Summary
Le présent protocole décrit le développement d’une plate-forme d’essai reproductible pour les cols fémoraux murins dans une configuration de flexion en porte-à-faux. Des guides imprimés en 3D personnalisés ont été utilisés pour fixer de manière cohérente et rigide les fémurs dans un alignement optimal.
Abstract
Les fractures du col du fémur sont fréquentes chez les personnes atteintes d’ostéoporose. De nombreux modèles murins ont été développés pour évaluer les états pathologiques et les thérapies, avec des tests biomécaniques comme mesure de résultat principal. Cependant, les essais biomécaniques traditionnels se concentrent sur les essais de torsion ou de flexion appliqués à l’arbre médian des os longs. Ce n’est généralement pas le site des fractures à haut risque chez les personnes ostéoporotiques. Par conséquent, un protocole de test biomécanique a été développé qui teste le cou fémoral des fémurs murins dans la charge de flexion en porte-à-faux pour mieux reproduire les types de fractures subies par les patients atteints d’ostéoporose. Étant donné que les résultats biomécaniques dépendent fortement de la direction de charge de flexion par rapport au col du fémur, des guides imprimés en 3D ont été créés pour maintenir un arbre fémoral à un angle de 20 ° par rapport à la direction de charge. Le nouveau protocole a simplifié les tests en réduisant la variabilité de l’alignement (21,6 ° ± 1,5 °, COV = 7,1 %, n = 20) et en améliorant la reproductibilité des résultats biomécaniques mesurés (COV moyen = 26,7 %). La nouvelle approche utilisant les guides imprimés en 3D pour un alignement fiable des échantillons améliore la rigueur et la reproductibilité en réduisant les erreurs de mesure dues au désalignement des échantillons, ce qui devrait minimiser la taille des échantillons dans les études sur l’ostéoporose chez la souris.
Introduction
Le risque de fracture est un problème médical grave associé à l’ostéoporose. Plus de 1,5 million de fractures de fragilité sont signalées chaque année aux États-Unis seulement, avec des fractures survenant à la hanche, en particulier au col du fémur, comme principale fracture de type1. On estime que 18 % des femmes et 6 % des hommes subiront une fracture du col du fémur au cours de leur vie2, et le taux de mortalité à 1 an après la fracture est supérieur à 20 %1. Par conséquent, les modèles murins qui permettent des tests biomécaniques du col du fémur peuvent convenir à l’étude des fractures de fragilité. Les modèles murins offrent également des outils puissants pour élucider les événements cellulaires et moléculaires traduisibles impliqués dans l’ostéoporose potentiellement. Cela est dû à la disponibilité de rapporteurs génétiques, au gain et à la perte de modèles fonctionnels et à la vaste bibliothèque de techniques moléculaires et de réactifs. Les tests mécaniques sur les os de souris peuvent fournir les mesures de résultats nécessaires pour déterminer la santé des os, les variations génotypiques et phénotypiques qui pourraient expliquer l’étiologie de la maladie, et évaluer les thérapies en fonction des mesures des résultats de la qualité de l’os et du risque de fracture3.
L’anatomie du col du fémur crée des scénarios de charge mécanique uniques, qui conduisent généralement à des fractures de flexion (flexion). La tête fémorale est chargée dans la cavité acétabulaire à l’extrémité proximale du fémur. Cela crée un scénario de flexion en porte-à-faux sur le col fémoral, qui est fixé de manière rigide à la tige fémorale distalement4. Cela diffère des tests de flexion traditionnels à 3 ou 4 points sur la diaphyse moyenne fémorale. Bien que ces tests soient utiles, ils ne reproduisent pas la charge qui conduit généralement à des fractures de fragilité chez les personnes ostéopéniques et ostéoporotiques en termes de localisation de la fracture ou de scénario de charge.
