Summary
I denne protokollen brukes en biomimetisk mikrofluidanalyse, som kan reprodusere et fysiologisk relevant mikrovaskulært miljø og reprodusere hele leukocyttadhesjons-/migrasjonskaskaden, til å studere leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner ved inflammatorisk sykdom.
Abstract
Leukocytt-endoteliale celleinteraksjoner spiller en viktig rolle i inflammatoriske sykdommer som sepsis. Under betennelse kan overdreven migrering av aktiverte leukocytter over det vaskulære endotelet i nøkkelorganer føre til organsvikt. En fysiologisk relevant biomimetisk mikrofluidisk analyse (bMFA) er utviklet og validert ved hjelp av flere eksperimentelle og beregningsteknikker, som kan reprodusere hele leukocyttrullingen/adhesjonen/migrasjonskaskaden for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner. Mikrovaskulære nettverk hentet fra in vivo-bilder hos gnagere ble digitalisert ved hjelp av en Geographic Information System (GIS) tilnærming og mikrofabricated med polydimetylsiloksan (PDMS) på et mikroskop lysbilde. For å studere effekten av skjærhastighet og vaskulær topologi på leukocyte-endoteliale celleinteraksjoner, ble en COMputational Fluid Dynamics (CFD) -modell utviklet for å generere et tilsvarende kart over skjærhastigheter og hastigheter i hele nettverket. bMFA muliggjør kvantifisering av leukocytt-endoteliale celler interaksjoner, inkludert rullehastighet, antall tilhørende leukocytter som svar på forskjellige skjærhastigheter, antall migrerte leukocytter, endotelcellepermeabilitet, adhesjonsmolekyluttrykk og andre viktige variabler. Videre, ved å bruke menneskerelaterte prøver, for eksempel humane endotelceller og leukocytter, gir bMFA et verktøy for rask screening av potensielle terapeutiske behandlinger for å øke deres kliniske overførbarhet.
Introduction
Betennelse er vertsresponsen på infeksjon og skade, og endotelet spiller en viktig rolle i den inflammatoriske responsen 1,2,3. Inflammatorisk dysregulering er den underliggende årsaken til en rekke sykdomspatologier som sepsis, kardiovaskulære sykdommer, astma, inflammatorisk tarmsykdom, kreft og COVID-19. Leukocytt-endotelcelleinteraksjoner spiller en sentral rolle i disse inflammatoriske sykdommene. Under betennelse aktiverer frigjøringen av PAMPS (patogen-assosierte molekylære mønstre) fra patogener eller DAMPS (skaderelaterte molekylære mønstre) fra skadede vev immunceller for å frigjøre cytokiner/kjemokiner og andre proinflammatoriske mediatorer som fører til aktivering av endotel, noe som resulterer i endringer i vaskulær endotelbarrierefunksjon og økt permeabilitet 3,4 . Økt aktivering av endotelceller under betennelse resulterer i forbedret leukocytt-endotelial celleinteraksjon som fører til overdreven migrering av aktiverte leukocytter over det vaskulære endotelet i nøkkelorganer 1,5,6,7.
Rekrutteringen av leukocytter er initiert av kjemisk mangfoldige kjemoattractants sammensatt av bioaktive lipider, cytokiner, kjemokiner og komplementkomponenter 8,9. Leukocyttrekruttering er en flertrinnsprosess som inkluderer fem diskrete trinn: 1) leukocyttmarginering og fangst/vedlegg, 2) rullende, 3) fast arrestasjon, 4) spredning og kryping og 5) ekstravasasjon/migrasjon (figur 1). Hvert trinn i denne prosessen krever krysstale mellom leukocytter og endotelceller for å orkestrere dette dynamiske fenomenet 1,9. Til syvende og sist, arrestert leukocytter ekstravasat til betent vev over endotel via en flertrinnsprosess kontrollert av samtidige kjemoattractant-avhengige signaler, lim hendelser og hemodynamisk skjær tvinger 1,9,10,11,12.
