Summary
Mevcut protokol, bir kantilever bükme kurulumunda murine femoral boyunlar için tekrarlanabilir bir test platformunun geliştirilmesini açıklamaktadır. Femurları optimum hizalamada tutarlı ve sert bir şekilde sabitlemek için özel 3D baskılı kılavuzlar kullanılmıştır.
Abstract
Femoral boyundaki kırıklar osteoporozlu bireylerde sık görülen bir durumdur. Birçok fare modeli, birincil sonuç ölçüsü olarak biyomekanik testlerle hastalık durumlarını ve tedavilerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, geleneksel biyomekanik testler, uzun kemiklerin orta mili için uygulanan burulma veya bükme testlerine odaklanır. Bu tipik olarak osteoporotik bireylerde yüksek riskli kırıkların yeri değildir. Bu nedenle, osteoporoz hastalarının yaşadığı kırık türlerini daha iyi çoğaltmak için kantilever bükme yüklemesinde murin femurların femoral boyunlarını test eden bir biyomekanik test protokolü geliştirilmiştir. Biyomekanik sonuçlar femoral boyuna göre bükülmesel yükleme yönüne oldukça bağlı olduğundan, yükleme yönüne göre 20 ° açıyla femoral bir şaft tutmak için 3D baskılı kılavuzlar oluşturulmuştur. Yeni protokol, hizalamadaki değişkenliği (21,6° ± 1,5°, COV = %7,1, n = 20) ve ölçülen biyomekanik sonuçlarda (ortalama COV = %26,7) geliştirilmiş tekrarlanabilirliği azaltarak testi kolaylaştırdı. Güvenilir numune hizalaması için 3D baskılı kılavuzları kullanan yeni yaklaşım, osteoporoz fare çalışmalarında örnek boyutlarını en aza indirmesi gereken numune yanlış hizalaması nedeniyle ölçüm hatalarını azaltarak titizliği ve tekrarlanabilirliği artırır.
Introduction
Kırık riski osteoporoz ile ilişkili ciddi bir tıbbi endişedir. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 1,5 milyondan fazla kırılganlık kırığı rapor edilir ve kalçada, özellikle femoral boyunda kırıklar meydana gelmektedir. Kadınların %18'inin, erkeklerin ise %6'sının yaşamları boyunca femoral boyun kırığı yaşayacağı tahmin edilmektedir2 ve kırığı takip eden 1 yıldaki ölüm oranı %20'den fazladır 1. Bu nedenle, femoral boynun biyomekanik testine izin veren fare modelleri kırılganlık kırıklarını incelemek için uygun olabilir. Fare modelleri ayrıca osteoporozda potansiyel olarak yer alan çevrilebilir hücresel ve moleküler olayları aydınlatmak için güçlü araçlar sunar. Bunun nedeni genetik muhabirlerin mevcudiyeti, fonksiyon modellerinin kazanımı ve kaybı ve moleküler teknikler ve reaktiflerin geniş kütüphanesidir. Fare kemiklerinin mekanik testleri, hastalığın etiyolojisini açıklayabilecek kemik sağlığı, genotipik ve fenotipik varyasyonları belirlemek ve kemik kalitesinin ve kırılma riskinin sonuç ölçülerine dayanarak tedavileri değerlendirmek için gerekli sonuç önlemlerini sağlayabilir3.
Femoral boynun anatomisi, tipik olarak bükülme (bükülme) kırıklarına yol açan benzersiz mekanik yükleme senaryoları oluşturur. Femoral kafa, uyluk kemiğinin proksimal ucundaki asetabuler sokete yüklenir. Bu, femoral şafta sert bir şekilde bağlı olan femoral boyunda bir kantilever bükme senaryosu oluşturur4. Bu, femoral orta diafiz üzerinde yapılan geleneksel 3 veya 4 noktalı bükme testlerinden farklıdır. Bu testler yararlı olmakla birlikte, osteopenik ve osteoporotik bireylerde tipik olarak kırılganlık kırıklarına yol açan yüklemeyi kırık yeri veya yükleme senaryosu açısından çoğaltmaz.