Pour mieux évaluer le risque de fracture de fragilité chez la souris, il a été cherché à améliorer la reproductibilité des tests de flexion en porte-à-faux du col fémoral murin. Comme on l’avait prédit théoriquement, il a été démontré que l’angle de charge sur la tête fémorale par rapport à l’arbre fémoral influe de manière significative sur les mesures des résultats5, créant ainsi un défi pour la fiabilité et la reproductibilité des résultats rapportés. Pour assurer un alignement correct et cohérent des fémurs pendant la préparation de l’échantillon, des guides ont été conçus et imprimés en 3D sur la base de mesures anatomiques effectuées sur des scans μCT de fémurs de souris C57BL/6. Les guides ont été conçus pour aider à rempoter systématiquement les échantillons de manière à ce que l’arbre fémoral soit maintenu à ~ 20 ° de la direction de chargement verticale. Cet angle a été choisi parce qu’il maximise la rigidité tout en minimisant le moment de flexion maximal le long de l’arbre fémoral, ce qui augmente le risque de fractures du col du fémur et conduit à des tests plus cohérents et reproductibles5. Les guides ont été imprimés en 3D dans différentes tailles pour tenir compte des différences anatomiques entre les échantillons et utilisés pour maintenir les échantillons dans une position stable tout en rempotant dans du ciment osseux acrylique. La rigidité, la force maximale, la force d’élasticité et l’énergie maximale ont été calculées à partir des graphiques force-déplacement. Cette méthode d’essai a montré des résultats cohérents pour le résultat biomécanique susmentionné. Avec la pratique et l’aide du guide imprimé en 3D, les erreurs de mesure dues à un désalignement peuvent être minimisées, ce qui permet d’obtenir des mesures de résultats fiables.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles et des femelles C57BL/6 âgés de 24 à 29 semaines. Les souris ont été logées dans des conditions standard avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Lors de l’euthanasie par inhalation de dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale, 20 fémurs droits (10 mâles et 10 femelles) ont été récoltés et congelés à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient testés.
1. Création de guides de montage personnalisés imprimés en 3D
REMARQUE: Cette étape peut être nécessaire car différentes souches et phénotypes génétiques peuvent avoir des géométries anatomiques différentes.
- Obtenir des scans μCT des échantillons représentatifs.
- Numérisez des échantillons représentatifs sur un scanner μCT avec les paramètres suivants : 55 kV, 145 μA pour des temps d’intégration de 300 ms et une résolution de 10,5 μm de voxels.
- Assurez-vous que la région capturée couvre l’extrémité proximale du fémur et continue à descendre à travers l’arbre intermédiaire.
REMARQUE: Si un scanner μCT n’est pas disponible, des rayons X planaires 2D des échantillons représentatifs peuvent être utilisés.
- Analysez les scans μCT.
- En utilisant l’ensemble représentatif des scans μCT, obtenez un rendu 2D de la vue antérieure du fémur proximal.
- Obtenez des images μCT avec une résolution de 10,5 μm de voxels de l’arbre médian à l’extrémité proximale du fémur. Compilez ces tranches à l’aide d’un logiciel (voir Tableau des matériaux) dans un rendu 3D de l’exemple.
- Déterminez un seuil pour distinguer l’os du tissu environnant et appliquez un filtre gaussien pour la réduction du bruit.
- Orientez les rendus 3D pour éliminer l’inclinaison hors axe et vous assurer que la surface antérieure du fémur est visualisée.
- Exportez cette vue 2D du rendu 3D sous forme de fichier image, tel qu'.jpg ou .png.
- À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux), mesurez l’angle de l’arbre fémoral en traçant une ligne perpendiculaire à l’arbre fémoral de 7 mm distalement et une deuxième ligne à travers le sommet du grand trochanter jusqu’au point médian de la ligne perpendiculaire susmentionnée (Figure 1).
- Le long de la ligne perpendiculaire distale de 7 mm, mesurez le diamètre de l’arbre fémoral en dessous du troisième trochanter.
- En utilisant l’ensemble représentatif des scans μCT, obtenez un rendu 2D de la vue antérieure du fémur proximal.
Figure 1: Analyse μCT. Des images μCT de fémurs de souris C57Bl/6 sont utilisées pour calculer l’angle moyen de l’arbre, mesuré du haut du plus grand trochanter à travers le centre de l’arbre moyen, ~ 7 mm distalement. Le diamètre de l’arbre moyen a également été mesuré à cette position. Les rendus 3D du fémur proximal ont été orientés dans une vue antérieure pour afficher le profil du troisième trochanter. L’angle moyen de l’arbre était de 93,13° (SD = 1,19°) et le diamètre moyen de l’arbre moyen était de 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Créez les guides de montage à l’aide d’un logiciel de modélisation 3D (voir Tableau des matériaux) (Figure 2, Fichier supplémentaire 1).
REMARQUE: Les guides sont des cuboïdes rectangulaires mesurant 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm avec une fente inclinée, légèrement plus grande que le diamètre moyen de l’arbre déterminé à l’étape 1.1.2. L’angle de la fente créera un angle constant de 20° par rapport à la verticale. Les guides doivent être cohérents en longueur, en hauteur et en largeur, mais peuvent être fabriqués avec différents diamètres de fente pour tenir compte des différences anatomiques entre les échantillons d’os.
