Summary
본 프로토콜은 캔틸레버 굽힘 설정에서 뮤린 대퇴목에 대한 재현 가능한 테스트 플랫폼의 개발을 설명합니다. 사용자 지정 3D 인쇄 가이드는 최적의 정렬로 대퇴골을 일관되고 엄격하게 고정하는 데 사용되었습니다.
Abstract
대퇴목의 골절은 골다공증을 가진 개별에서 일반적입니다. 많은 마우스 모형은 1 차적인 결과 측정으로 생체 기계시험을 가진 질병 상태 및 치료를 평가하기 위하여 개발되었습니다. 그러나 전통적인 생체 기계 테스트는 긴 뼈의 중간 축에 적용되는 비틀림 또는 굽힘 테스트에 중점을 둡니다. 이것은 일반적으로 골다공증 개별에 있는 고위험 골절의 사이트 아닙니다. 따라서, 골다공증 환자가 경험하는 골절의 유형을 더 잘 복제하기 위해 캔틸레버 굽힘 로딩에서 뮤린 대퇴골의 대퇴골목을 테스트하는 생체 기계적 테스트 프로토콜이 개발되었다. 생체 역학적 결과는 대퇴목에 비해 굴곡 적재 방향에 크게 의존하기 때문에, 3D 프린팅 가이드는 적재 방향에 비해 20° 각도로 대퇴 샤프트를 유지하기 위해 만들어졌습니다. 새로운 프로토콜은 정렬의 가변성을 감소시킴으로써 테스트를 간소화 (21.6 ° ± 1.5 °, COV = 7.1%, n = 20) 측정 된 생체 역학 결과 (평균 COV = 26.7 %). 신뢰할 수 있는 시편 정렬을 위한 3D 프린팅 가이드를 사용하는 새로운 접근 방식은 골다공증의 마우스 연구에서 샘플 크기를 최소화해야 하는 시편 정렬 불량으로 인한 측정 오류를 줄임으로써 엄격성과 재현성을 향상시킵니다.
Introduction
골절 위험은 골다공증과 관련된 심각한 의학적 관심사입니다. 150만 개 이상의 취약성 골절은 미국에서만 매년 보고되며, 엉덩이, 특히 대퇴목에서 주요 골절 유형1이 발생하는 골절이 발생합니다. 여성의 18%와 남성의 6%가 일생동안 대퇴목 골절을 경험할 것으로 추정되며, 골절 후 1년차 사망률은 20%1보다 큽습니다. 따라서 대퇴목의 생체 역학 적 테스트를 허용하는 마우스 모델은 취약성 골절을 연구하는 데 적합 할 수 있습니다. 마우스 모델은 또한 잠재적으로 골다공증에 관련된 번역 가능한 세포 및 분자 사건을 해명하기 위하여 강력한 공구를 제공합니다. 이것은 유전 기자의 가용성, 기능 모델의 이득 및 손실, 분자 기술 및 시약의 광대 한 라이브러리 때문입니다. 마우스 뼈의 기계적 테스트는 질병의 병인학을 설명할 수 있는 뼈 건강, 지장및 현상 변이를 결정하는 데 필요한 결과 측정을 제공하고, 뼈의 질과 골절의 위험의 결과 측정에 근거하여 치료를 평가할 수 있습니다3.
대퇴목의 해부학은 일반적으로 굴곡 (굽힘) 골절로 이어지는 독특한 기계적 적재 시나리오를 만듭니다. 대퇴골 머리는 대퇴골의 근간 끝에 있는 아세타큘러 소켓에 적재됩니다. 이것은 대퇴목의 캔틸레버 굽힘 시나리오를 생성하며, 이는 대퇴샤프트에 엄격하게 부착됩니다4. 이것은 대퇴골 중간 diaphysis에 전통적인 3- 또는 4 점 굽힘 시험과 다릅니다. 이러한 테스트는 도움이 되지만 일반적으로 골절 위치 또는 로딩 시나리오 측면에서 골다공증 및 골다공증 개인의 취약성 골절로 이어지는 로딩을 복제하지는 않습니다.
