Summary
Настоящий протокол описывает разработку воспроизводимой испытательной платформы для мышиных шейк бедренной кости в консольной изгибающей установке. Пользовательские 3D-печатные направляющие использовались для последовательной и жесткой фиксации бедренных костей в оптимальном выравнивании.
Abstract
Переломы шейки бедра являются распространенным явлением у лиц с остеопорозом. Многие мышиные модели были разработаны для оценки болезненных состояний и методов лечения, с биомеханическим тестированием в качестве основного показателя результата. Тем не менее, традиционные биомеханические испытания сосредоточены на испытаниях на кручение или изгиб, применяемых к среднему валу длинных костей. Это, как правило, не место переломов высокого риска у людей с остеопорозом. Поэтому был разработан протокол биомеханического тестирования, который проверяет шейки бедренных костей мышей в консольной изгибающей нагрузке, чтобы лучше воспроизвести типы переломов, испытываемых пациентами с остеопорозом. Поскольку биомеханические результаты сильно зависят от направления изгиба нагрузки относительно шейки бедра, были созданы 3D-печатные направляющие для поддержания бедренного вала под углом 20° относительно направления нагрузки. Новый протокол упростил тестирование за счет снижения вариабельности выравнивания (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) и улучшил воспроизводимость в измеренных биомеханических исходах (средний COV = 26,7%). Новый подход с использованием 3D-печатных направляющих для надежного выравнивания образцов повышает строгость и воспроизводимость за счет уменьшения погрешностей измерения из-за смещения образцов, что должно свести к минимуму размеры выборки в исследованиях остеопороза на мышах.
Introduction
Риск переломов является серьезной медицинской проблемой, связанной с остеопорозом. Более 1,5 миллиона переломов хрупкости регистрируются каждый год только в Соединенных Штатах, причем переломы происходят в бедре, особенно в шейке бедра, в качестве ведущего типа переломов 1. По оценкам, 18% женщин и 6% мужчин испытают перелом шейки бедра в течение своей жизни2, а уровень смертности через 1 год после перелома превышает 20%1. Поэтому мышиные модели, позволяющие проводить биомеханическое тестирование шейки бедренной кости, могут быть пригодны для изучения переломов хрупкости. Мышиные модели также предлагают мощные инструменты для выяснения транслируемых клеточных и молекулярных событий, потенциально связанных с остеопорозом. Это связано с наличием генетических репортеров, приобретением и потерей функциональных моделей и обширной библиотекой молекулярных методов и реагентов. Механическое тестирование костей мышей может обеспечить необходимые показатели исхода для определения здоровья костей, генотипических и фенотипических вариаций, которые могут объяснить этиологию заболевания, и оценить терапию на основе показателей результатов качества кости и риска перелома3.
Анатомия шейки бедра создает уникальные сценарии механической нагрузки, которые обычно приводят к изгибающим (изгибающим) переломам. Головка бедренной кости нагружается в вертлужной впадины на проксимальном конце бедренной кости. Это создает консольный сценарий изгиба на шейке бедренной кости, которая жестко прикреплена к бедренному валу дистально4. Это отличается от традиционных 3- или 4-точечных тестов на сгибание бедренной кости в середине диафиза. Хотя эти тесты полезны, они не воспроизводят нагрузку, которая обычно приводит к переломам хрупкости у остеопенических и остеопоротических людей с точки зрения местоположения перелома или сценария нагрузки.
Чтобы лучше оценить риск переломов хрупкости у мышей, было предпринято стремление улучшить воспроизводимость консольных тестов на сгибание мышиных шейк бедренной кости. Как теоретически предсказано, угол нагрузки на головку бедренной кости относительно бедренного вала, как было показано, значительно влияет на показатели исхода5, тем самым создавая проблему для надежности и воспроизводимости сообщаемых результатов. Для обеспечения правильного и последовательного выравнивания бедренных костей во время пробоподготовки были разработаны направляющие и напечатаны на 3D-принтере на основе анатомических измерений, сделанных на μCT-сканировании бедренных костей мышей C57BL/6. Направляющие были разработаны, чтобы помочь в последовательной заливке образцов таким образом, чтобы бедренный вал поддерживался на уровне ~ 20 ° от вертикального направления нагрузки. Этот угол был выбран потому, что он максимизирует жесткость при минимизации максимального изгибающего момента вдоль бедренного вала, что увеличивает вероятность переломов шейки бедра и приводит к более последовательному и воспроизводимому тестированию5. Направляющие были напечатаны на 3D-принтере различных размеров для размещения анатомических различий между образцами и использовались для удержания образцов в стабильном положении во время горшка в акриловом костном цементе. Жесткость, максимальная сила, предел текучести и максимальная энергия были рассчитаны из графиков силы-смещения. Этот метод тестирования показал последовательные результаты для вышеупомянутого биомеханического результата. С практикой и помощью 3D-печатного руководства ошибки измерения из-за перекоса могут быть сведены к минимуму, что приводит к надежным показателям результата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных были одобрены Комитетом по ресурсам животных Университета Рочестера. Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами и самками C57BL/6 в возрасте от 24 до 29 недель. Мышей содержали в стандартных условиях с пищей и водой ad libitum. После эвтаназии с помощью вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки 20 правых бедренных костей (10 мужских и 10 женских) были собраны и заморожены при -20 ° C до тестирования.
