tværs af netværket. B) Fordelingen af forskydningshastigheden angiver heterogene forskydningshastigheder i nettet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Neutrofile vedhæftningsmønstre i bMFA ligner neutrofile vedhæftningsmønstre in vivo. Fordelingen af antallet af klæbede neutrofiler in vivo og antallet af neutrofiler i bMFA er begge skæve til venstre, hvilket indikerer, at neutrofiler fortrinsvis klæber nær bifurkationer, hvor toppen forekommer ved en beholder eller kanaldiameter fra den nærmeste bifurcation (gennemsnitlig ± SEM; N = 3). Afstanden af klæbede neutrofiler til den nærmeste bifurcation blev normaliseret ved følgende: normaliseret afstand = afstand til midten af den nærmeste bifurcation/diameter af kanalen. Dette tal er blevet modificeret fra Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, yderligere tilladelser relateret til det uddragne materiale skal rettes til American Chemical Society). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Endotelceller danner et komplet 3D-lumen i bMFA. (A) Fasekontrastbilleder viser, at endotelceller er opstillet i strømningsretningen. (B) Fluorescensbilleder viser, at endotelceller dækker den vaskulære kanal; F-actin er mærket grønt ved hjælp af phalloidin, og kerner er mærket rødt ved hjælp af Draq5. (A: skalabjælke = 100 μm, B: skalabjælke = 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Et computerstyret inverteret fluorescensmikroskop bruges til at studere neutrofil-endotelinteraktioner i bMFA. Et computerstyret trin med en varmere bruges til at holde bMFA på 37 ° C. bMFA er forbundet til en programmerbar sprøjtepumpe gennem slangen. Det omvendte fluorescensmikroskop er udstyret med et videokamera til at tage billeder / video til yderligere offline analyse på computeren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Repræsentative billeder af neutrofiladhæsion og migrationskort. (A) Neutrofiladhæsionskort i bMFA. Billedet blev taget 10 minutter efter eksperimentets start ved hjælp af funktionen "Scan large map" i Nikon-softwaren. De hvide prikker på kortet er fluorescerende mærket neutrofiler med CFDA-SE. Vaskulær kanalgrænse er digitalt mærket (skalabjælke = 100 μm). (B) Neutrofil migrationskort i bMFA uden TNF-α aktivering. Billedet er taget 60 minutter efter forsøgets start. (C) Neutrofil migrationskort i bMFA med TNF-α aktivering. Billedet er taget 60 minutter efter forsøgets start. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Mønstre af neutrofiladhæsion og migration i bMFA under inflammation. (A) TNF-α-behandling øgede signifikant human neutrofiladhæsion til humane lungemikrovaskulære endotelceller, som blev hæmmet efter behandling med en PKCδ-hæmmer. Neutrofiladhæsion forekom fortrinsvis i fartøjer med lav forskydningshastighed og nær bifurkationer i bMFA. (B) Som reaktion på fMLP blev human neutrofilmigration på tværs af TNF-α aktiverede endotelceller signifikant forøget sammenlignet med ubehandlede celler. Behandling med PKCδ-hæmmeren reducerede migrationen til ubehandlede niveauer. n = 4, Middelværdi ± SEM, envejs ANOVA, ** p < 0,01 og *** p < 0,001). Figuren er modificeret fra Soroush et al.27. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Trin 1: Konstant hastighed | Kommentarer | |
| Tilstand | Indgyde | |
| Strømningshastighed | 1 μL/min | |
| Tidspunkt | 10 minutter | |
| Trin 2: Forsinkelse (intet flow) | ||
| Tilstand | Forsinkelse | |
| Tidspunkt | 4 timer | |
| Trin 3: Gentag | Trin 1 og trin 2 gentages 6 gange, før du går til trin 4. | |
| Tilstand | Gentage | |
| Gentag fra | Trin 1 | |
| Gentage | 6 gange | |
| Trin 4: Konstant strømningshastighed | ||
| Tilstand | Indgyde | |
| Strømningshastighed | 0,1 μL/min | |
| Tidspunkt | 48 timer |
Tabel 1: Sprøjtepumpeprogram