쥐의 취약성 골절 위험을 더 잘 평가하기 위해, 그것은 뮤린 대퇴목의 캔틸레버 굽힘 테스트의 재현성을 개선하기 위해 노력했다. 이론적으로 예측된 바와 같이, 대퇴샤프트에 비해 대퇴골 헤드의 적재각도가 결과측정값에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이로 인해 보고된 결과의 신뢰성과 재현성에 대한 도전이 생기다. 시료 준비 중 대퇴골의 적절하고 일관된 정렬을 보장하기 위해 C57BL/6 마우스 대퇴골의 μCT 스캔에 따라 3D 인쇄된 가이드를 설계했습니다. 가이드는 대퇴 샤프트가 수직 적재 방향에서 ~20° 유지되도록 일관되게 샘플을 포팅하는 데 도움을 주도록 설계되었습니다. 이 각도는 대퇴목 골절의 가능성을 높이고 보다 일관되고 재현 가능한 테스트5로 이어지는 대퇴골 샤프트를 따라 최대 굽힘 순간을 최소화하면서 강성을 극대화하기 때문에 선택되었습니다. 가이드는 샘플 간의 해부학적 차이를 수용하기 위해 다양한 크기로 3D 인쇄되었으며 아크릴 뼈 시멘트에서 포팅하는 동안 샘플을 안정적인 위치에 보관하는 데 사용되었습니다. 강성, 최대 힘, 수율 력 및 최대 에너지는 힘 변위 그래프에서 계산되었습니다. 이 테스트 방법은 전술한 생체 역학적 결과에 대한 일관된 결과를 보여주었다. 3D 프린팅 가이드의 연습과 도움으로 정렬 불량으로 인한 측정 오류를 최소화하여 신뢰할 수 있는 결과 측정을 할 수 있습니다.
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Protocol
동물 연구는 로체스터 동물 자원의 대학 위원회에 의해 승인되었다. 이 연구에서 사용된 마우스는 나이의 24-29 주에서 구역 수색하는 C57BL/6 남성과 여성이었습니다. 마우스는 음식과 물 광고 리비툼과 표준 조건에 보관되었다. 이산화탄소 흡입을 통한 안락사 시 자궁 경부 탈구가 이어졌고, 20개의 오른쪽 대퇴골(10명의 남성과 10마리 암컷)을 시험할 때까지 -20°C에서 수확및 냉동하였다.
1. 사용자 정의 3D 인쇄 장착 가이드의 생성
참고: 다른 균주와 유전 표현형이 다른 해부학 적 기하학을 가질 수 있기 때문에이 단계가 필요할 수 있습니다.
- 대표 시료의 μCT 스캔을 가져옵니다.
- 다음과 같은 설정으로 μCT 스캐너의 대표적인 샘플을 스캔합니다: 55 kV, 300ms 통합 시간에 대한 145 μA, 10.5 μm 복셀의 해상도.
- 캡처된 영역이 대퇴골의 근접 끝을 덮고 중간 축을 통해 아래로 계속되도록 합니다.
참고: μCT 스캐너를 사용할 수 없는 경우 대표 샘플의 2D 평면 엑스레이를 사용할 수 있습니다.
- μCT 스캔을 분석합니다.
- μCT 스캔의 대표적인 세트를 사용하여 근위 대퇴골의 전방 뷰의 2D 렌더링을 가져옵니다.
- 대퇴골의 근접 끝에 중간 축에서 10.5 μm 복셀의 해상도로 μCT 이미지를 가져옵니다. 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 이러한 조각을 샘플의 3D 렌더링으로 컴파일합니다.
- 주변 조직과 뼈를 구별하고 소음 감소를 위해 가우시안 필터를 적용하는 임계값을 결정합니다.
- 3D 렌더링을 정렬하여 축 경사를 제거하고 대퇴골의 전방 표면을 볼 수 있도록 합니다.
- 3D 렌더링의 이 2D 뷰를 .jpg 또는 .png 같은 이미지 파일로 내보냅니다.
- 이미지 분석 소프트웨어( 재료표 참조)를 사용하여 대모샤프트 7mm에 수직으로 선을 그리고 상기 수직선의 중간점에 큰 트로챈터의 피크를 통해 두 번째 선을 그려 대퇴 샤프트 각도를 측정한다(도 1).
- 7mm 단면 수직 선을 따라 세 번째 트로챈터 아래의 대퇴샤프트 직경을 측정합니다.
- μCT 스캔의 대표적인 세트를 사용하여 근위 대퇴골의 전방 뷰의 2D 렌더링을 가져옵니다.