1. Создание пользовательских 3D-печатных монтажных направляющих
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть необходим, потому что разные штаммы и генетические фенотипы могут иметь разную анатомическую геометрию.
- Получение μCT-сканов репрезентативных образцов.
- Сканируйте репрезентативные образцы на сканере μCT со следующими настройками: 55 кВ, 145 мкА в течение времени интеграции 300 мс и разрешением 10,5 мкм вокселей.
- Убедитесь, что захваченная область покрывает проксимальный конец бедренной кости и продолжается вниз через средний вал.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сканер μCT недоступен, можно использовать 2D-планарные рентгеновские снимки репрезентативных образцов.
- Анализ сканирования μCT.
- Используя репрезентативный набор μCT-сканирований, получите 2D-рендеринг переднего вида проксимальной бедренной кости.
- Получение μCT изображений с разрешением 10,5 мкм вокселей от среднего вала до проксимального конца бедренной кости. Скомпилируйте эти фрагменты с помощью программного обеспечения (см. Таблицу материалов) в 3D-рендеринг образца.
- Определите порог для отличия кости от окружающих тканей и примените гауссов фильтр для снижения шума.
- Ориентируйте 3D-рендеринг, чтобы исключить наклон вне оси и обеспечить просмотр передней поверхности бедренной кости.
- Экспортируйте это 2D-представление 3D-рендеринга в виде файла изображения, например .jpg или .png.
- Используя программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов), измерьте угол бедренного вала, проведя линию, перпендикулярную бедренному валу 7 мм дистально, и вторую линию через пик большего трохантера до средней точки вышеупомянутой перпендикулярной линии (рисунок 1).
- Вдоль дистальной перпендикулярной линии 7 мм измерьте диаметр бедренного вала ниже третьего трохантера.
- Используя репрезентативный набор μCT-сканирований, получите 2D-рендеринг переднего вида проксимальной бедренной кости.
Рисунок 1: анализ μCT. μCT изображения бедренных костей мышей C57Bl/6 используются для расчета среднего угла вала, измеренного от верхней части большего трохантера через центр среднего вала, ~7 мм дистально. Диаметр среднего вала также измерялся в этом положении. 3D-визуализации проксимальной бедренной кости были ориентированы на передний вид для отображения профиля третьего трохантера. Средний угол вала составлял 93,13° (SD = 1,19°), а средний диаметр среднего вала составлял 1,53 мм (SD = 0,14 мм) (n = 20). Шкала = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Создайте направляющие для монтажа с помощью программного обеспечения для 3D-моделирования (см. Таблицу материалов) (рисунок 2, дополнительный файл 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющие представляют собой прямоугольные кубоиды размером 6,25 мм x 3,25 мм x 7 мм с угловой прорезью, немного превышающей средний диаметр вала, определенный на этапе 1.1.2. Угол прорези создаст постоянный угол 20° от вертикали. Направляющие должны быть последовательными по длине, высоте и ширине, но могут быть изготовлены с различными диаметрами пазов для размещения анатомических различий между образцами кости.