Farelerde kırılganlık kırığı riskini daha iyi değerlendirmek için, murine femoral boyunların kantilever bükme testlerinin tekrarlanabilirliğini artırmaya çalışılmıştı. Teorik olarak tahmin edildiği gibi, femoral şafta göre femoral kafadaki yükleme açısının sonuç ölçülerini önemli ölçüde etkilediği gösterilmiştir5, böylece bildirilen sonuçların güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği için bir zorluk yaratmıştır. Numune hazırlama sırasında uyluk kemiğinin doğru ve tutarlı hizalamasını sağlamak için kılavuzlar tasarlanmış ve C57BL/6 fare uyluk kemiğinin μCT taramalarında yapılan anatomik ölçümlere dayanarak 3D baskı yapılmıştır. Kılavuzlar, femoral şaftın dikey yükleme yönünden ~20° olarak muhafaza edildiği şekilde numunelerin sürekli olarak saksılanmasına yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu açı, femoral şaft boyunca maksimum bükme momentini en aza indirirken sertliği en üst düzeye çıkarırken, femoral boyun kırıkları olasılığını artırdığı ve daha tutarlı ve tekrarlanabilir testlere yol açtığı için seçildi5. Kılavuzlar, numuneler arasındaki anatomik farklılıkları karşılamak için çeşitli boyutlarda 3D olarak basıldı ve akrilik kemik çimentosunda saksı yaparken numuneleri sabit bir konumda tutmak için kullanıldı. Sertlik, maksimum kuvvet, verim kuvveti ve maksimum enerji kuvvet-yer değiştirme grafiklerinden hesaplanmıştır. Bu test yöntemi, yukarıda belirtilen biyomekanik sonuç için tutarlı sonuçlar göstermiştir. Uygulama ve 3D baskılı kılavuzun yardımıyla, yanlış hizalama nedeniyle ölçüm hataları en aza indirilebilir ve bu da güvenilir sonuç önlemlerine neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmada kullanılan fareler 24-29 haftalık yaşları arasında C57BL/6 erkek ve dişiydi. Fareler yiyecek ve su reklam libitum ile standart koşullarda barındırıldı. Karbondioksit soluma yoluyla ötanazi ve ardından servikal çıkık üzerine, 20 sağ uyluk kemiği (10 erkek ve 10 kadın) hasat edildi ve test edilene kadar -20 °C'de donduruldu.
1. Özel 3D baskılı montaj kılavuzlarının oluşturulması
NOT: Farklı suşlar ve genetik fenotipler farklı anatomik geometrilere sahip olabileceğinden bu adım gerekebilir.
- Temsili numunelerin μCT taramalarını alın.
- μCT tarayıcıdaki temsili örnekleri aşağıdaki ayarlarla tarayın: 300 ms entegrasyon süreleri için 55 kV, 145 μA ve 10,5 μm voksel çözünürlüğ.
- Yakalanan bölgenin uyluk kemiğinin proksimal ucunun kapladığından ve orta mil boyunca aşağı doğru devam ettiğinden emin olun.
NOT: μCT tarayıcı kullanılamıyorsa, temsili numunelerin 2D düzlemsal X ışınları kullanılabilir.
- μCT taramalarını analiz edin.
- Temsili μCT tarama kümesini kullanarak, proksimal femurun ön görünümünün 2D görüntüsünü elde edin.
- Orta milden uyluk kemiğinin proksimal ucuna kadar 10,5 μm voksel çözünürlüğe sahip μCT görüntüler elde edin. Bu dilimleri yazılımı kullanarak derleyin (bkz. Malzeme Tablosu) örneğin 3D işlemesine.
- Kemiği çevreleyen dokudan ayırmak için bir eşik belirleyin ve gürültü azaltma için gauss filtresi uygulayın.
- Eksen dışı eğimi ortadan kaldırmak ve uyluk ön yüzeyinin görüntülendiğinden emin olmak için 3D işlemeleri yönlendirin.
- 3D işlemenin bu 2D görünümünü .jpg veya .png gibi bir görüntü dosyası olarak dışa aktar.
- Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), femoral şafta dik bir çizgi çizerek femoral şaft açısını ölçün 7 mm distally ve büyük trokanterin zirvesinden yukarıda belirtilen dik çizginin orta noktasına ikinci bir çizgi çizin (Şekil 1).
- 7 mm distal dik hat boyunca, üçüncü trokanterin altındaki femoral şaft çapını ölçün.
- Temsili μCT tarama kümesini kullanarak, proksimal femurun ön görünümünün 2D görüntüsünü elde edin.
Şekil 1: μCT analizi. C57Bl/ 6 farelerin uyluklarının μCT görüntüleri, büyük trokanterin tepesinden orta milin merkezinden ölçülen ortalama mil açısını hesaplamak için kullanılır, ~7 mm distally. Orta mil çapı da bu konumda ölçüldü. Proksimal uyluk kemiğinin 3D işlemeleri, üçüncü trokanterin profilini görüntülemek için ön görünümde yönlendirildi. Ortalama mil açısı 93,13° (SD = 1,19°) ve ortalama orta mil çapı 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20) idi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- 3B modelleme yazılım programını kullanarak montaj kılavuzları oluşturun (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 2, Tamamlayıcı Dosya 1).