Gitt den sentrale rollen av skjærspenning i regulering av endotelcellefunksjon og betydningen av leukocyte-endotelcelleinteraksjonene13, har flere in vitro-modeller blitt utviklet i løpet av de siste tiårene for å studere ulike aspekter av leukocyttmigrasjonskaskaden i et mer kontrollert miljø14. Tradisjonelle fluidiske enheter for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner kan klassifiseres i to brede kategorier14: a) enheter for å studere leukocyttrulling, vedheft og vedheft molekyluttrykk som parallelle platestrømningskamre og b) enheter for å studere leukocyttmigrasjon under statiske forhold som transwellkamre. Systemer som parallelle platestrømningskamre har blitt brukt til å studere rollene til vedheftsmolekyler og deres ligander i vedheftkaskaden under skjærkrefter15. En betydelig ulempe er imidlertid at disse forenklede, idealiserte enhetene (f.eks. rett kanal) ikke er i stand til å reprodusere skalaen og geometrien til in vivo-mikrovaskulaturen (f.eks. påfølgende vaskulære bifurkasjoner, vaskulær morfologi) og de resulterende strømningsforholdene (f.eks. konvergerende eller avvikende strømmer ved bifurkasjoner). Som et resultat kan disse enhetene bare modellere vedheft, men ikke transmigrasjon. Transwell kamre kan bare studere transmigrasjon under statiske forhold uten å vurdere in vivo geometriske egenskaper og strømningsforhold. Dermed etterligner disse tradisjonelle modellene ikke mikromiljøet av levende vev eller løser vedheft og migrasjon kaskade i en enkelt analyse6.
For å løse denne begrensningen har vi utviklet og i stor grad validert en ny 3D biomimetisk mikrofluidisk analyse (bMFA) (figur 2), som realistisk reproduserer in vivo-mikrovaskulære nettverk på enchip 16,17,18. Protokollen for mikrofabrikasjon av denne enheten har blitt publisert tidligere17 og er bare kort beskrevet her. Mikrovasculature av mus cremaster muskelen ble digitalisert ved hjelp av en modifisert Geographic Information System (GIS) tilnærming19. Deretter ble det syntetiske mikrovaskulære nettverket generert på polydimetylsiloksan (PDMS) ved hjelp av myke litografiprosesser basert på det digitaliserte mikrovaskulære nettverket 14,17,20,21,22. Kort fortalt ble de digitaliserte nettverksbildene trykt på Mylar-filmen, som deretter ble brukt som en maske for å mønstre en SU-8 positiv fotoresist på toppen av en silisiumskive for å lage mesterne for fabrikasjon. Mikrofabricated søyler (10 μm diameter, 3 μm høy) ble brukt til å skape 3 μm høy og 100 μm brede porer, en optimal størrelse for leukocytt migrasjon 23,24,25, forbinder vaskulære kanaler og vevsrom. PDMS ble utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner og helles over de utviklede mesterne. Videre ble PDMS avgasset og fikk lov til å kurere over natten i en ovn (65 °C) for å lage komplementære mikrokanaler i PDMS. Deretter ble den herdede PDMS skrelt fra SU-8-mesteren, etterfulgt av stanseporter for innløp/uttak. Deretter ble PMDS plasma bundet til et glasssklie. Overflaten på den mikrofluidiske enheten består av innfødt glass og PDMS. For å fremme celletilknytning, spredning og spredning, er det nødvendig med ekstracelluarmatrise (ECM) belegg. bMFA inkluderer et mikrovaskulært nettverk og et vevsrom koblet via 3 μm høye og 100 μm brede porer (figur 2). Dette mikrofluidiske systemet reproduserer hele leukocyttadhesjons-/migrasjonskaskaden i et fysiologisk relevant 3D-miljø i et komplett mikrovaskulært nettverk med sammenkoblede kar og bifurkasjoner, inkludert sirkulasjon, marginering, rulling, vedheft og migrasjon av leukocytter inn i det ekstra vaskulære vevsrommet i et enkelt system 14,16,17,21,21,21,21,6