Рисунок 2: Проектирование направляющих. (A) 3D-эскиз и (B) визуализация крепления для сгибания среднего вала перед 3D-печатью. Основываясь на предыдущей литературе, угол среднего вала между 20° максимизирует жесткость. Это минимизирует максимальный момент изгиба в бедренном валу, чтобы обеспечить переломы в шее и изменчивость механических результатов5. Чтобы компенсировать отклонение на 3,13° от перпендикуляра в средних углах среднего вала, угол крепления был установлен на 73,13° для получения угла 20°. Светильники для выравнивания печатались с диаметром от 1,9 до 2,2 мм, чтобы обеспечить надлежащую посадку для различных диаметров среднего вала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- С помощью 3D-принтера распечатайте направляющие. Направляющие могут оставаться включенными во время процесса тестирования, поэтому печать нескольких реплик направляющих может быть полезна для подготовки нескольких образцов одновременно.
2. Пробоподготовка
- Соберите бедренные кости мыши, сделав поперечный разрез полностью вокруг брюшка мыши и удалив ткань от разреза до лодыжек. После этого найдите тазобедренную впадину и осторожно используйте кончик пары тонких щипцов, чтобы вывихнуть бедро. Отрежьте дополнительные мягкие ткани, чтобы удалить ногу у мыши.
- После того, как нога собрана, используйте скальпель, чтобы вывихнуть и разрезать коленный сустав. Вручную очистите бедренные кости всех мягких тканей с помощью щипцов, скальпелей и бумажных полотенец.
- Немедленно протестируйте собранные образцы или храните их при температуре -20 °C в течение 6 месяцев. Если образцы заморожены, дайте им достичь комнатной температуры и увлажнить в PBS в течение 2 часов перед приготовлением.
- Используя квадратные алюминиевые трубки размером 1/4" x 1/4" (см. Таблицу материалов), режьте секции труб длиной от 1/2" до 1 дюйма. Используя инструмент для травления, пометьте каждый алюминиевый сегмент идентификаторами образцов.
- Заполните половину сегментов трубки шпаклевкой. Поместите эти сегменты трубки в приспособление, чтобы держать их в вертикальном положении.
- Поместите очищенные бедренные кости в 3D-печатные направляющие. Для этого поместите образцы плоско на столешницу так, чтобы передняя поверхность была обращена вверх. Поместите направляющую непосредственно под третьим трохантером, где диаметр вала становится более последовательным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставит ~ 7 мм проксимальной бедренной кости над направляющей. - Чтобы бедренная кость не вращалась в боковую или медиальную сторону при размещении на направляющей, удерживайте проксимальный и дистальный концы одной рукой при нанесении направляющих, плотно прижмите бедренную кость к верстаку и другой рукой поместите 3D-печатную направляющую на средний вал бедренной кости. Убедитесь, что направляющая соответствующего диаметра аккуратно применяется, так как средний вал бедренной кости может защелкнуться, если вставить в направляющую слишком маленькую.
- Как только направляющие окажутся на бедренных костях, поместите их перед соответствующими алюминиевыми сегментами. Используя костный цемент или другие упрочняющие агенты, заполните алюминиевые сегменты до тех пор, пока они не будут заполнены, оставив немного места для смещения.
- Поместите бедренные кости с направляющими в правильный алюминиевый сегмент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющие не будут центрированы на алюминиевых сегментах, расположенных немного в одной стороне, чтобы дистальный конец бедренной кости сидел в центре алюминиевого горшка. - Разрешите установку закалочного агента. После установки поместите образцы в чашку Петри с фосфатно-буферным физиологическим раствором комнатной температуры (PBS) и дайте регидратировать в течение 2 ч (рисунок 3).
Рисунок 3: Пробоподготовка с использованием пользовательских приспособлений и рыболовных приспособлений. (A) Образцы в алюминиевых горшках с надлежащим выравниванием поддерживаются с использованием 3D-печатных направляющих во время высыхания костного цемента. (B) Рентген перед тестированием показывает тень рыболовных приспособлений и полное покрытие костного цемента, окружающего дистальный конец бедренной кости. Насыщенная белая область на дне алюминиевых горшков — шпаклевка, используемая для удержания костного цемента в горшках при затвердевании. Шкала (панель B) = 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Настройка оборудования
- Используя механическую испытательную систему (МТС), прикрепите и откалибруйте тензодатчик с разрешением <1 Н (см. Таблицу материалов) (рисунок 4А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тензодатчик может быть установлен на сцене или, предпочтительно, на приводе, когда это возможно. - Прикрепите светильник с квадратным пазом, который будет прочно удерживать алюминиевые сегменты с образцами. Прикрепите установленные винты к обеим сторонам удерживающего приспособления, чтобы прочно удерживать образцы на месте. (Рисунок 4В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это приспособление может быть напечатано на 3D-принтере или обработано, а затем нарезано резьбовыми отверстиями для крепления к испытательной раме. - Прикрепите загрузочный валик к приводу. Это может быть просто конический винт со сплющенным наконечником (рисунок 4C).
