Summary
В этом протоколе биомиметический микрофлюидный анализ, который может воспроизводить физиологически значимую микрососудистую среду и воспроизводить весь каскад адгезии / миграции лейкоцитов, используется для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток при воспалительных заболеваниях.
Abstract
Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет важную роль при воспалительных заболеваниях, таких как сепсис. Во время воспаления чрезмерная миграция активированных лейкоцитов через эндотелий сосудов в ключевые органы может привести к органной недостаточности. Физиологически значимый биомиметический микрофлюидный анализ (bMFA) был разработан и подтвержден с использованием нескольких экспериментальных и вычислительных методов, которые могут воспроизводить весь каскад перекатки /адгезии/миграции лейкоцитов для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток. Микрососудистые сети, полученные из изображений in vivo у грызунов, были оцифрованы с использованием подхода Географической информационной системы (ГИС) и микрофабрикованы с полидиметилсилоксаном (PDMS) на слайде микроскопа. Для изучения влияния скорости сдвига и сосудистой топологии на взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток была разработана модель вычислительной гидродинамики (CFD) для создания соответствующей карты скоростей сдвига и скоростей по всей сети. bMFA позволяет количественно оценивать взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток, включая скорость качения, количество прилипших лейкоцитов в ответ на различные скорости сдвига, количество мигрирующих лейкоцитов, проницаемость эндотелиальных клеток, экспрессию молекул адгезии и другие важные переменные. Кроме того, используя связанные с человеком образцы, такие как эндотелиальные клетки человека и лейкоциты, bMFA предоставляет инструмент для быстрого скрининга потенциальных терапевтических средств для повышения их клинической переводимости.
Introduction
Воспаление является ответом хозяина на инфекцию и травму, а эндотелий играет важную роль в воспалительной реакции 1,2,3. Воспалительная дисрегуляция является основной причиной ряда патологий заболеваний, таких как сепсис, сердечно-сосудистые заболевания, астма, воспалительные заболевания кишечника, рак и COVID-19. Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет центральную роль в этих воспалительных заболеваниях. Во время воспаления высвобождение PAMPS (патоген-ассоциированных молекулярных паттернов) из патогенов или DAMPS (связанных с повреждением молекулярных паттернов) из поврежденных тканей активирует иммунные клетки для высвобождения цитокинов / хемокинов и других провоспалительных медиаторов, которые приводят к активации эндотелия, что приводит к изменениям в барьерной функции эндотелия сосудов и повышению проницаемости 3,4 . Повышенная активация эндотелиальных клеток при воспалении приводит к усилению взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток, что приводит к чрезмерной миграции активированных лейкоцитов через эндотелий сосудов в ключевые органы 1,5,6,7.
Рекрутирование лейкоцитов инициируется химически разнообразными хемоаттрактантантами, состоящими из биологически активных липидов, цитокинов, хемокинов и компонентов комплемента 8,9. Рекрутирование лейкоцитов представляет собой многоступенчатый процесс, который включает в себя пять дискретных этапов: 1) маржинирование и захват/прикрепление лейкоцитов, 2) прокатка, 3) твердая остановка, 4) распространение и ползание и 5) экстравазация/миграция (рисунок 1). Каждый этап этого процесса требует перекрестных помех между лейкоцитами и эндотелиальными клетками для оркестровки этого динамического явления 1,9. В конечном счете, арестованные лейкоциты экстравазируются в воспаленные ткани через эндотелий с помощью многоступенчатого процесса, контролируемого одновременными химиоаттруктант-зависимыми сигналами, адгезивными событиями и гемодинамическими сдвиговыми силами 1,9,10,11,12.
Учитывая центральную роль сдвигового стресса в регулировании функции эндотелиальных клеток и значимость взаимодействия лейкоцитов и эндотелий клеток13, за последние несколько десятилетий было разработано несколько моделей in vitro для изучения различных аспектов каскада миграции лейкоцитов в более контролируемой среде14. Традиционные жидкостные устройства для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток можно классифицировать на две широкие категории14: а) устройства для изучения подвижности лейкоцитов, адгезии и экспрессии молекул адгезии, такие как параллельные пластинчатые проточные камеры и б) устройства для изучения миграции лейкоцитов в статических условиях, таких как трансвеллентные камеры. Такие системы, как параллельные пластинчатые проточные камеры, использовались для изучения роли молекул адгезии и их лигандов в каскаде адгезии при силах сдвига15. Однако существенным недостатком является то, что эти упрощенные, идеализированные устройства (например, прямой канал) не способны воспроизводить масштаб и геометрию микроциркуляторного русла in vivo (например, последовательные сосудистые бифуркации, морфологию сосудов) и результирующие условия потока (например, сходящиеся или расходящиеся потоки при бифуркациях). В результате эти устройства могут моделировать только адгезию, но не трансмиграцию. Трансвелл-камеры могут изучать только трансмиграцию в статических условиях без учета геометрических особенностей in vivo и условий потока. Таким образом, эти традиционные модели не имитируют микроокружение живых тканей и не разрешают каскад адгезии и миграции в одном анализе6.