| Formel | Navn | MW | Tilføje | Koncentration | 10x HEPES-buffer (Tilsæt DI-vand til 1000 ml og juster pH til 7,3. Fortynd til 1x før brug) |
| NaCl | Natriumchlorid | 58.44 | 87,66 g | 1,5 m | |
| KOH | Kaliumhydroxid | 56.11 | 2,81 g | 50 mM | |
| Hepes | Hepes | 238.3 | 23,83 g | 100 mM | |
| MgCl2 | Magnesiumchlorid | 203.31 | 2,44 g | 12 mM | |
| CaCl2 | Calciumchlorid | 147.62 | 1,90 g | 12,9 mM |
Tabel 2: HEPES-buffersammensætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bMFA reproducerer topografi og strømningsbetingelser i in vivo-mikrovaskulære netværk og kan bruges til at studere leukocyt-endotelcelleinteraktion og endotelfunktion in vitro under fysiologisk realistiske forhold. I mikrovaskulaturen hos enten mus eller menneske er geometrien i de mikrovaskulære netværk selvlignende og fraktale, og Reynolds-tallet << 1, hvilket indikerer, at vaskulær geometri ikke påvirker strømningsmønstre signifikant. Derfor kan bFMA bruges til at studere leukocyt-endotelinteraktioner for forskellige arter, herunder mennesker, selvom mikrovaskulaturen af musens cremastermuskel blev kortlagt til fremstilling af bMFA.
bMFA giver mulighed for realtidsvurdering af individuelle trin i neutrofilmigrationskaskaden i et enkelt assay, herunder rullende, fast vedhæftning, spredning og migration af neutrofiler ind i vævsrummet. Primære humane celler og klinisk relevante prøver kan anvendes i bMFA for at øge oversættelsen og til hurtigt at screene potentielle terapier. Sammenlignet med traditionelle fluidiske systemer såsom parallelle pladeflowkamre har bMFA den fordel, at det bruger mindre end 95% af reagenserne37 på grund af dets små beholderstørrelser og det faktum, at det kan studere hele neutrofil migrationskaskaden i et enkelt assay. Denne lille størrelse kræver dog også, at brugerne arbejder med en meget lille mængde reagenser, hvilket kan være udfordrende og kræver omfattende praksis. Det mest almindelige problem med denne protokol er tilstedeværelsen af luftbobler i bMFA, som kan blokere kanalen og ændre strømningsmønstrene. Derfor skal der udvises stor forsigtighed, når man fjerner eller indsætter slanger i portene, og der skal placeres en dråbe vand i bunden af slangen ved portene for at forhindre luft i at komme ind i kanalen, når slangen fjernes fra bMFA.
Ud over anvendelsen af bMFA til undersøgelse af neutrofil-endotelinteraktioner er bMFA også blevet brugt til at studere integriteten af endotel under inflammation ved at måle variabler såsom permeabilitet og transendotelial endotelresistens (TEER)27. Ved at funktionalisere mikropartikler med specifikke antistoffer kan bMFA desuden anvendes til at studere ekspressionen af adhæsionsmolekyler på endotelceller27. Det blev påvist, at det inflammatoriske respons også kunne opreguleres af andre stimuli i bMFA, såsom ioniserende stråling, og bMFA er blevet brugt til at studere strålingsinduceret endotelcelleskade og neutrofil-endotelinteraktioner29. En anden fordel ved denne anordning er, at endotelceller, neutrofiler og/eller andre blodlegemer eller lægemiddelbærende partikler kan isoleres fra mikrovaskulære kanaler og/eller vævsrum til yderligere analyse. Desuden kan celler/partikler, der ikke interagerede med endotelcellerne i enheden, isoleres fra spildevandet, der forlader enheden. Pericytter og de tilsvarende vævstyper kan også dyrkes i enheden for bedre at repræsentere in vivo-betingelserne . Afslutningsvis giver protokollen, der præsenteres her, et fysiologisk relevant miljø i bMFA til at studere leukocyt-endotelcelleinteraktioner under inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 og GM134701 (M.F.K. og L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.) og Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. og L.E.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