- Поместите стереомикроскоп на стол или поверхность прямо перед МТС. Если требуется дополнительное освещение, чтобы увидеть настройку через микроскоп, разместите их вокруг системы.
Рисунок 4: Аппаратная настройка. (A) Настройка тестирования на механической испытательной системе с тензодатчиком 1 кН (разрешение < 1 Н) и черной двухосной ступенью для обеспечения правильного позиционирования образца. (B) Крупный план 3D-печатного монтажного приспособления, прикрепленного к тензодатчику с резьбовым стержнем M10 и двумя болтами M4, используемыми для удержания алюминиевого горшка на месте. (C) Просмотр образца через стереомикроскоп с коническим загрузочным приспособлением. Шкала (Панель C) = 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Настройка программного обеспечения
- В программном обеспечении МТС начните создание нового изгибающего (изгибающего) протокола. Обеспечить, чтобы протокол действовал при контроле перемещения.
- Установите скорость загрузки протокола на 0,5 мм/с.
- Если в программе есть настройка для программных клавиш, добавьте в протокол программные клавиши «Balance» и «Zero Extension».
ПРИМЕЧАНИЕ: Это быстро установит нагрузку и положение привода равным 0 перед тестированием каждого образца. - Убедитесь, что программное обеспечение будет записывать время в секундах, нагрузку в ньютонах и расширение или смещение в миллиметрах при минимальной частоте дискретизации 100 Гц.
- Сохраните новый протокол и вернитесь на главный экран программы, чтобы начать тестирование нового набора образцов.
5. Настройка тестирования
- Перед установкой образцов на МТС получите рентгеновское изображение образцов в алюминиевых горшках. Несколько образцов могут быть изображены одновременно. Убедитесь, что передний вид образцов захвачен для проведения контрольных измерений угла заливки (рисунок 5).
Рисунок 5. Оценка выравнивания выборки. (A) Угол вала от вертикали измеряется с помощью плоских цифровых рентгеновских лучей. (B) Репрезентативные углы бедренного вала в горшках варьировались от 18,11° до 23,99° с коэффициентом изменения (COV) 7,1% (n = 20). Половые различия, обусловленные анатомическими вариациями, не были статистически значимыми, что было определено с использованием однохвостого непарного т-теста (p < 0,05). Шкала (панель A) = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Поместите алюминиевый сегмент с образцом в удерживающий фиксатор и затяните установленные винты.
- Опустите привод / нагрузочный валик до тех пор, пока он не окажется в пределах нескольких миллиметров от головки бедренной кости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не загружайте образец с каким-либо усилием и будьте осторожны, чтобы не опустить привод слишком быстро, так как очень легко повредить образцы. - Используя стереомикроскоп, отрегулируйте двухосную ступень, чтобы выровнять положение головки бедренной кости непосредственно под нагрузочным валиком. Блокировка двухосной ступени на месте.
- В программном обеспечении МТС обнулите положение привода и балансируйте тензодатчик с помощью программных клавиш, добавленных на шаге 4.3.
- Запустите протокол загрузки. В зависимости от того, сколько места осталось между загрузочным валиком и образцом, тестирование займет всего 10-30 с.
- После тестирования захватите еще один передний рентгеновский снимок образца. Это будет использоваться для определения и документирования режима разрушения (рисунок 6).
Рисунок 6: Рентгеновское изображение образцов после тестирования. Все образцы раздроблены в раздвоенной линии через шейку бедра и вдоль крепления шейки бедра-ствола (выделены оранжевым кругом). Шкала = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
6. Анализ данных
- После сбора данных экспортируйте данные о силе и перемещении в программное обеспечение (см. Таблицу материалов), которое позволяет строить графики и математические расчеты.
- Построение графика нагрузки и. смещение для каждого образца (рисунок 7А). Установите линейное приближение к линейному отрезку кривой нагрузка-смещение. Наклон этой линейной посадки будет определять жесткость, меру упругости образца.