Чтобы устранить это ограничение, мы разработали и тщательно проверили новый 3D-биомиметический микрофлюидный анализ (bMFA) (рисунок 2), который реалистично воспроизводит микрососудистые сети in vivo на чипе 16,17,18. Протокол микропроизводства этого устройства был опубликован ранее17 и лишь кратко описан здесь. Микроциркуляторное русло мышиной кремастерной мышцы было оцифровано с использованием модифицированного подхода19 Географической информационной системы (ГИС). Затем синтетическую микрососудистую сеть генерировали на полидиметилсилоксане (PDMS) с помощью процессов мягкой литографии на основе оцифрованной микрососудистой сети 14,17,20,21,22. Вкратце, оцифрованные сетевые изображения были напечатаны на майларовой пленке, которая затем использовалась в качестве маски для создания положительного фоторезиста СУ-8 поверх кремниевой пластины для создания мастеров для изготовления. Микрофабрикированные столбы (диаметр 10 мкм, высота 3 мкм) использовались для создания пор высотой 3 мкм и шириной 100 мкм, оптимального размера для миграции лейкоцитов 23,24,25, соединяющих сосудистые каналы и тканевые отсеки. ПДМС готовили по инструкции производителя и заливали над разработанными мастерами. Кроме того, PDMS дегазировали и позволяли отверждать в течение ночи в печи (65 ° C) для создания дополнительных микроканалов в PDMS. Впоследствии отвержденный ПДМС отклеивали от капитана СУ-8 с последующей штамповкой отверстий для входов/розеток. Затем PMDS был плазменным соединением со стеклянным слайдом. Поверхность микрофлюидного устройства содержит нативное стекло и PDMS. Чтобы способствовать прикреплению, распространению и пролиферации клеток, требуется покрытие внеклеточной матрицы (ECM). bMFA включает микрососудистую сеть и тканевой компартмент, соединенный через поры высотой 3 мкм и шириной 100 мкм (рисунок 2). Эта микрофлюидная система воспроизводит весь каскад адгезии/миграции лейкоцитов в физиологически значимой 3D-среде полной микрососудистой сети со взаимосвязанными сосудами и бифуркациями, включая циркуляцию, маржинацию, прокатку, адгезию и миграцию лейкоцитов во внесосудистый тканевой компартмент в единую систему 14,16,17,21,26.
Следует отметить, что даже при фиксированном расходе на входе bMFA условия потока в сети изменяются в разных местах и не могут быть рассчитаны по простой математической формуле. Была разработана модель на основе вычислительной гидродинамики (CFD) для расчета различных параметров потока (например, напряжения сдвига, скорости сдвига, скорости) в разных местах сети. Эта модель CFD использовалась для моделирования паттернов перфузии красителя и параметров потока в bMFA. Перекрестная валидация с экспериментальными результатами показала, что сопротивления потока по сети хорошо предсказаны вычислительной моделью (рисунок 3)17. Эта модель CFD затем использовалась для оценки скорости и профиля скорости сдвига в каждом сосуде bMFA (рисунок 4), что позволило проанализировать влияние сдвигового потока и геометрии на крение лейкоцитов, адгезию и миграцию16. Лейкоциты преимущественно прилипают вблизи бифуркации и в областях с низким сдвигом in vivo, и эти пространственные паттерны адгезии лейкоцитов были успешно продемонстрированы в bMFA с использованием нейтрофилов (рисунок 5)16. В данной работе описан протокол подготовки bMFA для изучения взаимодействия лейкоцитарно-эндотелиальных клеток при воспалительных состояниях с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток легких человека (HLMVEC) и нейтрофилов человека. Микрофизиологические системы, такие как bMFA, могут быть использованы для изучения взаимодействия эндотелиальных клеток с различными типами клеток, такими как нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и опухолевые клетки 18,27,28,29,30. bMFA может быть засеян первичными эндотелиальными клетками из разных органов (например, легких против мозга) и различных видов (например, человеческие и мышиные эндотелиальные клетки), а также эндотелиальными клеточными линиями 21,27,31,32. bMFA может быть использован для изучения множественных клеточных реакций, клеточно-клеточных взаимодействий, барьерной функции, доставки лекарств и токсичности лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Гепаринизированная человеческая кровь получается для выделения нейтрофилов от здоровых взрослых доноров (мужчин и женщин в возрасте от 21 до 60 лет) после информированного согласия, одобренного Советом по институциональному обзору Университета Темпл (Филадельфия, штат Пенсильвания, США).