Det skal bemerkes at selv når strømningshastigheten ved innløpet til bMFA er løst, varierer strømningsforholdene i nettverket på forskjellige steder og kan ikke beregnes med en enkel matematisk formel. En beregningsvæskedynamikk (CFD)-basert modell ble utviklet for å beregne forskjellige strømningsparametere (f.eks. skjærspenning, skjærhastighet, hastighet) på forskjellige steder i nettverket. Denne CFD-modellen ble brukt til å simulere fargestoffperfusjonsmønstre og strømningsparametere i bMFA. Kryssvalidering med eksperimentelle resultater antydet at strømningsmotstandene over nettverket er godt spådd av beregningsmodellen (figur 3)17. Denne CFD-modellen ble deretter brukt til å estimere hastighets- og skjærhastighetsprofil i hvert fartøy av bMFA (figur 4), noe som muliggjør analyse av effektene av skjærstrøm og geometri på leukocyttrulling, vedheft og migrasjon16. Leukocytter holder seg fortrinnsvis nær bifurkasjoner og i lave skjærregioner in vivo, og disse romlige mønstrene for leukocyttadhesjon ble vellykket demonstrert i bMFA ved hjelp av nøytrofiler (figur 5)16. Dette dokumentet beskriver protokollen for å forberede bMFA til å studere leukocytt-endotelial celleinteraksjon under inflammatoriske forhold ved hjelp av humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) og humane nøytrofiler. Mikrofysiologiske systemer, som bMFA, kan brukes til å studere endotelcelleinteraksjoner med forskjellige typer celler som nøytrofiler, monocytter, lymfocytter og tumorceller 18,27,28,29,30. bMFA kan frøs med primære endotelceller fra forskjellige organer (f.eks. lunge vs. hjerne) og forskjellige arter (f.eks. humane vs. murine endotelceller), samt endotelcellelinjer 21,27,31,32. bMFA kan brukes til å studere flere cellulære responser, cellecelleinteraksjoner, barrierefunksjon, legemiddellevering og legemiddeltoksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Heparinisert humant blod er oppnådd for nøytrofil isolasjon fra friske voksne donorer (menn og kvinner, i alderen 21 til 60 år), etter informert samtykke som godkjent av Institutional Review Board of Temple University (Philadelphia, PA, USA).
1. Priming og belegg enheten med menneskelig fibronectin
MERK: bMFA har to innløpsporter og to uttaksporter koblet til det vaskulære rommet. Den har også en port koblet til vevskammeret (figur 2).
- Sett inn slangen (O.D. på 0,06" og I.D. på 0,02") (Tabell over materialer) i alle portene unntatt én innløpsport med finpunkts tang. Klem de to utløpsportene og vevskammerporten med kjeveklemmer. Kontroller at hver slange er ~1 tomme lang.
- Fortynn human fibronektin til 100 μg/ml med PBS fra fibronectin lageroppløsning (1mg/ml). Legg en 1 ml sprøyte med tilberedt fibronektinoppløsning. Koble sprøyten til en 24 G stump nål og en ~4-tommers lang slange.
MERK: For å unngå krysskobling må du ikke overmikse/pipette menneskelig fibronectin. Andre ekstracellulære matriser (ECM) som kollagen kan brukes til forskjellige celletyper. - Sett slangen inn i den åpne innløpsporten, skyv stempelet til menneskelig fibronectin kommer ut av den andre innløpsporten, og klem den deretter. Gjenta denne prosessen for resten av portene til alle kanaler, vevsrom og rør er fylt med den menneskelige fibronectin-løsningen. Fjern kanylen, men hold den 4-tommers lange slangen satt inn og løsnet.
MERK: Pass på at slangen er fylt med fibronektin før den klemmes fast. - For avgassing, koble den ulampede slangen til en komprimert nitrogentank gjennom Pneumatic Primer, juster trykket til ~ 5 psi og kjør i ~ 15 min.
- Etter 15 min, sjekk under mikroskopet for å sikre at det ikke er noen luftbobler fanget i enheten. Hvis det er luftbobler fanget i kanalen eller vevskammeret, kobler du enheten til Pneumatic Primer for avgassing igjen, det vil si gjenta trinn 1.4.
MERK: Invertert mikroskop brukes i alle trinnene som involverer mikroskopi i denne protokollen. - Fjern enheten fra Pneumatic Primer. Inkuber enheten ved 37 °C i 1 time, skyll deretter alle kanaler og vevsrom med forvarmede HLMVEC-kulturmedier (Materialbord), lik trinn 1.3. bMFA er nå klar for cellesåing.
MERK: Før du fjerner/setter inn en slange fra porten, må du først plassere en dråpe vann med en pipette rundt bunnen av innløpsportslangen for å hindre at luft kommer inn i enheten.
2. Såing bMFA med HLMVEC
- Kultur HLMVEC til 60% - 80% samløp i henhold til leverandørens protokoll i en T-25 kolbe.
- Aspirer HLMVEC kulturmedier fra cellekulturflaske. Vask to ganger med PBS.
- Tilsett 2 ml forvarmet trypsin-EDTA-oppløsning (37 °C) i T-25-kolben. Inkuber i 3-5 min i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) til de fleste celler løsnes fra kolben.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere for forskjellige celletyper og trypsin-EDTA-konsentrasjon. - Tilsett 2 ml Trypsin nøytraliseringsløsning (TNS, 37 °C) i kolben for å nøytralisere trypsin-EDTA.