- Рассчитайте дополнительные результаты, такие как максимальная нагрузка, максимальное смещение, предел текучести, смещение в точке текучести, энергия до максимальной нагрузки и энергия до точки текучести.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предел текучести может быть определен путем смещения линейного приближения, определенного на шаге 6.2, на 0,2%6. Точка, в которой смещенная линия и нагрузка vs. Пересечение кривой смещения определит температуру текучести. В случае очень хрупких образцов, которые показывают небольшой выход, температура текучести может быть такой же, как и максимальная точка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При горшке с помощью направляющей бедренные валы выравнивались на 21,6° ± 1,5°. Хотя это представляет собой отклонение <10% от предполагаемого угла 20°, коэффициенты вариации (COV) угла горшка во всех тестируемых образцах составили 7,6% и 6,5% для самцов и самок мышей, соответственно (n = 10 на группу), что подтверждается предварительным тестированием планарных рентгеновских лучей (рисунок 5). Кроме того, рентгеновские снимки после тестирования должны использоваться для оценки режима, в котором образцы потерпели неудачу. Недостаточность последовательно наблюдалась в шейке бедренной кости, как и предполагалось, в раздвоенном виде, с одной линией перелома, параллельной бедренному валу, а другой линией, перпендикулярной шейке бедренной кости (рисунок 6). Если бы произошли значительные изменения в структуре разрушения среди образцов, то качество кости образцов можно было бы дополнительно оценить с помощью μCT путем измерения таких результатов, как объемная минеральная плотность кости, толщина трабекулярной и корковой костей, расстояние и минерализация. Если сбой не вызывается последовательно в шейке бедра, 3D-печатные направляющие могут быть скорректированы.
Биомеханические показатели исхода, представленные в настоящем описании, согласуются со значениями, сообщенными в аналогичном осевом изгибе конфигураций шейки бедренной кости7,8,9,10,11,12,13,14. Однако последовательное выравнивание, достигнутое с использованием 3D-печатных направляющих, как правило, улучшало COV максимальной нагрузки, в частности (таблица 1).
| Текущее исследование | Секс | Угол среднего вала | Максимальная нагрузка | Жесткость | Работа до отказа |
| Мужской | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Женский | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Мужской | НР | 22% | НР | НР |
| Jämsä et al8 | Мужской | НР | 19% | НР | НР |
| Камаль и др.9 | Женский | НР | 16%-25% | 11%-28% | НР |
| Миддлтон и др.7 | Женский | НР | 24%-27% | НР | НР |
| Brent et al11 | Самки - крысы | НР | 18%-24% | НР | НР |
| Бромер и др.12* | Женский | НР | 11%-27% | НР | НР |
| Vegger et al13* | Женский | НР | 16%-32% | НР | НР |
| Лодберг14* | Женский | НР | 11%-45% | НР | НР |
| NR: Не сообщается | |||||
| *: Данные, экстраполированные из опубликованных данных | |||||
Таблица 1: Коэффициенты вариации для измеренных изгибных свойств шейки бедренной кости мыши. Коэффициенты вариации представляют собой отношение стандартного отклонения и среднего значения набора данных. По мере снижения COV это указывает на более жесткую группировку отдельных точек данных вокруг среднего значения. Этот протокол снижал COV для максимальной нагрузки по сравнению с другими публикациями, выполняющими аналогичное тестирование.
Как и ожидалось, половые различия наблюдались в измеренных механических свойствах. Статистический анализ проводился с использованием однохвостого непарного Т-теста. Шейки бедра у самцов мышей были значительно прочнее и жестче, чем у самок мышей (p = 0,009 и p = 0,0006 соответственно). Кроме того, женские шейки бедренной кости испытывали более значительные деформации (p = 0,014) и работали до отказа (p = 0,024) по сравнению с образцами самцов мышей (рисунок 7). Это согласуется с более низкой минеральной плотностью костной ткани у женщин и подчеркивает чувствительность теста для выявления физиологически значимых различий. В когортах самцов и самок мышей, использованных в этом исследовании, минеральная плотность костной ткани самок мышей была значительно ниже, чем у их коллег-самцов, что было определено двухэнергетическим рентгеновским абсорбциометрическим сканированием (DEXA) и однохвостым непарным t-тестом (p = 0,036).