NOT: Kılavuzlar, 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm açılı yuvaya sahip dikdörtgen küboidlerdir ve 1,1,2 adımda belirlenen ortalama mil çapından biraz daha büyüktür. Yuvanın açısı dikeyden 20 ° tutarlı bir açı yaratacaktır. Kılavuzlar uzunluk, yükseklik ve genişlik açısından tutarlı olmalıdır, ancak kemik örnekleri arasındaki anatomik farklılıkları karşılamak için çeşitli yuva çaplarıyla yapılabilir.
Şekil 2: Kılavuzların tasarlanması. (A) 3D çizim ve (B) 3D baskıdan önce orta mil angling fikstürünün görselleştirilmesi. Önceki literatüre dayanarak, 20 ° arasındaki bir orta mil açısı sertliği en üst düzeye çıkarır. Boyunda kırıklar oluşmasını ve mekanik sonuçlarda değişkenlik sağlamak için femoral şafttaki maksimum bükülme momentini en aza indirir5. Orta mil ortalama açılarında dikten 3,13° sapmayı telafi etmek için fikstür açısı 20° açı üretmek için 73,13° olarak ayarlandı. Hizalama armatürleri, değişen orta mil çaplarına uygun bir uyum sağlamak için 1,9-2,2 mm arasında değişen çaplarda basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- 3D yazıcı kullanarak kılavuzları yazdırın. Kılavuzlar test işlemi sırasında açık kalabilir, bu nedenle kılavuzların birden çok çoğaltmasını yazdırmak aynı anda birden fazla örnek hazırlamak için yararlı olabilir.
2. Numune hazırlama
- Tamamen fare karnının etrafında enine bir kesi yaparak ve kesiden ayak bileklerine kadar olan dokuyu çıkararak fare uyluk kemiğini hasat edin. Bunu takiben, kalça soketini bulun ve kalçayı çıkarmak için bir çift ince asanın ucunu dikkatlice kullanın. Bacağı fareden çıkarmak için ek yumuşak dokuyu kesin.
- Bacak hasat edildikten sonra, diz eklemini yerinden çıkarmak ve kesmek için bir neşter kullanın. Tüm yumuşak dokuların uyluk kemiğini neşter, neşter ve kağıt havlu kullanarak manuel olarak temizleyin.
- Hasat edilen numuneleri hemen test edin veya 6 aya kadar -20 °C'de saklayın. Numuneler donmuşsa, oda sıcaklığına gelmelerine izin verin ve hazırlamadan önce PBS'de 2 saat nemlendirin.
- 1/4" x 1/4" kare alüminyum boru kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), boru bölümlerini 1/2 ila 1" uzunluğunda kesin. Bir gravür aracı kullanarak, her alüminyum segmenti örnek kimliklerle etiketleyin.
- Boru parçalarının yarısını macunla doldurun. Bu boru parçalarını dik tutmak için bir fikstüre yerleştirin.
- Temizlenen uylukları 3D baskılı kılavuzlara yerleştirin. Bunu yapmak için, ön yüzey yukarı bakacak şekilde numuneleri tezgah üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Kılavuzu, mil çapının daha tutarlı hale geldiği üçüncü trochanter'ın hemen altına yerleştirin.
NOT: Bu, kılavuzun üzerinde ~7mm proksimal uyluk kemiği bırakacaktır. - Kılavuza yerleştirirken uyluk kemiğinin yanal veya medial tarafa dönmesini önlemek için, kılavuzları uygularken proksimal ve distal uçları bir elinizle tutun, uyluk kemiğini tezgahın üzerine sıkıca bastırın ve diğer elinizi kullanarak, 3D baskılı kılavuzu femurun orta mili üzerine yerleştirin. Uyluk kemiğinin orta mili çok küçük bir kılavuza zorlanırsa yapışabileceğinden, uygun çap kılavuzunu nazikçe uyguladığından emin olun.
- Kılavuzlar uyluk kemiği üzerine girdikten sonra, ilgili alüminyum segmentlerin önüne yerleştirin. Kemik çimentosu veya diğer sertleştirici maddeler kullanarak, alüminyum parçaları sadece dolana kadar doldurun ve yer değiştirme için biraz yer bırakın.
- Uyluk kemiğini doğru alüminyum segmente kılavuzlu yerleştirin.