- Trykk forsiktig på kolben for å fjerne cellene. Overfør deretter celleopphengsløsningen til et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuge i 5 min ved 150 x g for å pellet endotelcellene. Fjern de supernatante og resuspendcellene i 3 ml cellekulturmedier. Tell antall celler med et hemocytometer.
- Sentrifuge igjen i 5 min ved 150 x g for å pellet cellene. Fjern supernatanten og resuspend cellene til ønsket såddtetthet på 20 x 106 / ml.
MERK: Avhengig av celletyper og samløp kan omtrent 2 x 106 endotelceller samles inn fra to T-25-kolber, og med såddtettheten på 20 x 106/ml, 100 μL av celleopphenget (2 x 106 endotelceller), er tilstrekkelig til å frø 5 enheter. - Monter en 1 ml sprøyte i den programmerbare sprøytepumpen, fest slangen til den stumpe nålen.
- Tegn ~20 μL av cellefjæringen inn i slangen, og pass på at celleopphenget bare er i slangen, ikke i sprøytefatet.
- Ta klemmen av en stikkontakt på enheten. Koble slangen til ett innløp på enheten. Pass på at ingen luftbobler blir introdusert i kanalen.
- Start pumpen med en strømningshastighet på 4-8 μL/min. Vær oppmerksom på enheten under et mikroskop.
- Når kanalene er fylt med celler, stopp pumpen, klem utløpet og kutt innløpsslangen.
MERK: Pass på at du ikke introduserer luftbobler i enheten. - Sett enheten i inkubatoren i 4 timer ved 5% CO2 og 37 °C.
- Etter 4 h inkubasjon, lag en ny sprøyte fylt med friske cellekulturmedier. Monter sprøyten på en sprøytepumpe, koble sprøyten til innløpsporten og fjern klemmen fra en utløpsport.
- Kjør ferske medier gjennom enheten i ca. 5 minutter ved 4-8 μL/min for å vaske ut flytende/uattrliggende celler.
3. Cellekultur under strømning i 48 timer
- Forbered en sprøyte fylt med friske cellekulturmedier. Monter sprøyten i en sprøytepumpe, koble sprøyten til en innløpsport og hold en stikkontakt åpen. Sett enheten i inkubatoren (5% CO2, 37 °C).
- Programmer sprøytepumpen for å dyrke endotelceller under strømning ved hjelp av følgende instruksjoner som er nevnt i tabell 1.
- Sjekk bMFA under et mikroskop etter 48 timers kultur under strømning. HLMVEC skal dekke vaskulære kanaler som danner en komplett lumen (figur 6).
MERK: Andre strømningsregimer kan være nødvendige for forskjellige celletyper.
4. Cytokin og/eller terapeutisk behandling
MERK: Som et eksempel beskriver denne delen bruk av bMFA for å studere effekten av å behandle cellene med Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) og en ny antiinflammatorisk hemmer (Protein Kinase C delta-TAT peptidhemmer, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.
- Klargjør tre forskjellige bMFA-enheter ved hjelp av protokollen ovenfor (avsnitt 1-3).
- Legg tre 1 ml sprøyte med cellekulturmedier (TNF-α) (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) + PKCδ-i (5 μM).
MERK: Cytokiner rekonstitueres i cellekulturmedier. - Koble de tre sprøytene til tre bMFA-enheter. Behandle HLMVEC med buffer TNF-α eller TNF-α + hemmer i 4 timer ved 0,1 μL/min.
MERK: Basert på spesifikke studiekrav kan andre cytokiner eller cytokincocktailer (f.eks. TNF-α + Interleukin 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)), brukes til å behandle endotelceller.
5. Menneskelig nøytrofil isolasjon
- Bruk alle reagenser ved romtemperatur (RT). Reagenser inkluderer leukocyttisolasjonsmedier , 1x HEPES-buffer med Ca2+/Mg2+ (tabell 2), 6 % Dextran i normal saltvann (0,9 % NaCl), 3,6 % NaCl-oppløsning og avionisert vann (DI) vann.
- Pipette 20 ml leukocyttisolasjonsmedier inn i et 50 ml konisk rør og lag forsiktig 25 ml blod over leukocyttisolasjonsmediene. Sentrifuge i 40 min ved 427 x g ved RT.