도 1: μCT 분석. C57Bl/6 마우스의 대퇴골의 μCT 이미지는 중간축의 중심을 통해 더 큰 트로챈터의 상부에서 측정된 평균 샤프트 각도를 계산하는 데 사용되며, ~7mm 는 distally된다. 중간축 직경도 이 위치에서 측정되었다. 근위 대퇴골의 3D 렌더링은 전방 뷰에서 세 번째 트로챈터의 프로파일을 표시하기 위해 지향되었습니다. 평균 샤프트 각도는 93.13°(SD = 1.19°)였으며 평균 중간 축 직경은 1.53mm(SD = 0.14mm) (n = 20)였다. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 3D 모델링 소프트웨어 프로그램을 사용하여 장착 가이드를 만듭니다( 자료 표 참조) (그림 2, 보충 파일 1).
참고: 가이드는 각진 슬롯이 있는 6.25mm x 3.25mm x 7mm의 직사각형 큐비드로, 1.1.2단계에서 결정된 평균 샤프트 직경보다 약간 큽습니다. 슬롯의 각도는 수직에서 20°의 일관된 각도를 생성합니다. 가이드는 길이, 높이 및 너비에서 일관성이 있어야하지만 뼈 샘플 간의 해부학적 차이를 수용하기 위해 다양한 슬롯 직경으로 만들 수 있습니다.
그림 2: 가이드 설계. (A) 3D 스케치 및 (B) 3D 프린팅 전에 미드샤프트 앵글링 설비의 시각화. 이전 문헌에 기초하여, 20° 사이의 중간 축 각도는 강성을 극대화합니다. 대퇴샤프트의 최대 굽힘 순간을 최소화하여 목에서 골절이 발생하고 기계적 결과의 가변성을 보장합니다5. 중간축 평균 각도에서 수직에서 3.13° 편차를 보정하기 위해 고정 각도를 73.13°로 설정하여 20°의 각도를 생성했습니다. 정렬 설비는 다양한 미드샤프트 직경에 적합한 지름1.9-2.2mm로 인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 3D 프린터를 사용하여 가이드를 인쇄합니다. 가이드는 테스트 프로세스 중에 계속 유지될 수 있으므로 가이드의 여러 복제를 인쇄하는 것이 한 번에 여러 샘플을 준비하는 데 도움이 될 수 있습니다.
2. 샘플 준비
- 마우스 복부 주위에 완전히 횡절개를 하고 발목절개에서 조직에 대한 조직을 제거하여 마우스 대퇴골을 수확하십시오. 그 다음에는 엉덩이 소켓을 찾아 조심스럽게 미세 한 집게의 끝을 사용하여 엉덩이를 탈구하십시오. 마우스에서 다리를 제거하기 위해 추가 연조직을 잘라.
- 다리가 수확되면 메스를 사용하여 무릎 관절을 탈구하고 잘라냅니다. 집게, 메스, 종이 타월을 사용하여 모든 연조직의 대퇴골을 수동으로 청소하십시오.
- 수확한 샘플을 즉시 테스트하거나 최대 6개월 동안 -20°C에 보관하십시오. 샘플이 동결되면 준비하기 전에 PBS에서 실온에 와서 2 시간 동안 수분을 공급할 수 있습니다.
- 1/4" x 1/4" 정사각형 알루미늄 튜브( 재료 표 참조)를 사용하여 튜브 섹션을 1/2"에서 1"로 잘라냅니다. 에칭 도구를 사용하여 각 알루미늄 세그먼트에 샘플 ID로 레이블을 지정합니다.
- 튜브 세그먼트의 절반을 퍼티로 채웁니다. 이 튜브 세그먼트를 고정장치에 배치하여 똑바로 고정하십시오.
- 청소된 대퇴골을 3D 인쇄 가이드에 넣습니다. 이렇게 하려면 미리 표면이 위로 향하도록 샘플을 벤치탑에 평평하게 놓습니다. 샤프트 직경이 더 일관되게 되는 세 번째 트로챈터 바로 아래에 가이드를 배치합니다.
참고 : 이것은 가이드 위에 근위 대퇴골의 ~ 7mm를 둡니다. - 대퇴골이 가이드에 배치하는 동안 측면 또는 내측으로 회전하는 것을 방지하기 위해 가이드를 적용 할 때 근위와 단부 끝을 한 손으로 잡고 대퇴골을 작업벤치에 단단히 누르고 다른 손으로 는 대퇴골의 중간 축에 3D 인쇄 가이드를 배치하십시오. 대퇴골의 중간 축이 너무 작은 가이드에 강제로 들어갈 수 있기 때문에 적절한 직경 가이드를 부드럽게 적용하십시오.