1. Грунтовка и покрытие устройства фибронектином человека
ПРИМЕЧАНИЕ: bMFA имеет два входных порта и два выходных порта, подключенных к сосудистому отсеку. Он также имеет один порт, соединенный с тканевым отсеком (рисунок 2).
- Вставьте трубку (O.D. 0,06" и I.D. 0,02") (Таблица материаловs) во все порты, за исключением одного входного порта с тонкими щипцами. Зажмите два выходных порта и порт тканевого отсека с помощью щековых зажимов. Убедитесь, что каждая трубка имеет длину ~ 1 дюйм.
- Разбавить фибронектин человека до 100 мкг/мл PBS из раствора фибронектина (1 мг/мл). Нагрузите шприц 1 мл приготовленным раствором фибронектина. Подключите шприц к тупой игле 24 г и трубке длиной ~4 дюйма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить сшивание, не перемешивайте фибронектин человека/ пипетку. Другие внеклеточные матрицы (ECM), такие как коллаген, могут использоваться для различных типов клеток. - Вставьте трубку в открытое входное отверстие, нажмите плунжер до тех пор, пока фибронектин человека не выйдет из другого входного отверстия, затем зажмите его. Повторяйте этот процесс для остальных портов до тех пор, пока все каналы, тканевый отсек и трубка не будут заполнены раствором фибронектина человека. Извлеките иглу, но держите трубку длиной 4 дюйма вставленной и незажатой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что трубка заполнена фибронектином, прежде чем она будет зажата. - Для дегазации подключите незажатую трубку к резервуару для сжатого азота через пневматическую грунтовку, отрегулируйте давление до ~ 5 фунтов на квадратный дюйм и работайте в течение ~ 15 минут.
- Через 15 минут проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что в устройстве нет пузырьков воздуха. Если в канале или тканевом отсеке есть пузырьки воздуха, повторно подключите устройство к пневматической грунтовке для повторной дегазации, т.е. повторите шаг 1.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертированный микроскоп используется на всех этапах, связанных с микроскопией в этом протоколе. - Извлеките устройство из пневматической грунтовки. Инкубируют устройство при 37 °C в течение 1 ч, затем промывают все каналы и тканевой отсек предварительно нагретой питательной средой HLMVEC (Таблица материалов), аналогичной этапу 1.3. BMFA теперь готов к посеву клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед извлечением/вставкой трубки из порта сначала поместите каплю воды с пипеткой вокруг основания трубки входного отверстия, чтобы предотвратить попадание воздуха в устройство.
2. Посев bMFA с HLMVEC
- Культивирование HLMVEC до 60%-80% слияния по протоколу поставщика в колбу Т-25.
- Аспиратная культуральная среда HLMVEC из колбы клеточной культуры. Дважды вымойте PBS.
- Добавьте 2 мл предварительно подогретого раствора трипсина-ЭДТА (37 °C) в колбу Т-25. Инкубировать в течение 3-5 мин в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) до тех пор, пока большинство клеток не отделятся от колбы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться для различных типов клеток и концентрации трипсина-ЭДТА. - Добавьте 2 мл раствора для нейтрализации трипсина (TNS, 37 °C) в колбу для нейтрализации трипсина-ЭДТА.
- Осторожно постучите по колбе, чтобы помочь диссоциировать клетки. Затем перенесите раствор клеточной суспензии в коническую трубку объемом 15 мл.
- Центрифугу в течение 5 мин при 150 х г гранулировать эндотелиальные клетки. Удаляют супернатант и повторно суспендируют клетки в 3 мл клеточной культуральной среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Центрифугу снова в течение 5 мин при 150 х г гранулировать ячейки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки до желаемой плотности посева 20 х 106/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типов клеток и слияния, около 2 х 106 эндотелиальных клеток могут быть собраны из двух Т-25 колб, и при плотности посева 20 х 106/мл, 100 мкл клеточной суспензии (2 х 106 эндотелиальных клеток), достаточно для посева 5 устройств. - Установите шприц объемом 1 мл в программируемый шприцевой насос, прикрепите трубку к тупой игле.