MERK: Utfør dette trinnet sakte og forsiktig for å unngå å blande blod- og leukocytisolasjonsmediene. - Aspirer ned til ~ 5 ml over røde blodlegemer (RBC) lag. Det hvite buffylaget på toppen av RBC er overveiende nøytrofiler.
- Legg til HEPES-buffer for å doble gjeldende volum (eksisterende volum: HEPES-buffer = 1:1).
- Legg til et beløp på 6% Dextran, som vil være 20% av det endelige volumet. (gjeldende volum/4 = volum lagt til 6% Dextran).
- Snu røret forsiktig et par ganger for å blande godt og la RBC sediment (~ 25 min).
- Rør forsiktig det øvre laget (nøytrofilrikt lag) og overfør til et nytt 50 ml rør, vær forsiktig så du ikke forurenser med sedimentert RBC.
- Sentrifuge i 10 min ved 315 x g ved RT. Fjern supernatanten og resuspend pelletsen i 8 ml HEPES-buffer.
- For å lyse den gjenværende RBC, tilsett 24 ml DI-vann og bland forsiktig i 50 s. Tilsett umiddelbart 8 ml 3,6 % NaCl-oppløsning, bland og sentrifuger i 10 minutter ved 315 x g ved RT.
- Fjern supernatanten, vask cellepelleten med 15 ml HEPES-buffer og sentrifuge i 5 min ved 315 x g. Resuspend pelletsen i HEPES-bufferen.
6. Nøytrofil vedheft og migrasjonseksperiment med bMFA
- Resuspend de isolerte menneskelige nøytrofiler (15 millioner) i 999 μL hepes buffer.
- Tilsett 1 μL CFDA-SE (karboksyfluorescein diacetat succinimidyl ester) fargestoff lagerløsning (10 mM) til nøytrofil suspensjon for å oppnå en arbeidskonsentrasjon på 10 μM CFDA-SE og inkubere i 10 min ved RT. Vask cellene to ganger med HEPES-buffer ved sentriging i 5 minutter ved 315 x g.
- Tell nøytrofiler ved hjelp av et hemocytometer og resuspend ved 2 millioner nøytrofiler/ml med cellekulturmedier, TNF-α (10 ng/ml) og TNF-α (10 ng/ml) +PKCδ-i (5 μM), henholdsvis; inkubere i 15 min ved RT før starten av eksperimentet.
- Forbered en sprøyte fylt med 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), kjemoattractant for studien, i cellekulturmedier. Ta bMFA og åpne en innløpsport og en uttaksport.
MERK: Disse eksperimentelle forholdene brukes til å etterligne tilstandene til sepsis som inkluderer en systemisk inflammatorisk respons med høye nivåer av sirkulerende cytokin / kjemokiner. Videre brukes fMLP, et Gram-negativt bakterie-avledet peptid, til å modellere tilstedeværelsen av bakterier i lungen (dvs. vevsrom). - Fjern portslangen for vevskammeret og sett inn fMLP-slangen. Injiser ~ 20 μL fMLP i vevsrommet for alle bMFA, bortsett fra den som behandles med cellekulturmedier alene. Klipp deretter slangen og klem den.
- Fyll sprøyten med ~200 μL av nøytrofilfjæringen og monter sprøyten på sprøytepumpen.
- Sett enheten på det inverterte mikroskopstadiet (Tabell over materialer).
- Start pumpen med en strømningshastighet er 1 μL /min og vent til en liten dråpe av nøytrofilfjæringen kommer ut av slangen. Sett slangen inn i innløpsporten. Se figur 7 for oppsettet.
7. Skaff bilder
- Bruk funksjonen Skann stort bilde i programvaren for analyse av mikroskopbilder (Materialfortegnelse) for å få adhesjonskartet i bMFA (figur 8) 10 min etter at eksperimentet er startet. De fleste nøytrofiler går inn i bMFA i løpet av de første 10 minutter.
MERK: Hold fluorescenslyset av når du ikke tar bilder for å redusere fotobleking. - I løpet av den neste timen kan du ta timelapse-bilder (1 bilde hvert 5. minutt) av vevsrommet (figur 8B, C) for migrasjonsanalyse for å få tak i migrasjonskartet.
8. Analyse av digitale bilder
- For vedheftskartet teller du antall tillevde nøytrofiler i hvert fartøy. For hver bifurkasjon skaper du et sirkulært interesseområde (ROI) med en diameter som tilsvarer to ganger kardiameteren og teller antall festede nøytrofiler.