- 가이드가 대퇴골에 들어가면 해당 알루미늄 세그먼트 앞에 배치하십시오. 뼈 시멘트 또는 기타 경화제는 알루미늄 세그먼트를 가득 채울 때까지 채우기 만하면 변위 공간이 약간 남습니다.
- 대퇴골을 가이드와 함께 올바른 알루미늄 세그먼트에 놓습니다.
참고: 가이드는 알루미늄 세그먼트를 중심으로 한 후, 대퇴골의 단부 끝이 알루미늄 냄비의 중앙에 앉을 수 있도록 약간 한쪽에 앉습니다. - 경화제를 설정하도록 허용합니다. 설정되면 샘플을 실온 인산염 완충식식염(PBS)이 있는 페트리 접시에 놓고 2시간 동안 다시 수분을 공급합니다(그림 3).
그림 3: 사용자 지정 지그와 앵글링 비품을 사용하여 샘플 준비. (A) 적절한 정렬을 가진 알루미늄 냄비의 샘플은 뼈 시멘트가 건조되는 동안 3D 인쇄 가이드를 사용하여 유지됩니다. (B) 테스트 전에 엑스레이는 대퇴골의 말단을 둘러싼 앵글링 비품의 그림자와 뼈 시멘트의 완전한 커버리지를 보여줍니다. 알루미늄 냄비 의 바닥에 포화 흰색 영역은 퍼티, 경화 할 때 냄비에 뼈 시멘트를 유지하는 데 사용됩니다. 스케일 표시줄(패널 B) = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 하드웨어 설정
- MTS(기계 테스트 시스템)를 사용하여 해상도 <1 N)으로 로드 셀을 부착하고 보정합니다(재료 표 참조)(그림 4A 참조).
참고: 로드 셀은 스테이지 또는 가능하면 액추에이터에 장착할 수 있습니다. - 알루미늄 세그먼트를 시료와 함께 단단히 고정할 사각형 슬롯이 있는 설비를 부착합니다. 세트 나사를 홀딩 설비의 양면에 부착하여 샘플을 제자리에 단단히 고정합니다. (그림 4B).
참고: 이 설비는 3D 인쇄 또는 가공한 다음 스레드 나사 구멍으로 탭하여 테스트 프레임에 장착할 수 있습니다. - 액추에이터에 적재 플레이트를 부착합니다. 이것은 단순히 평평한 팁이있는 테이퍼 나사일 수 있습니다 (그림 4C).
- MTS 바로 앞에 테이블이나 표면에 스테레오현미경을 놓습니다. 현미경을 통해 설정을 보려면 추가 조명이 필요한 경우 시스템 주위에 이 조명을 배치하십시오.
그림 4: 하드웨어 설정. (A) 적절한 시료 포지셔닝을 보장하기 위해 1kN 로드 셀(해상도 < 1 N) 및 검은색 양축 스테이지를 갖춘 기계 테스트 시스템에 대한 테스트 설정. (B) M10 스레드 로드와 알루미늄 냄비를 제자리에 고정하는 데 사용되는 두 개의 M4 볼트로 로드 셀에 부착된 3D 인쇄 장착 설비를 닫습니다. (C) 테이퍼 로딩 기구가 있는 스테레오 현미경을 통해 시료를 볼 수 있습니다. 스케일 표시줄(패널 C) = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 소프트웨어 설정
- MTS 소프트웨어에서 새로운 굴곡(굽힘) 프로토콜을 만들기 시작합니다. 프로토콜이 변위 제어에서 작동하는지 확인합니다.
- 프로토콜의 적재 속도를 0.5mm/s로 설정합니다.
- 소프트웨어에 소프트 키설정이 있는 경우 소프트 키 "균형" 및 "제로 확장"을 프로토콜에 추가합니다.
참고: 각 샘플을 테스트하기 전에 부하 및 액추에이터 위치를 0으로 빠르게 설정합니다. - 소프트웨어 프로그램이 최소 샘플링 속도100Hz에서 몇 초 만에 시간, 뉴턴의 부하 및 확장 또는 변위를 밀리미터 단위로 기록할 수 있는지 확인합니다.
- 새 프로토콜을 저장하고 소프트웨어 프로그램의 기본 화면으로 돌아가 새 샘플 집합 테스트를 시작합니다.
5. 테스트 설정
- MTS에 표본을 장착하기 전에 알루미늄 냄비에 있는 시료의 X선 이미지를 가져옵니다. 여러 샘플을 한 번에 이미지화할 수 있습니다. 시료의 전방 뷰가 캡처되어 포팅 각도의 검증 측정을 허용합니다(그림 5).