- Втяните ~ 20 мкл клеточной суспензии в трубку, убедившись, что клеточная суспензия находится только в трубке, а не в стволе шприца.
- Снимите зажим с выходного порта устройства. Подключите трубку к одному входу устройства. Убедитесь, что в канал не вводятся пузырьки воздуха.
- Запустите насос со скоростью потока 4-8 мкл/мин. Наблюдайте за прибором под микроскопом.
- Когда каналы заполнены ячейками, остановите насос, зажмите выходное отверстие и отрежьте впускную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не вводить пузырьки воздуха в устройство. - Поместите прибор в инкубатор на 4 ч при 5%СО2 и 37 °С.
- После 4 ч инкубации приготовьте еще один шприц, наполненный свежей клеточной культуральной средой. Установите шприц на шприцевой насос, подключите шприц к входному отверстию и снимите зажим из выходного отверстия.
- Пропустите свежую среду через устройство в течение примерно 5 мин со скоростью 4-8 мкл/мин для вымывания плавающих/неприсоединенных клеток.
3. Клеточная культура под потоком в течение 48 ч
- Приготовьте шприц, наполненный свежей клеточной культуральной средой. Установите шприц в шприцевой насос, подключите шприц к одному входному порту и держите выходное отверстие открытым. Поместите прибор в инкубатор (5% CO2, 37 °C).
- Запрограммируйте шприцевой насос для культивирования эндотелиальных клеток в потоке, используя следующие инструкции, указанные в таблице 1.
- Проверьте bMFA под микроскопом после 48 ч культуры в потоке. HLMVEC должен покрывать сосудистые каналы, образующие полный просвет (рисунок 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных типов клеток могут потребоваться другие режимы потока.
4. Цитокиновое и/или терапевтическое лечение
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера в этом разделе описывается использование bMFA для изучения влияния лечения клеток фактором некроза опухоли-альфа (TNF-α) и новым противовоспалительным ингибитором (ингибитор дельта-тат-пептида Protein Kinase C, PKCδ-i) 18,27,32,33,34,35,36.
- Подготовьте три различных устройства bMFA, используя протокол выше (раздел 1-3).
- Загрузите три шприца по 1 мл с клеточными культуральными средами (TNF-α) (10 нг/мл), TNF-α (10 нг/мл) + PKCδ-i (5 мкМ) соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цитокины восстанавливаются в клеточных культуральных средах. - Подключите три шприца к трем устройствам bMFA. Лечить HLMVEC буфером TNF-α или ингибитором TNF-α + в течение 4 ч при 0,1 мкл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на конкретных требованиях исследования, другие цитокины или цитокиновые коктейли (например, TNF-α + интерлейкин 1 бета (IL1-β) + интерферон-гамма (IFN-γ)), могут быть использованы для лечения эндотелиальных клеток.
5. Выделение нейтрофилов человека
- Используйте все реагенты при комнатной температуре (RT). Реагенты включают среды выделения лейкоцитов, 1x буфер HEPES с Ca2+/Mg2+ (таблица 2), 6% декстран в обычном физиологическом растворе (0,9% NaCl), 3,6% раствор NaCl и деионизированную воду (DI).
- Пипетка 20 мл среды выделения лейкоцитов в коническую трубку объемом 50 мл и аккуратно наслаивает 25 мл крови на среду выделения лейкоцитов. Центрифуга в течение 40 мин при 427 х г при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг медленно и осторожно, чтобы избежать смешивания крови и сред выделения лейкоцитов. - Аспират до ~ 5 мл над слоем эритроцитов (эритроцитов). Белый баффи слой поверх эритроцитов преимущественно состоит из нейтрофилов.
- Добавьте буфер HEPES, чтобы удвоить текущий объем (существующий том: буфер HEPES = 1:1).
- Добавьте сумму 6% Декстрана, что составит 20% от итогового объема. (текущий объем/4 = объем добавленных 6% Декстрана).
- Осторожно переверните трубку несколько раз, чтобы хорошо перемешать и дать RBC осадку (~25 мин).
- Осторожно пипетку верхнего слоя (богатый нейтрофилами слой) и переложите в новую трубку объемом 50 мл, будьте осторожны, чтобы не загрязнить осажденные эритроциты.