NOT: Kılavuzlar alüminyum parçalara ortalanmayacaktır, uyluk kemiğinin distal ucunun alüminyum tencerenin ortasına oturmasını sağlamak için bir tarafa hafifçe oturtulacaktır. - Sertleştirme maddesinin ayar yapmasına izin verin. Ayarlandıktan sonra, numuneleri oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına yerleştirin ve 2 saat boyunca yeniden sulandırın (Şekil 3).
Şekil 3: Özel jigs ve olta armatürleri kullanarak örnek hazırlama. (A) Alüminyum saksılardaki numuneler, kemik çimentosu kururken 3D baskılı kılavuzlar kullanılarak korunur. (B) Test öncesi röntgen, olta armatürlerinin gölgesini ve uyluk kemiğinin distal ucunun etrafındaki kemik çimentosunun tam kapsamını gösterir. Alüminyum saksıların altındaki doymuş beyaz alan macundur, sertleşirken kemik çimentosunu saksılarda tutmak için kullanılır. Ölçek çubuğu (Panel B) = 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Donanım kurulumu
- Mekanik test sistemi (MTS) kullanarak, <1 N çözünürlüğe sahip bir yük hücresi takın ve kalibre edin (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 4A).
NOT: Yük hücresi sahne alanına veya tercihen mümkün olduğunda aktüatöre monte edilebilir. - Alüminyum parçaları numunelerle sıkıca tutacak kare bir yuvaya bir fikstür takın. Numuneleri sıkıca yerinde tutmak için tutma fikstürünün iki tarafına set vidaları takın. (Şekil 4B).
NOT: Bu fikstür 3D baskılı veya işlenmiş olabilir ve daha sonra test çerçevesine monte etmek için dişli vida delikleri ile dokunabilir. - Aktüatöre bir yükleme plakası takın. Bu sadece düzleştirilmiş uçlu konik bir vida olabilir (Şekil 4C).
- Mts'nin hemen önündeki bir masaya veya yüzeye stereomikroskop yerleştirin. Kurulumu mikroskoptan görmek için ek aydınlatma gerekiyorsa, bunları sistemin etrafına yerleştirin.
Şekil 4: Donanım kurulumu. (A) Uygun numune konumlandırmasını sağlamak için 1 kN yük hücresi (çözünürlük < 1 N) ve siyah biaksiyel aşama ile mekanik test sistemi üzerinde test kurulumu. (B) Yük hücresine bağlı 3D baskılı montaj fikstürünü, alüminyum tencereyi yerinde tutmak için kullanılan bir M10 dişli çubuk ve iki M4 cıvata ile kapatın. (C) Numunenin konik yükleme fikstürü ile stereo mikroskopla görüntülenmesi. Ölçek çubuğu (Panel C) = 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Yazılım kurulumu
- MTS yazılımında, yeni bir fleksural (bükme) protokolünün oluşturulmasına başlayın. Protokolün yer değiştirme denetiminde çalışacağından emin olun.
- Protokolün yükleme hızını 0,5 mm/s olarak ayarlayın.
- Yazılımın yumuşak tuşlar için bir ayarı varsa, protokole "Denge" ve "Sıfır Uzantı" yumuşak tuşlarını ekleyin.
NOT: Bu, her numuneyi test etmeden önce yük ve aktüatör konumunu hızla 0 olarak ayarlar. - Yazılım programının süreyi saniyeler içinde kaydedeceğinden, Newton'lara yüklendiğinden ve en az 100 Hz örnekleme hızında milimetre cinsinden uzatma veya yer değiştirme yapacağından emin olun.
- Yeni protokolü kaydedin ve yeni bir örnek kümesini test etmeye başlamak için yazılım programının ana ekranına dönün.
5. Kurulum testi
- Numuneleri MTS'ye monte etmeden önce, alüminyum saksılardaki numunelerin X-ışını görüntüsünü elde edin. Aynı anda birden fazla örnek görüntülenebilir. Saksı açısının doğrulanmasına izin vermek için numunelerin ön görünümünün yakalandığından emin olun (Şekil 5).
Şekil 5. Örnek hizalamanın değerlendirilmesi. (A) Dikeyden mil açısı düzlemsal dijital x ışınlarından ölçülür. (B) Temsili saksı femoral şaft açıları 18,11° ile 23,99° arasında değişmektedir ve değişim katsayısı (COV) %7,1 'dir (n = 20). Anatomik varyasyonlara bağlı cinsiyet farklılıkları, tek kuyruklu eşleşmeyen bir t-testi kullanılarak belirlendiği için istatistiksel olarak anlamlı değildi (p < 0.05). Ölçek çubuğu (Panel A) = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Alüminyum segmenti numune ile tutma fikstürüne yerleştirin ve set vidalarını sıkın.