그림 5. 샘플 정렬 평가. (A) 수직에서 샤프트 각도는 평면 디지털 엑스레이에서 측정됩니다. (B) 대표적인 화분 샤프트 각도는 18.11°에서 23.99°까지 다양하며, 7.1%(n=20)의 변동 계수(COV)가 있었다. 해부학적 변화로 인한 성차이는 한 꼬리를 결합하지 않은 t-test(p < 0.05)를 사용하여 결정된 바와 같이 통계적으로 유의하지 않았다. 스케일 표시줄(패널 A) = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 알루미늄 세그먼트를 샘플로 보관 설비에 넣고 세트 나사를 조입니다.
- 대퇴헤드의 몇 밀리미터 이내일 때까지 액추에이터/적재 판을 낮춥니까.
참고: 시료를 어떤 힘으로도 미리 로드하지 말고 시료를 손상시키기 쉽기 때문에 액추에이터를 너무 빨리 낮추지 않도록 주의하십시오. - 스테레오현미경을 사용하여 양축 단계를 조정하여 로딩 플레이트 바로 아래에 대퇴 헤드의 위치를 정렬합니다. 양축 스테이지를 제자리에 고정합니다.
- MTS 소프트웨어에서 액추에이터의 위치를 0으로 하고 4.3 단계에서 추가된 소프트 키를 사용하여 로드 셀의 균형을 잡습니다.
- 로딩 프로토콜을 시작합니다. 로딩 플레이트와 샘플 사이에 남은 공간의 양에 따라 테스트는 10-30초만 소요됩니다.
- 테스트 후 샘플의 다른 전방 X선을 캡처합니다. 이것은 골절 모드를 분별하고 문서화하는 데 사용됩니다 (그림 6).
그림 6: 테스트 후 샘플의 X선 이미지입니다. 대퇴목과 대퇴목 샤프트 부착(주황색 원강조)을 따라 양분된 선으로 골절된 모든 샘플. 배율 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 데이터 분석
- 데이터 수집 후 그래프 및 수학 계산을 허용하는 소프트웨어( 재료 표 참조)로 힘 및 변위 데이터를 내보냅니다.
- 로드 와 플롯을 플롯합니다. 각 샘플에 대한 변위(그림 7A). 하중 변위 곡선의 선형 세그먼트에 선형 근사치를 맞춥니까. 이 선형 핏의 기울기는 시료의 탄력성, 강성을 정의합니다.
- 최대 하중, 최대 변위, 수율 부하, 수율 지점에서의 변위, 최대 부하에 대한 에너지 및 수율 지점의 에너지와 같은 추가 결과를 계산합니다.
참고: 수율점은 6.2단계에서 결정된 선형 근사치를 0.2%6으로 오프셋하여 결정할 수 있습니다. 오프셋 선 과 로드 대 하중이 있는 지점입니다. 변위 곡선교차는 수율점을 결정합니다. 수율이 거의 없는 매우 취성 샘플의 경우 수율 점은 최대 점과 같을 수 있습니다.
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Representative Results
가이드의 도움으로 화분에 넣으면 대퇴 샤프트가 21.6 ° ± 1.5 °로 정렬되었습니다. 이는 20°의 의도된 각도에서 <10% 편차를 나타내지만, 테스트된 모든 샘플에 걸쳐 포팅 각도의 변이(COV)의 계수는 시험 전 평면 엑스레이(그림 5)에 의해 확인된 바와 같이 각각 남성과 여성 마우스의 경우 7.6%와 6.5%였다. 또한 테스트 후 X선을 사용하여 샘플이 실패한 모드를 평가해야 합니다. 고장은 대퇴목에서 일관되게 관찰되었으며, 의도한 대로, 대퇴골 샤프트와 평행한 하나의 골절 라인과 대퇴목에 수직인 다른 선(도 6)을 병행시켰다. 시료 간의 파손 패턴에서 상당한 변화가 발생하는 경우, 체적 뼈 미네랄 밀도, 반구 및 피질 두께, 간격 및 광물화와 같은 결과를 측정하여 샘플의 뼈 품질을 μCT를 통해 더 평가될 수 있습니다. 대퇴목에서 일관되게 실패가 유도되지 않으면 3D 프린팅 가이드가 조정될 수 있다.