- Центрифуга в течение 10 мин при 315 х г при RT. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 8 мл буфера HEPES.
- Чтобы лизировать остаточный эритроцит, добавьте 24 мл воды DI и осторожно перемешайте в течение 50 с. Сразу же добавьте 8 мл 3,6% раствора NaCl, перемешайте и центрифугируйте в течение 10 мин при 315 х г при RT.
- Удалите супернатант, промыть ячейку гранулы 15 мл буфера HEPES и центрифуги в течение 5 мин при 315 х г. Повторно суспендировать гранулу в буфере HEPES.
6. Эксперимент по адгезии и миграции нейтрофилов с bMFA
- Повторное суспендирование выделенных нейтрофилов человека (15 миллионов) в 999 мкл буфера HEPES.
- Добавьте 1 мкл РАСТВОРа красителя CFDA-SE (карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир) (10 мМ) к суспензии нейтрофилов для получения рабочей концентрации 10 мкМ CFDA-SE и инкубируйте в течение 10 мин при RT. Промыть клетки дважды буфером HEPES центрифугированием в течение 5 мин при 315 х г.
- Подсчитать нейтрофилы с помощью гемоцитометра и повторно суспендировать при 2 млн нейтрофилов/мл с помощью клеточных культуральных сред, TNF-α (10 нг/мл) и TNF-α (10 нг/мл) +PKCδ-i (5 мкМ) соответственно; инкубировать в течение 15 мин при РТ до начала эксперимента.
- Подготовьте шприц, наполненный 1 мкМ N-формил-мет-лей-фе (fMLP), химиоаттрактантом для исследования, в среде клеточной культуры. Возьмите bMFA и откройте один входной порт и один выходной порт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти экспериментальные условия используются для имитации состояний сепсиса, которые включают системную воспалительную реакцию с высоким уровнем циркулирующих цитокинов / хемокинов. Кроме того, fMLP, пептид, полученный из грамотрицательных бактерий, используется для моделирования присутствия бактерий в легких (т. Е. Тканевом отсеке). - Снимите трубку порта тканевого отсека и вставьте трубку fMLP. Вводят ~ 20 мкл fMLP в тканевой компартмент для всех bMFA, за исключением того, который обрабатывается только клеточными культуральными средами. Затем вырежьте трубку и зажмите ее.
- Заполните шприц ~200 мкл суспензии нейтрофилов и установите шприц на шприцевой насос.
- Поставьте прибор на ступень инвертированного микроскопа (Таблица материалов).
- Запустите насос со скоростью потока 1 мкл/мин и подождите, пока небольшая капля нейтрофильной суспензии выйдет из трубки. Вставьте трубку во входное отверстие. См. рисунок 7 для настройки.
7. Получение изображений
- Используйте функцию Scan Large Image в программном обеспечении для анализа изображений микроскопа (Таблица материалов) для получения карты адгезии в bMFA (рисунок 8) через 10 минут после начала эксперимента. Большинство нейтрофилов вводят bMFA в течение первых 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите флуоресцентный свет выключенным, когда вы не делаете снимки, чтобы уменьшить фотоотбеливание. - В течение следующего часа сделайте снимки таймлапса (1 изображение каждые 5 минут) тканевого компартмента (рисунок 8B, C) для анализа миграции, чтобы получить карту миграции.
8. Анализ цифровых изображений
- Для карты адгезии подсчитайте количество прилипших нейтрофилов в каждом сосуде. Для каждой бифуркации создайте круговую интересующую область (ROI) с диаметром, равным в два раза диаметру сосуда, и подсчитайте количество прилипших нейтрофилов.
- Используйте ручной подсчет или автоматизированную функцию подсчета объектов для количественной оценки количества прилипших нейтрофилов в каждом сосуде и области бифуркации.
- Используйте карту скорости сдвига сети, сгенерированную с помощью моделирования CFD17 , чтобы определить скорость сдвига в каждом судне. Затем отобразите количество прилипших нейтрофилов в данном сосуде против скорости сдвига в этом сосуде, чтобы создать карту скорости сдвига в bMFA, как показано на рисунке 9A.
- Нейтрофилы считаются мигрировавшими, если они пересекли эндотелий в тканевый компартмент. Подсчитывают количество мигрировавших нейтрофилов через 10 мин, 15 мин, 30 мин и 60 мин. График количества мигрировавших нейтрофилов по отношению ко времени, как показано на рисунке 9B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После 48 ч культуры под сдвиговым потоком в бМФА эндотелиальные клетки покрывали поверхность сосудистых каналов в бМФА и выравнивались в направлении течения (фиг.6). Конфокальная микроскопия показала, что все поверхности сосудистых каналов были покрыты эндотелиальными клетками, образующими полный 3D-просвет в bMFA18.