- Uyluk kafasının birkaç milimetre içinde olana kadar daha düşük aktüatör / yükleme plakası.
NOT: Numuneyi herhangi bir kuvvetle önceden yüklemeyin ve numunelere zarar vermek çok kolay olduğu için aktüatörü çok hızlı indirmemeye dikkat edin. - Stereomikroskopu kullanarak, femoral başlığın konumunu doğrudan yükleme plakasının altına hizalamak için biaksiyel aşamayı ayarlayın. Biaksiyel aşamayı yerine kilitleyin.
- MTS yazılımında, aktüatör konumunu sıfırleyin ve adım 4.3'te eklenen yumuşak tuşları kullanarak yük hücresini dengeleyin.
- Yükleme iletişim kuralına başlayın. Yükleme plakası ve numune arasında ne kadar boşluk kaldığına bağlı olarak, test sadece 10-30 s sürecektir.
- Test ettikten sonra, numunenin başka bir ön röntgenini yakalayın. Bu, kırılma şeklini ayırt etmek ve belgelemek için kullanılacaktır (Şekil 6).
Şekil 6: Testlerden sonra örneklerin X-ray görüntüsü. Tüm numuneler uyluk boynundan ve femoral boyun şaft ataşmanı boyunca (turuncu daire ile vurgulanır) iki çatallı bir çizgide kırılmıştır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Veri analizi
- Veri toplama, dışa aktarma kuvveti ve yer değiştirme verilerini grafik ve matematiksel hesaplamalara izin veren yazılıma (bkz. Malzeme Tablosu) verin.
- Yükün çizimi vs. her örnek için yer değiştirme (Şekil 7A). Yük öteleme eğrisinin doğrusal segmentine doğrusal bir yaklaşım takın. Bu doğrusal uyumun eğimi, numunenin esnekliğinin bir ölçüsü olan sertliği tanımlayacaktır.
- Maksimum yük, maksimum yer değiştirme, verim yükü, verim noktasında yer değiştirme, maksimum yüke enerji ve verim noktasına enerji gibi ek sonuçları hesaplayın.
NOT: Verim noktası, 6.2 adımında belirlenen doğrusal yaklaşık ayarın %0,2%6'ya ayarlanmasıyla belirlenebilir. Set dışı hattın ve yükün karşı karşıya geldiği nokta. yer değiştirme eğrisi kesişirse verim noktası belirlenir. Çok az verim gösteren çok kırılgan numunelerde, verim noktası maksimum nokta ile aynı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kılavuz yardımıyla saksıya alındığında, femoral şaftlar 21,6° ± 1,5 ° 'de hizalandı. Bu, hedeflenen 20° açıdan %10 sapma < temsil ederken, test edilen tüm numunelerde saksı açısının değişim katsayıları (COV) test öncesi düzlemsel röntgenlerle doğrulandığı gibi erkek ve dişi fareler için sırasıyla %7,6 ve %6,5 idi (grup başına n = 10). Ayrıca, test sonrası X ışınları, örneklerin başarısız olduğu modu değerlendirmek için kullanılmalıdır. Başarısızlık, amaçlandığı gibi femoral boyunlarda, bir kırık çizgisi femoral şafta paralel, diğer hattı femoral boyuna dik olarak, iki çatallı bir şekilde sürekli olarak gözlenmiştir (Şekil 6). Numuneler arasında kırılma düzeninde önemli farklılıklar meydana gelirse, hacimsel kemik mineral yoğunluğu, trabeküler ve kortikal kalınlık, aralık ve mineralizasyon gibi sonuçlar ölçülerek numunelerin kemik kalitesi μCT ile daha fazla değerlendirilebilir. Femoral boyunda sürekli olarak başarısızlık indüklenmezse, 3D baskılı kılavuzlar ayarlanabilir.