본 명세서에 보고된 생체역학적 결과 측정값은 대퇴목 구성7,8,9,10,11,12,13,14의 유사한 축 굽힘에서 보고된 값과 일치한다. 그러나, 3D 프린팅 가이드를 사용하여 달성된 일관된 정렬은 일반적으로 특히 최대 하중의 COV를 개선하였다(표 1).
| 현재 연구 | 성 | 미드샤프트 각도 | 최대 부하 | 강성 | 실패에 대한 작업 |
| 남성 | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| 여성 | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| 젬사 외10 | 남성 | NR | 22% | NR | NR |
| 젬사 외8 | 남성 | NR | 19% | NR | NR |
| 카말 외9 | 여성 | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| 미들턴 외7 | 여성 | NR | 24%-27% | NR | NR |
| 브렌트 외 알11 | 여성 - 쥐 | NR | 18%-24% | NR | NR |
| 브로머 외12* | 여성 | NR | 11%-27% | NR | NR |
| 채식 주 외 13* | 여성 | NR | 16%-32% | NR | NR |
| 로드버그14* | 여성 | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: 보고되지 않음 | |||||
| *: 게시된 수치에서 추정된 데이터 | |||||
표 1: 마우스 대퇴목의 굴곡 특성측정을 위한 변이계. 변동 계수는 데이터 집합의 표준 편차 및 평균비율을 나타냅니다. COV가 감소함에 따라 평균 주위의 개별 데이터 포인트의 더 엄격한 그룹화가 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 유사한 테스트를 수행하는 다른 출판물에 비해 최대 부하에 대한 COV를 감소시게 했습니다.
예상대로, 측정된 기계적 특성에서 성차가 관찰되었다. 통계 분석은 한 꼬리가 짝을 이루는 t-테스트를 사용하여 수행되었습니다. 남성 마우스에서 대퇴목은 여성 마우스에서 표본보다 상당히 강하고 뻣뻣했다 (p = 0.009 p = 0.0006, 각각). 또한, 여성 대퇴목은 더 중요한 변형(p = 0.014)을 경험하고 수컷 마우스의 표본에 비해 실패(p= 0.024)로 작용하였다(도 7). 이것은 여성의 낮은 뼈 미네랄 밀도와 일치하며 생리학적으로 관련된 차이를 감지하는 테스트의 감도를 강조합니다. 이 연구에서 사용되는 수컷 및 여성 마우스 코호트에서, 여성 마우스 뼈 미네랄 밀도는 이중 에너지 X선 absorptiometry 스캔 (DEXA) 및 한 꼬리 페어링되지 않은 T-테스트 (p = 0.036)에 의해 결정된 바와 같이, 그들의 남성 대조물보다 상당히 낮았다.
그림 7: 생체 역학 적 결과. (A) 0.2% 오프셋 선형 핏을 표시하는 대표적인 힘 변위 곡선은 강성과 수율 점을 도출하는 데 사용됩니다. 선택한 결과 측정값은 (B) 최대 부하(실패 시), (C) 강성, (D) 최대 변위(실패 시) 및 (E) 실패 작업(실패 지점까지의 곡선 아래 영역)을 포함하여 평균 및 표준 편차를 표시하는 분산 플롯입니다. 별표는 한 꼬리가 짝을 이루는 t-test(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n = 섹스 코호트 당 10)를 사용하여 결정된 중요한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
포팅 각도의 약간의 변화가 실험적 가변성에 기여하지 않았음을 확인하기 위해, 각 생체 역학적 결과 측정은 포팅 각도에 대해 플롯되고 남성 코호트, 여성 코호트 및 모든 샘플을 함께 그룹화한 간단한 선형 회귀를 수행하였다(그림 8). 그런 다음 선형 회귀 경사가 0이 아니라는 가설을 테스트했습니다. 회귀 분석은 강성을 제외하고, 포팅 각도(범위 18°에서 24°)의 약간의 변화가 생체 역학적 결과 측정에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다. 강성의 경우 포팅 각도와 상당한 선형 상관 관계가 있었습니다(R2 = 0.29, p < 0.05).