Рисунок 7: Биомеханические результаты. (A) Репрезентативная кривая смещения силы и смещения, показывающая линейную подгонку смещения 0,2%, используется для получения жесткости и температуры текучести. Выбранные показатели результатов строятся на точечном графике, отображающем среднее и стандартное отклонение, включая (B) максимальную нагрузку (при отказе), (C) жесткость, (D) максимальное смещение (при отказе) и (E) работу до отказа (область под кривой до точки отказа). Звездочки указывают на существенные различия, определяемые с помощью однохвостого непарного t-теста (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 на когорту полов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы подтвердить, что незначительные изменения угла горшка не способствовали экспериментальной изменчивости, каждая биомеханическая мера исхода была построена по отношению к углу горшка и выполнена простая линейная регрессия для мужской когорты, женской когорты и всех образцов, сгруппированных вместе (рисунок 8). Затем была проверена гипотеза о том, что наклон линейной регрессии не равен нулю. Регрессионный анализ показал, что, за исключением жесткости, незначительные изменения угла горшка (диапазон от 18° до 24°) не повлияли на показатели биомеханического исхода. Для жесткости наблюдалась значительная линейная корреляция с углом горшка (R2 = 0,29, p < 0,05).
Рисунок 8: Влияние угла горшка на биомеханические результаты. Биомеханические показатели исхода, включая (A) максимальную нагрузку, (B) жесткость, (C) максимальное смещение и (D) работу до отказа, были построены на основе угла горшка и коррелированы с использованием простой линейной регрессии для мужской когорты, женской когорты и всех образцов, сгруппированных вместе. Сплошные черные линии показывают линейную регрессию сгруппированных выборок, с пунктирными линиями, указывающими на доверительные интервалы. Изменчивость угла заливки существенно не влияла на максимальную нагрузку, максимальное смещение или работу по отказу. Однако по мере увеличения угла горшка жесткость увеличивалась, что определялось тестом Пирсона (p = 0,0126, n = 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Стандартный язык треугольника (. STL) файл руководств. Этот файл можно использовать для печати руководств, описанных в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает надежный консольный тест на сгибание мышиной шейки бедренной кости. Сценарий естественного консольного изгиба, который происходит на шейке бедра, обычно не представлен в стандартных 3- и 4-точечных тестах на изгиб5. Этот метод тестирования лучше и надежнее воспроизводит тип переломов шейки бедра, с которыми сталкиваются пациенты с хрупкостью костей. Основным направлением при выполнении этого протокола является устранение изменчивости из-за непоследовательного горшок бедренного вала. Важно отметить, что тщательное следование шагам, изложенным в первом и четвертом разделах протокола, обеспечит повторение того, что при создании руководств и протокола загрузки будет воспроизводиться то, о чем сообщается в настоящей публикации. Как можно теоретически предсказать и показать экспериментально, угол среднего вала относительно оси нагрузки может влиять на напряжения, испытываемые шейкой бедра, и вероятность того, что перелом произойдет на шейке бедра. Предыдущие группы продемонстрировали, что угол среднего вала значительно влияет на сжимающую жесткость и прочность бедренной кости при нагрузке через головку бедренной кости. Параметрический анализ влияния углов наклона среднего вала показал, что максимальные изгибающие моменты в бедренных валах испытывают минимум при углах среднего вала между 15° и 25°, что также максимизирует жесткость вала5. Такой угол, таким образом, минимизирует вероятность компрессионных переломов в валу и увеличивает вероятность переломов изгиба шейки бедра.
Несколько параметров могут повлиять на результаты любого биомеханического теста и смешать способность обнаруживать значительные различия из-за физиологически значимых экспериментальных переменных. Эта изменчивость усугубляется небольшим размером длинных костей мыши. Среди параметров, требующих внимания в данном тесте, в частности, количество циклов замораживания-оттаивания и состояние гидратации кости, скорость нагрузки, выравнивание бедренного вала относительно оси нагрузки. Протокол предусматривает, что все образцы проходят одинаковое количество циклов замораживания-оттаивания и 2-часовое окно для гидратации в PBS при комнатной температуре. Скорость загрузки также устанавливается на равномерное значение 0,5 мм/с3,4. Кроме того, 3D-печатные направляющие были разработаны для последовательного позиционирования бедренной кости под углом среднего вала ~ 20 ° во время шага горшка. Это привело к постоянным углам средних валов в диапазоне от 18° до 24°, без каких-либо значительных половых эффектов из-за анатомических различий и коэффициентов вариации 7,6% и 6,5% для самцов и самок мышей, соответственно. Эти руководства доступны, легко модифицируются с помощью стандартного программного обеспечения для твердотельного моделирования и воспроизводятся по требованию с помощью недорогого настольного 3D-принтера.