- Bruk manuell telling eller den automatiserte Object Count-funksjonen for å kvantifisere antall å overholde nøytrofiler i hvert fartøy og bifurkasjonsområde.
- Bruk skråstillingshastighetskartet for nettverket som genereres ved hjelp avCFD-simulering 17 for å bestemme skjærhastigheten i hvert fartøy. Deretter plotter du antall tillevde nøytrofiler i et gitt fartøy mot skjærhastigheten i det fartøyet for å lage et skjærhastighetskart i bMFA som vist i figur 9A.
- Nøytrofiler regnes som migrert hvis de har krysset gjennom endotelet inn i vevsrommet. Tell antall migrerte nøytrofiler på 10 min, 15 min, 30 min og 60 min. Plott antall migrerte nøytrofiler kontra tid som vist i figur 9B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter 48 timers kultur under skjærstrøm i bMFA dekket endotelceller overflaten av de vaskulære kanalene i bMFA og justert i strømningsretningen (figur 6). Konfokal mikroskopi indikerte at alle overflater av de vaskulære kanalene var dekket av endotelceller, og dannet en komplett 3D lumen i bMFA18.
Ved hjelp av denne protokollen kan et nøytrofiladhesjonskart anskaffes, noe som viser at det er betydelig vedheft av nøytrofiler til endotelcelle i bMFA (figur 8). Korrelering av den romlige fordelingen av nøytrofiler i dette vedheftskartet med skjærhastighetskartet generert fra CFD-modellen viser at nøytrofiladhesjon er skjæravhengig, og nøytrofiler holder seg fortrinnsvis i lav skjærhastighet og bifurkasjonsregioner (figur 9A). Vedheften av nøytrofiler til TNF-α-aktiverte endotelceller økte betydelig. Analyse av timelapse-bilder indikerte at TNF-α aktivering av endotelceller øker nøytrofilmigrasjonen som svar på den kjemoattractante fMLP (figur 9B). Som nevnt ovenfor kan bMFA brukes til raskt å teste effekten av en ny terapeutisk for behandling av inflammatorisk sykdom. For eksempel reduserte behandling av endotelceller og nøytrofiler med PKCδ-i betydelig nøytrofiladhesjon og migrasjon (figur 9A,B)27.
Figur 1: Endotelcelleaktivering under betennelse. (A) Under normale forhold dekkes det vaskulære endotelet av glykokalyksen og danner en tett barriere som regulerer barrieregjennomtrengelighet, leukocyttmigrasjon og antiinflammatorisk forsvar. (B) Under betennelse aktiveres leukocytter og endotelceller av PAMPS og DAMPS for å produsere cytokiner og kjemoattractanter, noe som fører til forhøyede uttrykk for overflatemolekyler på både leukocytter og endotelceller, noe som forbedrer leukocytt-endotelinteraksjoner. Interaksjoner mellom E/P-selectin på endotelceller og deres ligander (f.eks. PSGL-1) på leukocytter er involvert i rulling, noe som bremser nøytrofil. Fast vedheft er regulert av endotel-uttrykte adhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1, ICAM-2 og VCAM-1, og deres ligander, β2 integrins. Som svar på kjemoattractant gradienter migrerer fulgte leukocytter gjennom endotelkryss regulert av PECAM-1 og JAMer. Aktiverte leukocytter migrerer til vev, hvor de frigjør cytokiner, reaktive oksygen / nitrogenarter og proteaser for å bekjempe infeksjon. Imidlertid kan dysregulert leukocyttmigrasjon skade organvev, noe som resulterer i organsvikt. Under betennelse blir glykokalyxen degradert, endotelcelle tette kryss er skadet og det er økt endotelcelle apoptose, noe som fører til skadet barrierefunksjon og økt permeabilitet. Denne figuren er endret fra Yang et al.2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over bMFA. (A) Bilder av mus cremaster muskelen er oppnådd og (B) digitalisert ved hjelp av GIS-systemet for å fremstille nettverket på PDMS. (C) Lysfeltbilde av bMFA-nettverk viser at i bMFA er vaskulære kanaler koblet til vevskammeret gjennom en 3 μm barriere (den skjematiske innsatsen i panel C). Strømningsretningen til de vaskulære kanalene er indikert. (D) En bMFA-brikke, som består av et PDMS-lag festet til et mikroskopsklie, er på mikroskopstadiet. Slangen settes inn i to innløpsporter, to utløpsporter og en vevsromport. (C: skala bar = 500 μm) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forbigående