Burada bildirilen biyomekanik sonuç önlemleri, femoral boyun konfigürasyonlarının benzer eksenel bükülmesinde bildirilen değerlerle tutarlıdır7,8,9,10,11,12,13,14. Bununla birlikte, 3D baskılı kılavuzlar kullanılarak elde edilen tutarlı hizalama genellikle özellikle maksimum yükün COV'sını iyileştirdi (Tablo 1).
| Güncel çalışma | Seks | Orta Mil Açısı | Maksimum Yük | Rijitlik | Başarısızlığa kadar çalışma |
| Erkek | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Dişi | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsğve ark. | Erkek | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsğve diğerleri | Erkek | NR | 19% | NR | NR |
| Kamal ve al9 | Dişi | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| Middleton ve diğerleri | Dişi | NR | 24%-27% | NR | NR |
| Brent ve ark11 | Dişi - sıçanlar | NR | 18%-24% | NR | NR |
| Bromer ve diğerleri 12* | Dişi | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger ve diğerleri 13* | Dişi | NR | 16%-32% | NR | NR |
| Lodberg14* | Dişi | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: Bildirilmedi | |||||
| *: Yayınlanan rakamlardan elde edilen veriler | |||||
Tablo 1: Fare femoral boyunlarının ölçülen fleksöral özellikleri için varyasyon katsayıları. Değişim katsayıları, bir veri kümesinin standart sapma ve ortalama oranını temsil eder. COV azaldıkça, bu, ortalamanın etrafındaki tek tek veri noktalarının daha sıkı bir gruplandırmasını gösterir. Bu protokol, benzer sınama yapan diğer yayınlara kıyasla maksimum yük için COV'yi azalttı.
Beklendiği gibi, ölçülen mekanik özelliklerde cinsiyet farklılıkları gözlendi. İstatistiksel analizler tek kuyruklu eşleşmeyen bir t-testi kullanılarak yapıldı. Erkek farelerden femoral boyunlar dişi farelerden alınan örneklerden önemli ölçüde daha güçlü ve sertti (sırasıyla p = 0.009 ve p = 0.0006). Ek olarak, dişi femoral boyunlar daha önemli deformasyonlar yaşadı (p = 0.014) ve erkek farelerden alınan örneklere kıyasla başarısızlıkla çalıştı (p = 0.024). Bu, kadınlarda daha düşük kemik mineral yoğunluğu ile tutarlıdır ve fizyolojik olarak ilgili farklılıkları tespit etmek için testin hassasiyetinin altını çizer. Bu çalışmada kullanılan erkek ve dişi fare kohortlarında, dişi farelerin kemik mineral yoğunluğu, çift enerjili X-ışını absorptiometri taraması (DEXA) ve tek kuyruklu eşleşmeyen t-testi (p = 0.036) ile belirlendiği gibi erkek meslektaşlarından önemli ölçüde daha düşüktü.
Şekil 7: Biyomekanik sonuçlar. (A) Sertlik ve verim noktasını türetmek için %0,2 ofset doğrusal uyumu gösteren temsili kuvvet-yer değiştirme eğrisi kullanılır. Seçilen sonuç ölçüleri, (B) maksimum yük (hatada), (C) sertliği, (D) maksimum yer değiştirme (hatada) ve (E) hataya (eğrinin altındaki alan arıza noktasına kadar olan alan) dahil olmak üzere ortalama ve standart sapmayı gösteren dağılım çizilir. Yıldız işaretleri, tek kuyruklu eşleşmeyen bir t-testi kullanılarak belirlenen önemli farklılıkları gösterir (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n = 10 cinsiyet kohort başına). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Saksı açısındaki hafif varyasyonların deneysel değişkenliğe katkıda bulunmadığını doğrulamak için, her biyomekanik sonuç ölçüsü saksı açısına göre çizildi ve erkek kohort, kadın kohort ve birlikte gruplanmış tüm örnekler için basit bir doğrusal regresyon gerçekleştirdi (Şekil 8). Hipotez daha sonra doğrusal regresyon eğiminin sıfır olmadığı test edildi. Regresyon analizi, sertlik dışında, saksı açısındaki (18° ila 24 ° arasında) hafif varyasyonların biyomekanik sonuç önlemlerini etkilemediğini göstermiştir. Sertlik için saksı açısı ile anlamlı doğrusal korelasyon vardı (R2 = 0.29, p < 0.05).