Используя этот протокол, можно получить карту адгезии нейтрофилов, показывающую, что существует значительная адгезия нейтрофилов к эндотелиальной клетке в bMFA (рисунок 8). Корреляция пространственного распределения нейтрофилов в этой карте адгезии с картой скорости сдвига, полученной из модели CFD, показывает, что адгезия нейтрофилов зависит от сдвига, а нейтрофилы предпочтительно придерживаются в областях низкой скорости сдвига и бифуркации (рисунок 9A). Адгезия нейтрофилов к TNF-α-активированным эндотелиальным клеткам значительно увеличилась. Анализ изображений таймлапса показал, что активация TNF-α эндотелиальных клеток увеличивает миграцию нейтрофилов в ответ на хемоаттрактантант fMLP (рисунок 9B). Как указано выше, bMFA может быть использован для быстрого тестирования эффективности нового терапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний. Например, лечение эндотелиальных клеток и нейтрофилов PKCδ-i значительно снижало адгезию и миграцию нейтрофилов (рисунок 9A,B)27.
Рисунок 1: Активация эндотелиальных клеток во время воспаления. (А) В нормальных условиях эндотелий сосудов покрывается гликокаликсом и образует плотный барьер, регулирующий барьерную проницаемость, миграцию лейкоцитов и противовоспалительную защиту. (B) Во время воспаления лейкоциты и эндотелиальные клетки активируются PAMPS и DAMPS для производства цитокинов и хемоаттрактантантов, что приводит к повышенной экспрессии поверхностных молекул как на лейкоцитах, так и на эндотелиальных клетках, усиливая взаимодействие лейкоцитов и эндотелия. Взаимодействия E/P-селектина на эндотелиальных клетках и их лигандах (например, PSGL-1) на лейкоцитах участвуют в катке, что замедляет нейтрофил. Твердая адгезия регулируется эндотелий-экспрессированными молекулами адгезии, включая ICAM-1, ICAM-2 и VCAM-1, и их лигандами, β2 интегринами. В ответ на градиенты хемоаттрактантанта прилипшие лейкоциты мигрируют через эндотелиальные соединения, регулируемые PECAM-1 и JAMs. Активированные лейкоциты мигрируют в ткань, где они высвобождают цитокины, активные формы кислорода / азота и протеазы для борьбы с инфекцией. Однако дисрегулируемая миграция лейкоцитов может повредить ткань органа, что приводит к органной недостаточности. Во время воспаления гликокаликс деградирует, повреждаются плотные соединения эндотелиальных клеток и усиливается апоптоз эндотелиальных клеток, что приводит к повреждению барьерной функции и повышению проницаемости. Эта цифра была изменена по сравнению с Yang et al.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обзор bMFA. (A) Изображения мышц кремастера мыши получены и (B) оцифрованы с использованием ГИС-системы для изготовления сети на PDMS. (C) Изображение яркого поля сети bMFA показывает, что в bMFA сосудистые каналы соединены с тканевым компартментом через барьер 3 мкм (схематическая вставка в панели C). Указано направление течения сосудистых каналов. (D) Чип bMFA, состоящий из слоя PDMS, связанного с предметным стеклом микроскопа, находится на стадии микроскопа. Трубка вставляется в два входных порта, два выходных порта и один порт тканевого отсека. (C: шкала = 500 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Исследования переходной перфузии, сравнивающие экспериментальные и имитационные результаты в bMFA. (A) Сеть bMFA, показывающая направление входа, выхода и потока. (B) Верхняя панель: профили перфузии CFD. Нижняя панель: Экспериментальные перфузионные профили. Изображения являются псевдоцветными, чтобы показать градиенты. Шкала нормализуется синим (без перфузии; 0) и пурпурным (полная перфузия; 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Профиль скорости и скорости сдвига в bMFA из моделирования CFD. (A) Распределение величин скорости (Vmag) по сети. (B) Распределение скорости сдвига указывает на гетерогенные скорости сдвига в сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Паттерны адгезии нейтрофилов в bMFA аналогичны паттернам адгезии нейтрофилов in vivo. Распределение числа прилипших нейтрофилов in vivo и числа нейтрофилов в bMFA смещено влево, что указывает на то, что нейтрофилы преимущественно придерживаются вблизи бифуркации, причем пик происходит на диаметре одного сосуда или канала от ближайшего бифуркации (среднее ± SEM; N = 3). Расстояние прилипших нейтрофилов до ближайшей бифуркации нормализовали следующим образом: нормализованное расстояние = расстояние до центра ближайшей бифуркации/диаметр канала. Эта цифра была изменена по сравнению с Lamberti et al.16 (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac5018716, дальнейшие разрешения, связанные с извлеченным материалом, должны быть направлены в Американское химическое общество). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Эндотелиальные клетки образуют полный 3D-просвет в bMFA. (A) Фазоконтрастные изображения показывают, что эндотелиальные клетки выстроены в направлении потока. (B) Флуоресцентные изображения показывают, что эндотелиальные клетки покрывают сосудистый канал; F-актин помечен зеленым цветом с использованием фаллоидина, а ядра помечены красным цветом с помощью Draq5. (A: шкала = 100 мкм, B: шкала = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Управляемый компьютером инвертированный флуоресцентный микроскоп используется для изучения нейтрофильных эндотелиальных взаимодействий в bMFA. Управляемая компьютером ступень с подогревателем используется для поддержания bMFA при 37 °C. bMFA подключается к программируемому шприцевому насосу через трубку. Инвертированный флуоресцентный микроскоп оснащен видеокамерой для получения изображений / видео для дальнейшего автономного анализа на компьютере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Репрезентативные изображения адгезии нейтрофилов и карты миграции. (A) Карта адгезии нейтрофилов в bMFA. Снимок был сделан через 10 минут после начала эксперимента с помощью функции «Сканировать большую карту» программного обеспечения Nikon. Белые точки на карте представляют собой флуоресцентно меченые нейтрофилы CFDA-SE. Граница сосудистого канала обозначена цифровым способом (шкала = 100 мкм). (B) Карта миграции нейтрофилов в bMFA без активации TNF-α. Снимок был сделан через 60 минут после начала эксперимента. (C) Карта миграции нейтрофилов в bMFA с активацией TNF-α. Снимок был сделан через 60 минут после начала эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Паттерны адгезии нейтрофилов и миграции в бМФА во время воспаления. (A) Лечение TNF-α значительно увеличивало адгезию нейтрофилов человека к легочным микрососудистым эндотелиальным клеткам человека, что ингибировалось после лечения ингибитором PKCδ. Адгезия нейтрофилов происходила преимущественно в сосудах с низкой скоростью сдвига и вблизи бифуркации при бМФА. (B) В ответ на fMLP миграция нейтрофилов человека через TNF-α активированные эндотелиальные клетки была значительно увеличена по сравнению с необработанными клетками. Лечение ингибитором PKCδ уменьшало миграцию к необработанным уровням. n = 4, среднее ± SEM, односторонняя ANOVA, ** p < 0,01 и *** p < 0,001). Рисунок был изменен по сравнению с Soroush et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Шаг 1: Постоянная скорость | Комментарии | |
| Режим | Настаивать | |
| Расход | 1 мкл/мин | |
| Время | 10 мин | |
| Шаг 2: Задержка (без потока) | ||
| Режим | Задержка | |
| Время | 4 ч | |
| Шаг 3: Повторите | Шаги 1 и 2 будут повторены 6 раз перед переходом к шагу 4. | |
| Режим | Повторять | |
| Повторить из | Шаг 1 | |
| Повторять | 6 раз | |
| Шаг 4: Постоянный расход | ||
| Режим | Настаивать | |
| Расход | 0,1 мкл/мин | |
| Время | 48 ч |
Таблица 1: Программа шприцевого насоса
| Формула | Имя | МВТ | Добавлять | Концентрация | 10-кратный буфер HEPES (Добавьте воду DI до 1000 мл и отрегулируйте рН до 7,3. Разбавить до 1x перед использованием) |
| НаКл | Хлорид натрия | 58.44 | 87,66 г | 1,5 М | |
| КО | Едкое кали | 56.11 | 2,81 г | 50 мМ | |
| Хепес | Хепес | 238.3 | 23,83 г | 100 мМ | |
| МгКл2 | Хлорид магния | 203.31 | 2,44 г | 12 мМ | |
| КаКл2 | Хлорид кальция | 147.62 | 1,90 г | 12.9 мМ |
Таблица 2: Буферный состав HEPES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bMFA воспроизводит топографию и условия течения микрососудистых сетей in vivo и может быть использован для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток и функции эндотелия in vitro в физиологически реалистичных условиях. В микроциркуляторном русле мыши или человека геометрия микрососудистых сетей самоподобна и фрактальна, а число Рейнольдса << 1, указывая на то, что геометрия сосудов существенно не влияет на модели течения. Таким образом, bFMA может быть использован для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелия для различных видов, включая человека, хотя микроциркулятор мышц кремастера мыши был нанесен на карту для производства bMFA.