perfusjonsstudier som sammenligner eksperimentelle og simuleringsresultater i bMFA. (A) Nettverket av bMFA som viser innløps-, utløps- og strømningsretningen. (B) Topppanel: CFD-perfusjonsprofiler. Bunnpanel: Eksperimentelle perfusjonsprofiler. Bilder er pseudofargede for å vise graderinger. Skalaen normaliseres med blått (ingen perfusjon; 0) og magenta (fullstendig perfusjon; 1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hastighets- og skjærhastighetsprofil i bMFA fra CFD-simuleringer. (A) Distribusjon av hastighetsstørrelser (Vmag) over hele nettverket. (B) Fordeling av skjærhastighet indikerer heterogene skjærhastigheter i nettverket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Nøytrofiladhesjonsmønstre i bMFA ligner på nøytrofiladhesjonsmønstre in vivo. Fordelingene av antall tilholdte nøytrofiler in vivo og antall nøytrofiler i bMFA er begge skjevt til venstre, noe som indikerer at nøytrofiler fortrinnsvis holder seg nær bifurkasjoner med toppen som forekommer ved ett fartøy eller kanaldiameter fra nærmeste bifurkasjon (gjennomsnittlig ± SEM; N = 3). Avstanden til tillevde nøytrofiler til nærmeste bifurkasjon ble normalisert av følgende: normalisert avstand = avstand til midten av nærmeste bifurkasjon / diameter på kanalen. Denne figuren er modifisert fra Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, bør ytterligere tillatelser knyttet til det utdrag av materialet rettes til American Chemical Society). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Endotelceller danner en komplett 3D-lumen i bMFA. (A) Fasekontrastbilder viser at endotelceller er stilt opp i flytretningen. (B) Fluorescensbilder viser endotelceller dekker den vaskulære kanalen; F-aktin er merket grønn ved hjelp av falloidin og kjerner er merket rødt ved hjelp av Draq5. (A: skalastang = 100 μm, B: skalastang = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Et datastyrt invertert fluorescensmikroskop brukes til å studere nøytrofil-endotelinteraksjoner i bMFA. Et datastyrt stadium med varmere brukes til å holde bMFA ved 37 °C. bMFA er koblet til en programmerbar sprøytepumpe gjennom slangen. Det inverterte fluorescensmikroskopet er utstyrt med et videokamera for å ta bilder / video for videre offline analyse på datamaskinen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Representative bilder av nøytrofiladhesjons- og migrasjonskart. (A) Neutrophil adhesjonskart i bMFA. Bildet ble tatt 10 min etter starten av eksperimentet ved hjelp av "Skann stort kart" -funksjonen til Nikon-programvare. De hvite prikkene på kartet er fluorescerende merket nøytrofiler med CFDA-SE. Vaskulær kanalgrense er digitalt merket (skalastang = 100 μm). (B) Neutrophil migrasjonskart i bMFA uten aktivering av TNF-α. Bildet ble tatt 60 min etter starten av eksperimentet. (C) Neutrophil migrasjonskart i bMFA med aktivering av TNF-α. Bildet ble tatt 60 min etter starten av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Mønstre av nøytrofil vedheft og migrasjon i bMFA under betennelse. (A) TNF-α behandling økte signifikant menneskelig nøytrofiladhesjon til humane lungemikrovaskulære endotelceller, som ble hemmet etter behandling med en PKCδ-hemmer. Nøytrofiladhesjon skjedde fortrinnsvis i fartøy med lav skjærhastighet og nær bifurkasjoner i bMFA. (B) Som svar på fMLP ble menneskelig nøytrofilmigrasjon over TNF-α aktiverte endotelceller betydelig økt sammenlignet med ubehandlede celler. Behandling med PKCδ-hemmeren reduserte migrasjonen til ubehandlede nivåer. n = 4, Gjennomsnittlig ± SEM, enveis ANOVA, ** p < 0,01 og *** p < 0,001). Figuren er modifisert fra Soroush et al.27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Trinn 1: Konstant hastighet | Kommentarer | |
| Modus | Sette mot i | |
| Strømningshastighet | 1 μL/min | |
| Tid | 10 min | |
| Trinn 2: Forsinkelse (ingen flyt) | ||
| Modus | Forsinkelse | |
| Tid | 4 timer | |
| Trinn 3: Gjenta | Trinn 1 og trinn 2 gjentas 6 ganger før du går til trinn 4. | |