Şekil 8: Saksı açısının biyomekanik sonuçlar üzerindeki etkisi. (A) maksimum yük, (B) sertlik, (C) maksimum yer değiştirme ve (D) başarısızlıkla çalışma dahil olmak üzere biyomekanik sonuç ölçümleri saksı açısına göre çizildi ve erkek kohort, kadın kohort ve birlikte gruplandırılmış tüm örnekler için basit bir doğrusal regresyon kullanılarak ilişkilendirildi. Düz siyah çizgiler, gruplandırılmış örneklerin doğrusal regresyonunu gösterir ve güven aralıklarını gösteren noktalı çizgiler gösterir. Saksı açısındaki değişkenlik maksimum yükü, maksimum yer değiştirmeyi veya arıza çalışmasını önemli ölçüde etkilemedi. Bununla birlikte, saksı açısı arttıkça, pearson testi ile belirlenen sertlik arttı (p = 0.0126, n = 20). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tamamlayıcı Dosya 1: Standart Üçgen Dili (. STL) dosyasını kullanarak kılavuzları kullanmaktadır. Bu dosya, protokolde açıklanan kılavuzları yazdırmak için kullanılabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, murine femoral boyunlar için güvenilir bir kantilever bükme testine ana hatlarıyla bakmaktadır. Femoral boyunda meydana gelen doğal kantilever fleksür senaryosu tipik olarak standart 3 ve 4 nokta bükme testlerinde temsil değildir5. Bu test yöntemi daha iyi ve daha güvenilir bir şekilde kemik kırılganlığı hastalarının yaşadığı femoral boyun kırıklarının tipini çoğaltır. Bu protokolü gerçekleştirirken ana odak noktası, femoral şaftın tutarsız saksısı nedeniyle değişkenliği ortadan kaldırmaktır. Kritik olarak, protokolün birinci ve dördüncü bölümlerinde özetlenen adımları yakından takip etmek, kılavuzların oluşturulmasını ve yükleme protokolünün bu yayında bildirilenleri çoğaltmasını sağlayacaktır. Teorik olarak tahmin edilebileceği ve deneysel olarak gösterileceği gibi, yükleme eksenine göre orta mil açısı, femoral boynun yaşadığı stresleri ve kırığın uyluk boynunda oluşma olasılığını etkileyebilir. Önceki gruplar, orta mil açısının uyluk kemiğinden yüklendiğinde uyluk kemiğinin basınç sertliğini ve mukavemetini önemli ölçüde etkilediğini göstermiştir. Orta mil eğim açılarının etkilerinin parametrik analizi, femoral şaftlardaki maksimum bükülme anlarının 15 ° ile 25 ° arasında orta mil açılarında minimum deneyim yaşadığını ve bu da şaft sertliğini en üst düzeye çıkarır5. Bu nedenle bu açı, şafttaki kompresyon kırıklarının olasılığını en aza indirir ve femoral boyundaki fleksöral kırık olasılığını arttırır.
Çeşitli parametreler herhangi bir biyomekanik testin sonuçlarını etkileyebilir ve fizyolojik olarak ilgili deneysel değişkenler nedeniyle önemli farklılıkları tespit etme yeteneğini şaşırtabilir. Bu değişkenlik, uzun fare kemiklerinin küçük boyutu ile birleşir. Bu testte dikkat gerektiren parametreler arasında, özellikle, kemiğin donma-çözülme döngülerinin sayısı ve hidrasyon durumu, yükleme oranı ve femoral şaftın yükleme eksenine göre hizalanması vardır. Protokol, tüm numunelerin aynı sayıda donma-çözülme döngüsünden ve oda sıcaklığında PBS'de hidrasyon için 2 saatlik bir pencereden gitmesini şart koşar. Yükleme hızı da 0,5 mm/s3,4 tekdüze bir değere ayarlanmıştır. Ayrıca, 3D baskılı kılavuzlar, uyluk kemiğini saksı adımı sırasında ~20° orta mil açısında tutarlı bir şekilde konumlandırmak için tasarlanmıştır. Bu, anatomik farklılıklar ve erkek ve dişi fareler için sırasıyla% 7.6 ve% 6.5 varyasyon katsayıları nedeniyle önemli bir cinsiyet etkisi olmadan, 18 ° ila 24 ° aralığında tutarlı orta mil açılarına neden oldu. Bu kılavuzlara erişilebilir, standart katı modelleme yazılımı kullanılarak kolayca değiştirilebilir ve ucuz bir masaüstü 3D yazıcı kullanılarak isteğe bağlı olarak yeniden üretilir.
Temsili sonuçlar, test protokolünün makul bir örnek boyutu n = 10 olan seks gibi ince fizyolojik farklılıklara duyarlı olduğunu göstermiştir. n = 10'da deneysel olarak belirlenen boyut etkilerini (δ = Δmean/SD) oluşturan retrospektif güç analizi, gücün arıza sırasındaki maksimum yük için% 57 olarak tahmin edildiğini öne sürdü (δ = 0,8 >95% sertlik (δ = 1.77) ve maksimum yer değiştirme (δ = 1.9) ve çalışmanın başarısız olması için% 83 (δ = 1.77), sırasıyla. Küçük değişim katsayıları (Tablo 1) ile birlikte, bu güç analizi, saksı açısındaki varyasyonun protokolün hassasiyetini ve güvenilirliğini olumsuz yönde etkilediğini doğrulamaktedir.