bMFA позволяет в режиме реального времени оценивать отдельные этапы каскада миграции нейтрофилов в одном анализе, включая прокатку, твердую адгезию, распространение и миграцию нейтрофилов в тканевый компартмент. Первичные клетки человека и клинически значимые образцы могут быть использованы в bMFA для повышения переводимости и быстрого скрининга потенциальных терапевтических средств. По сравнению с традиционными жидкостными системами, такими как параллельные пластинчатые проточные камеры, bMFA имеет преимущество в использовании менее 95% реагентов37 из-за его небольших размеров сосудов и того факта, что он может изучать весь каскад миграции нейтрофилов за один анализ. Однако этот небольшой размер также требует от пользователей работы с очень небольшим объемом реагентов, что может быть сложной задачей и требует обширной практики. Наиболее распространенной проблемой этого протокола является наличие пузырьков воздуха в bMFA, которые могут блокировать канал и изменять модели потока. Поэтому следует проявлять большую осторожность при снятии или вставке трубок в порты, и капля воды должна быть помещена в основание трубки в портах, чтобы предотвратить попадание воздуха в канал всякий раз, когда трубка удаляется из bMFA.
В дополнение к применению bMFA для изучения нейтрофильных эндотелиальных взаимодействий, bMFA также использовался для изучения целостности эндотелия во время воспаления путем измерения таких переменных, как проницаемость и трансэндотелиальная эндотелиальная резистентность (TEER)27. Кроме того, путем функционализации микрочастиц специфическими антителами, bMFA может быть использован для изучения экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках27. Было продемонстрировано, что воспалительная реакция также может быть повышена другими стимулами в bMFA, такими как ионизирующее излучение, и bMFA был использован для изучения радиационно-индуцированного повреждения эндотелиальных клеток и нейтрофильных эндотелиальных взаимодействий29. Другим преимуществом этого устройства является то, что эндотелиальные клетки, нейтрофилы и/или другие клетки крови или частицы, несущие лекарственное средство, могут быть выделены из микрососудистых каналов и/или тканевого компартмента для дальнейшего анализа. Кроме того, клетки/частицы, которые не взаимодействовали с эндотелиальными клетками в устройстве, могут быть выделены из сточных вод, выходящих из устройства. Перициты и соответствующие типы тканей также могут быть культивированы в устройстве, чтобы лучше представлять условия in vivo . В заключение, протокол, представленный здесь, обеспечивает физиологически значимую среду в bMFA для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток во время воспаления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения, номер гранта: GM114359 и GM134701 (M.F.K. и L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), и Агентством по уменьшению угрозы обороны, номер гранта: HDTRA11910012 (M.F.K. и L.E.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biomimetic microfluidic assay (bMFA) | SynVivo | SMN1-C001 | Exclusive at SynVivo |
| Blunt needle | Jensen Global | JG24-0.5 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C70-500 | |
| CFDA, SE | ThermoFisher | C1157 | |
| Dextran, 250,000, Powder | Spectrum Chemical Mfg. Corp | DE-130 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Health Care | 17-5442-02 | Leukocyte isolation media |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506 | |
| Hepes | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| Human fibronectin | Fisher Scientific | 33-016-015 | use vendor recommended ECM for different cell lines |
| Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | cc-3202 | Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC). |
| Human lung microvascular endothelial cells | Lonza | cc-2527 | use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments Inc. | Microscope | |
| NIS-elements, 5.20.01 | Nikon Instruments Inc. | Imaging software | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21040CV | |
| PhD Ultra Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | Syringe Pump |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 02-003-763 | |
| Recombinant Human TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA | |
| Slide clamp | SynVivo | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Synvivo Pneumatic Primer | SynVivo | ||
| Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS) | Lonza | cc-5034 | |
| Tygon tubing | Fisher Scientific | 50-206-8921 | Tubing |
References
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770 (2021).
- Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
- Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
- Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
- Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
- Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
- Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
- Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
- Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
- Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
- Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
- Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
- Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
- Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
- Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
- Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725 (2015).
- Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
- Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
- Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
- Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171 (2018).
- Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309 (2018).
- Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
- Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
- Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
- Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379 (2018).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025 (2014).