| Modus | Gjenta | |
| Gjenta fra | Trinn 1 | |
| Gjenta | 6 ganger | |
| Trinn 4: Konstant strømningshastighet | ||
| Modus | Sette mot i | |
| Strømningshastighet | 0,1 μL/min | |
| Tid | 48 timer |
Tabell 1: Sprøytepumpeprogram
| Formel | Navn | MW | Tilføye | Konsentrasjon | 10x HEPES-buffer (Tilsett DI-vann på 1000 ml og juster pH til 7,3. Fortynn til 1x før bruk) |
| NaCl | Natriumklorid | 58.44 | 87,66 g | 1,5 M | |
| KOH | Kaliumhydroksid | 56.11 | 2,81 g | 50 mM | |
| Hepes | Hepes | 238.3 | 23,83 g | 100 mM | |
| MgCl2 | Magnesiumklorid | 203.31 | 2,44 g | 12 mM | |
| CaCl2 | Kalsiumklorid | 147.62 | 1,90 g | 12,9 mM |
Tabell 2: HEPES-buffersammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bMFA reproduserer topografien og strømningsforholdene til in vivo-mikrovaskulære nettverk og kan brukes til å studere leukocyte-endotelial celleinteraksjon og endotelfunksjon in vitro under fysiologisk realistiske forhold. I mikrovaskulaturen til enten mus eller menneske er geometrien til de mikrovaskulære nettverkene selvliknende og fraktal, og Reynolds-nummeret << 1, noe som indikerer at vaskulær geometri ikke påvirker strømningsmønstrene betydelig. Derfor kan bFMA brukes til å studere leukocyte-endotelinteraksjoner for forskjellige arter, inkludert mennesker, selv om mikrovasculature av mus cremaster muskel ble kartlagt for å produsere bMFA.
bMFA tillater sanntidsvurdering av individuelle trinn i nøytrofilmigrasjonskaskaden i en enkelt analyse, inkludert rullende, fast vedheft, spredning og migrasjon av nøytrofiler inn i vevsrommet. Primære humane celler og klinisk relevante prøver kan brukes i bMFA for å øke overførbarheten og for raskt å screene potensielle terapeutiske behandlinger. Sammenlignet med tradisjonelle fluidiske systemer som parallelle platestrømningskamre, har bMFA fordelen av å bruke mindre enn 95% av reagensene37 på grunn av sine små karstørrelser og det faktum at det kan studere hele nøytrofilmigrasjonen kaskade i en enkelt analyse. Imidlertid krever denne lille størrelsen også at brukerne jobber med et svært lite volum reagenser, noe som kan være utfordrende og krever omfattende praksis. Det vanligste problemet med denne protokollen er tilstedeværelsen av luftbobler i bMFA, som kan blokkere kanalen og endre strømningsmønstrene. Derfor bør det utvises stor forsiktighet ved fjerning eller innsetting av slanger i portene, og en dråpe vann må plasseres ved foten av slangen ved portene for å forhindre at luft kommer inn i kanalen når slangen fjernes fra bMFA.
I tillegg til anvendelsen av bMFA for å studere nøytrofil-endotelinteraksjoner, har bMFA også blitt brukt til å studere integriteten til endotel under betennelse ved å måle variabler som permeabilitet og transendotelial endotelresistens (TEER)27. Videre, ved å funksjonalisere mikropartikler med spesifikke antistoffer, kan bMFA brukes til å studere uttrykket av adhesjonsmolekyler på endotelceller27. Det ble demonstrert at den inflammatoriske responsen også kunne oppreguleres av andre stimuli i bMFA, som ioniserende stråling, og bMFA har blitt brukt til å studere strålingsindusert endotelcelleskade og nøytrofil-endotelinteraksjoner29. En annen fordel med denne enheten er at endotelceller, nøytrofiler og/eller andre blodlegemer eller stoffbærende partikler kan isoleres fra mikrovaskulære kanaler og/eller vevsrom for videre analyse. Videre kan celler / partikler som ikke samhandlet med endotelcellene i enheten isoleres fra avløpet som går ut av enheten. Pericytter og de tilsvarende vevstypene kan også dyrkes i enheten for bedre å representere in vivo-forholdene . Avslutningsvis gir protokollen som presenteres her et fysiologisk relevant miljø i bMFA for å studere leukocytt-endotelcelleinteraksjoner under betennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 og GM134701 (M.F.K. og L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), og Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. og L.E.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