그림 8: 포팅 각도가 생체 기계적 결과에 미치는 영향. (A) 최대 하중, (B) 강성, (C) 최대 변위를 포함한 생체 역학적 결과 측정, 및 (D) 고장으로의 작업은 수컷 코호트, 여성 코호트 및 모든 샘플에 대한 간단한 선형 회귀를 사용하여 포팅 각도및 상관 관계에 대해 플롯되었다. 솔리드 블랙 선은 그룹화된 샘플의 선형 회귀를 표시하며, 점선은 신뢰 구간을 나타냅니다. 포팅 각도의 가변성은 최대 부하, 최대 변위 또는 고장 작업에 크게 영향을 미치지 않았습니다. 그러나 포팅 각도가 증가함에 따라 Pearson의 테스트(p = 0.0126, n =20)에 의해 결정된 대로 강성이 증가했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 표준 삼각형 언어 (. STL) 가이드의 파일. 이 파일은 프로토콜에 설명된 가이드를 인쇄하는 데 사용할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 뮤린 대퇴목에 대한 신뢰할 수있는 캔틸레버 굽힘 테스트를 간략하게 설명합니다. 대퇴목에서 발생하는 천연 캔틸레버 플렉스 시나리오는 일반적으로 표준 3점 및 4점 굽힘 테스트5에서 표현되지 않습니다. 이 시험 방법은 뼈 취약성 환자에 의해 경험된 대퇴목 골절의 모형을 더 좋고 더 안정적으로 복제합니다. 이 프로토콜을 수행할 때 주요 초점은 대퇴샤프트의 일관성 없는 포팅으로 인한 가변성을 제거하는 것입니다. 비판적으로, 프로토콜의 첫 번째 및 네 번째 섹션에 설명된 단계를 면밀히 살펴보면 가이드와 로딩 프로토콜이 이 출판물에 보고된 내용을 복제할 수 있습니다. 이론적으로 예측 및 실험적으로 보여 질 수 있듯이, 로딩 축에 상대하는 중간 축 각도는 대퇴목과 대퇴목에서 골절이 발생할 확률에 의해 경험되는 응력에 영향을 미칠 수 있다. 이전 그룹은 중간 축 각도가 대퇴골 머리를 통해로드 할 때 대퇴골의 압축 강성과 강도에 크게 영향을 미친다는 것을 입증했다. 중간샤프트 경사 각도의 효과를 파라메트릭 분석한 결과 대퇴샤프트의 최대 굽힘 모멘트는 15°에서 25°사이의 중간 축 각도에서 최소한점을 경험하여 샤프트 강성을 최대화하는 것으로 나타났습니다5. 따라서 이 각도는 샤프트의 압축 골절 가능성을 최소화하고 대퇴목의 굴곡 골절 가능성을 증가시킵니다.
몇몇 매개 변수는 어떤 생체 기계적인 시험의 결과에 영향을 미칠 수 있고 생리적으로 관련있는 실험 변수 때문에 중요한 다름을 검출하는 기능을 혼동할 수 있었습니다. 이 가변성은 긴 마우스 골격의 작은 크기에 의해 복합됩니다. 이 시험에서 주의가 필요한 파라미터 중에는 특히, 로딩 축에 비해 뼈의 동결 해동 사이클 및 수화 상태, 로딩 속도 및 대퇴샤프트의 정렬이 있다. 이 프로토콜은 모든 샘플이 동일한 수의 동결 해동 주기와 실온에서 PBS에서 수분을 공급하기 위한 2h 창을 통과한다고 규정하고 있습니다. 로딩 속도는 또한 0.5mm/s3,4의 균일한 값으로 설정됩니다. 또한, 3D 프린팅 가이드는 포팅 스텝 동안 ~20°의 중간 축 각도로 대퇴골을 일관되게 배치하도록 설계되었습니다. 이로 인해 18°에서 24°의 범위에서 일관된 중간샤프트 각도가 발생했으며, 해부학적 차이와 남성과 여성 마우스의 경우 각각 7.6%와 6.5%의 변이계로 인해 별다른 성 효과가 없었습니다. 이 가이드는 표준 솔리드 모델링 소프트웨어를 사용하여 쉽게 수정할 수 있으며 저렴한 데스크탑 3D 프린터를 사용하여 필요에 따라 재현됩니다.
대표적인 결과는 시험 프로토콜이 n= 10의 적당한 표본 크기로 성별과 같은 미묘한 생리적 차이에 민감하다는 것을 보여주었습니다. n = 10의 실험적으로 결정된 크기 효과(δ = Δmean/SD)를 고려한 회고전력 분석은 강성 δ(δ = 1 >.77) 및 최대 변위(δ = 1.97) 및 83%의 고장 시 최대 부하에 대해 전력이 57%로 추정되고 있으며, 최대 변위(δ = 1.97), 및 83%가 작동률(각각 17)δ. 변형의 작은 계수 (표 1)와 함께,이 전력 분석은 포팅 각도의 변화가 프로토콜의 감도 및 신뢰성에 부정적인 영향을 미쳤는 것을 확인합니다.