Başarısızlık modunun öznel analizi, test edilen örneklerin% 100'ünün uyluk boynunda başarısız olduğunu göstermiştir, çünkü hepsi bifurcated kırık göstermiştir, bir kırık çizgisi boynu karşıladığında şaftla paralel olarak çalışır ve başka bir kırık çizgisi çatallanmanın tepe noktasında femoral boyuna diktir. Bu, femoral boyun kırıklarının klinik olarak ilgili iki modundan özellikleri kapsar; intertrokanterik ve transervikal boyun kırıkları15. Femoral boyun kantilever bükme testleri literatürde osteoporozun kemirgen modellerinde femoral ve tibial midshaftların standart torsiyon veya fleksür testi kadar yaygın olarak kullanılmaz ve tarif edilir. Fare ve sıçan modelleri kullanarak bu tür protokolleri tanımlamak için sadece bir avuç çalışma belirlendi5,7,8,9,16,17. Test sırasında uyluk kemiğinin konumlandırılmış olduğu açı her zaman bildirilmez. Ayrıntılı açıklamalara sahip bazıları, örneklerini hizalamak için aşırı miktarda özel fikstür ve yazılım kullanır5, ancak yine de diğer protokollerde aynı insan hatasını ortaya çıkarmak için elle saksıya başvurur.
Bu protokol murine örnekleri için tasarlanmıştır ve C57Bl/6 fareler için belirtilmiştir, ancak büyük hayvan modellerine veya farklı femoral geometriye sahip diğer murin suşlarına kolayca uyarlanabilir. Bu protokolü kullanan gelecekteki araştırmacıların, üçüncü trokanter femoral kafadan tam olarak 7 mm distal olarak olmayabilir, çünkü maruz kalan kemik miktarını değiştirmeleri gerekebilir. Protokolde yapılan ek değişiklikler, daha fazla test isteniyorsa örneği serbest bırakmak için test sonrası yumuşatılabilen bir sertleştirme aracısı kullanmayı içerir. Bu, numuneyi serbest bırakmak için test edildikten sonra sıcak su banyosunda eritilebilen bir bizmut alaşımı ile yapılabilir7. Kullanıcıların bu protokolde yapabileceği son değişiklik, yük hücresinin türü ve konumlandırması olan 3.1 adımında atlanır. Alt 1 N çözünürlüğe sahip eksenel bir yük hücresi kullanılmalıdır. 50 N yük hücresi, gözlenen maksimum yüklere göre uygun olacaktır. Ayrıca, yük hücresinin yük hücresine göre eksantrik yüklemeden karşılaşabileceği herhangi bir bileşik bükme anını önlemek için yalnızca gerginliği veya sıkıştırmayı ölçen bir yük hücresi kullanılmalıdır. Bileşik kuvvet ölçümlerini önlemenin bir başka yolu, yükleme kuvvetinin yük hücresine uygun olduğundan emin olmak için yük hücresini aktüatöre sabitlemek olacaktır.
Bu protokol, özel fikstürlere olan ihtiyacı basitleştirir, kılavuzların piyasada bulunan herhangi bir 3D yazıcıya nasıl basabileceğini açıklar ve mevcut çalışmada bildirilen daha düşük değişim katsayılarında gösterildiği gibi örnekleri kapsamlı ve tekrar tekrar test etmek için ortak laboratuvar ekipmanlarını kullanır (Tablo 1). Ancak, bu iletişim kuralı 3D yazıcı gereksinimi ile kısıtlanmaz. 3D işleme dosyalarının baskı şirketlerine gönderilebileceği ve parçaların geri gönderilebileceği ticari olarak mevcut çözümler mevcuttur. Ek olarak, femoral boyuna bu bükme yükleme şekli, klinik olarak karşılaşılan kırıkların yerini ve türlerini simüle eder. Kırılganlık kırığı riski yüksek olan kişi sayısı ile 205018 yılına kadar her yıl 21,3 milyon kalça kırığı olacağı öngörülmektedir. Bunun oluşturduğu muazzam toplumsal, finansal ve tıbbi yük, kemirgen modellerinde güvenilir testler, etkili bir şekilde tedavi etmek için osteoporoz ve terapötiklerin etiyolojisini anlamaya yönelik araştırmaların titizliğini ve tekrarlanabilirliğini artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışma NIH P30AR069655 ve R01AR070613 (H. A. A.) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