Репрезентативные результаты показали, что протокол тестирования чувствителен к тонким физиологическим различиям, таким как пол, с разумным размером выборки n = 10. Ретроспективный анализ мощности, учитывающий экспериментально определенные эффекты размера (δ = Δmean/SD) при n = 10, показал, что мощность оценивается в 57% для максимальной нагрузки при отказе (δ = 0,8), >95% для жесткости (δ = 1,77) и максимального смещения (δ = 1,9) и 83% для работы до отказа (δ = 1,77), соответственно. Наряду с малыми коэффициентами вариации (таблица 1), этот анализ мощности подтверждает, что изменение угла заливки отрицательно сказалось на чувствительности и надежности протокола.
Субъективный анализ способа отказа также показал, что 100% тестируемых образцов потерпели неудачу в шейке бедра, так как все они показали раздвоенный перелом, причем одна линия перелома проходит параллельно валу в месте, где она встречается с шеей, а другая линия перелома перпендикулярна шейке бедренной кости на вершине бифуркации. Это включает в себя особенности двух клинически значимых режимов переломов шейки бедра; интертрохантерические и трансцервикальные переломы шейки15. Консольные тесты на сгибание шейки бедренной кости не так широко используются и описываются в литературе, как стандартные испытания на кручение или изгиб бедренной и большеберцовой средних валов у грызунов в моделях остеопороза. Только несколько исследований были идентифицированы для описания таких протоколов с использованием моделей мышей и крыс5,7,8,9,16,17. Угол, под которым бедренные кости были расположены во время тестирования, не всегда сообщается. Некоторые с подробными описаниями используют чрезмерное количество пользовательских приспособлений и программного обеспечения для выравнивания своих образцов5, но все же прибегают к горшку вручную, внося ту же человеческую ошибку в другие протоколы.
Этот протокол предназначен для образцов мышей и предназначен для мышей C57Bl/6, но может быть легко адаптирован к моделям крупных животных или другим штаммам мышей с различной геометрией бедренной кости. Будущим исследователям, использующим этот протокол, возможно, придется изменить количество обнаженной кости, так как третий трохантер может быть не точно в 7 мм дистально от головки бедренной кости. Дополнительные модификации протокола включают использование закалочного агента, который может быть смягчен после тестирования для высвобождения образца, если требуется дальнейшее тестирование. Это может быть сделано с помощью сплава висмута, который может быть расплавлен в ванне с горячей водой после тестирования для высвобождения образца7. Окончательная модификация, которую пользователи могут внести в этот протокол, ускользает от шага 3.1, являясь типом и расположением тензодатчика. Следует использовать осевой тензодатчик с разрешением ниже 1 Н. Тензодатчик мощностью 50 Н будет целесообразным исходя из максимальных наблюдаемых нагрузок. Кроме того, следует использовать тензодатчик, который измеряет только растяжение или сжатие, чтобы избежать любого сложного изгибающего момента, который тензодатчик может испытывать от эксцентрической нагрузки относительно тензодатчика. Другим способом избежать измерения силы соединения может быть фиксация тензодатчика к приводу, чтобы убедиться, что усилие нагрузки находится на одном уровне с тензодатчиком.
Этот протокол упрощает необходимость в пользовательских приспособлениях, описывает, как направляющие могут быть напечатаны на любом коммерчески доступном 3D-принтере, и использует общее лабораторное оборудование для тщательного и воспроизводимого тестирования образцов, о чем свидетельствуют более низкие коэффициенты вариации, о которых сообщается в текущем исследовании (таблица 1). Однако этот протокол не ограничен необходимостью 3D-принтера. Существуют коммерчески доступные решения, где файлы 3D-рендеринга могут быть отправлены в полиграфические компании, а детали могут быть отправлены обратно. Кроме того, этот режим изгибающей нагрузки на шейку бедра имитирует местоположение и типы клинически встречающихся переломов. Учитывая число людей с высоким риском переломов хрупкости, прогнозируется, что к 205018 году будет происходить более 21,3 миллиона переломов шейки бедра каждый год. Огромное социальное, финансовое и медицинское бремя, которое это создает, надежное тестирование на моделях грызунов может улучшить строгость и воспроизводимость исследований, направленных на понимание этиологии остеопороза и терапевтических средств для его эффективного лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование было поддержано NIH P30AR069655 и R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