고장 의 모드의 주관적 분석은 또한 시험된 견본의 100%가 대퇴목에서 실패했다는 것을 보여주었습니다, 그들 모두는 양분의 양면 골절을 보여주었습니다, 1개의 골절 선은 현장에서 샤프트에 평행하게 달리는 결과 및 다른 골절 선은 분기의 정점에 대퇴목수직에 수직으로 달리는. 이것은 대퇴목 골절의 두 임상 관련 모드에서 특징을 포함; 인터트로칸테리아 및 경부 목 골절15. 대퇴목 캔틸레버 굽힘 테스트는 일반적으로 사용되지 않으며 골다공증의 설치류 모델에서 대퇴및 티브리얼 미드샤프트의 표준 비틀림 또는 굴곡 테스트로 문헌에 설명되지 않습니다. 소수의 연구만이 마우스 및 쥐 모델을 사용하여 그러한 프로토콜을 설명하기 위해 확인되었습니다5,7,8,9,16,17. 테스트 중에 대퇴골이 배치된 각도가 항상 보고되는 것은 아닙니다. 자세한 설명이 있는 일부 사람들은 샘플5를 정렬하기 위해 과도한 양의 사용자 지정 비품과 소프트웨어를 사용하지만 여전히 손으로 포팅에 의존하여 다른 프로토콜에서 동일한 인간의 오류를 도입합니다.
이 프로토콜은 뮤린 샘플을 위해 설계되었으며 C57Bl/6 마우스에 지정되었지만 다른 대퇴 기하학을 가진 대형 동물 모델 또는 다른 뮤린 균주에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하는 미래 조사관은 제 3 의 트로챈터가 대퇴 머리에서 정확하게 7mm 가 아닐 수 있기 때문에 노출된 뼈의 양을 수정해야 할 수도 있습니다. 프로토콜에 대한 추가 수정은 추가 테스트가 원하는 경우 샘플을 해제하기 위해 테스트 후 부드럽게 할 수있는 경화제를 사용하는 것을 포함한다. 이것은 샘플을 방출하기 위하여 시험 후에 온수 욕조에서 녹을 수 있는 비스무트 합금으로 행해질 수 있었습니다7. 사용자가 이 프로토콜을 만들 수 있는 최종 수정은 로드 셀의 유형 및 위치 지정인 3.1 단계에서 제외됩니다. 축 로드 셀은 하위 1 N 해상도와 함께 사용해야 합니다. 50 N 로드 셀은 관찰된 최대 부하에 따라 적절합니다. 또한 장력 또는 압축만 을 측정하는 로드 셀은 로드 셀에 비해 편심 로딩에서 로드 셀이 발생할 수 있는 복합 굽힘 순간을 피하기 위해 사용해야 합니다. 복합력 측정을 방지하는 또 다른 방법은 로드 힘이 로드 셀과 일치하는지 확인하기 위해 액추에이터에 로드 셀을 고정하는 것입니다.
이 프로토콜은 사용자 지정 설비의 필요성을 단순화하고, 시판되는 3D 프린터에서 가이드를 인쇄할 수 있는 방법을 설명하고, 현재 연구에서 보고된 변동계수가 낮은 상황에서 입증된 바와 같이 일반적인 실험실 장비를 활용하여 샘플을 철저하고 재현가능하게 테스트합니다(표 1). 그러나 이 프로토콜은 3D 프린터의 필요성에 의해 제한되지 않습니다. 3D 렌더링 파일을 인쇄 회사에 보낼 수 있고 부품을 다시 배송할 수 있는 상용 솔루션이 존재합니다. 또한 대퇴목에 적재를 구부리는 이 모드는 임상적으로 발생하는 골절의 위치와 유형을 시뮬레이션합니다. 취약성 골절위험이 높은 사람들의 수가 205018년까지 매년 2,130만 개 이상의 고관절 골절이 발생할 것으로 예상됩니다. 설치류 모델에서의 신뢰할 수 있는 엄청난 사회적, 재정적, 의료적 부담은 이를 효과적으로 치료하기 위해 골다공증 및 치료제의 병인학을 이해하는 데 있어 연구의 엄격함과 재현성을 향상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH P30AR069655 및 R01AR070613(H. A.A.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
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