Figure 2 : Conception des guides. (A) Croquis 3D et (B) visualisation du dispositif de pêche à la ligne médiane avant impression 3D. Sur la base de la littérature antérieure, un angle d’arbre moyen compris entre 20 ° maximise la rigidité. Il minimise le moment de flexion maximal dans l’arbre fémoral pour s’assurer que les fractures se produisent dans le cou et la variabilité des résultats mécaniques5. Pour compenser l’écart de 3,13° par rapport à la perpendiculaire dans les angles moyens de l’arbre moyen, l’angle du luminaire a été réglé sur 73,13° pour produire un angle de 20°. Les fixations d’alignement ont été imprimées avec des diamètres allant de 1,9 à 2,2 mm pour assurer un ajustement approprié pour différents diamètres d’arbre moyen. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- À l’aide d’une imprimante 3D, imprimez les guides. Les guides peuvent rester allumés pendant le processus de test, de sorte que l’impression de plusieurs répliques des guides peut être bénéfique pour préparer plusieurs échantillons à la fois.
2. Préparation de l’échantillon
- Récoltez les fémurs de la souris en faisant une incision transversale entièrement autour de l’abdomen de la souris et en retirant le tissu de l’incision aux chevilles. Ensuite, localisez l’alvéole de la hanche et utilisez soigneusement la pointe d’une paire de pinces fines pour disloquer la hanche. Coupez les tissus mous supplémentaires pour retirer la jambe de la souris.
- Une fois la jambe récoltée, utilisez un scalpel pour vous disloquer et couper à travers l’articulation du genou. Nettoyez manuellement les fémurs de tous les tissus mous à l’aide de pinces, de scalpels et d’essuie-tout.
- Testez immédiatement les échantillons récoltés ou conservez-les à -20 °C pendant 6 mois. Si les échantillons sont congelés, laissez-les arriver à température ambiante et hydratez-les dans du PBS pendant 2 h avant de les préparer.
- À l’aide d’un tube en aluminium carré de 1/4 po x 1/4 po (voir tableau des matériaux), coupez les sections de tubes de 1/2 po à 1 po de longueur. À l’aide d’un outil de gravure, étiquetez chaque segment d’aluminium avec les ID d’échantillon.
- Remplissez la moitié des segments de tube avec du mastic. Placez ces segments de tuyau dans un luminaire pour les maintenir debout.
- Placez les fémurs nettoyés dans les guides imprimés en 3D. Pour ce faire, placez les échantillons à plat sur la paillasse afin que la surface antérieure soit orientée vers le haut. Placez le guide directement sous le troisième trochanter, où le diamètre de l’arbre devient plus cohérent.
REMARQUE: Cela laissera ~ 7 mm du fémur proximal au-dessus du guide. - Pour éviter que le fémur ne tourne vers le côté latéral ou médial lors de la mise sur le guide, tenez les extrémités proximales et distales d’une main lors de l’application des guides, appuyez fermement sur le fémur sur l’établi et, à l’aide de votre autre main, placez le guide imprimé en 3D sur l’arbre médian du fémur. Assurez-vous d’appliquer doucement le guide de diamètre approprié, car l’arbre médian du fémur peut s’enclencher s’il est forcé dans un guide trop petit.
- Une fois que les guides sont sur les fémurs, placez-les devant les segments d’aluminium correspondants. À l’aide de ciment osseux ou d’autres agents de durcissement, remplissez les segments d’aluminium jusqu’à ce qu’ils soient juste pleins, en laissant un peu de place pour le déplacement.
- Placez les fémurs avec des guides dans le bon segment en aluminium.
REMARQUE: Les guides ne seront pas centrés sur les segments en aluminium, légèrement assis d’un côté pour permettre à l’extrémité distale du fémur de s’asseoir au centre du pot en aluminium. - Laissez l’agent de durcissement se définir. Une fois réglés, placez les échantillons dans une boîte de Petri avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante et laissez réhydrater pendant 2 h (Figure 3).
Figure 3 : Préparation de l’échantillon à l’aide de gabarits et de dispositifs de pêche personnalisés. (A) Les échantillons dans des pots en aluminium avec le bon alignement sont maintenus à l’aide des guides imprimés en 3D pendant que le ciment osseux sèche. (B) La radiographie avant les tests montre l’ombre des appareils de pêche à la ligne et la couverture complète du ciment osseux entourant l’extrémité distale des fémurs. La zone blanche saturée au fond des pots en aluminium est du mastic, utilisé pour garder le ciment osseux dans les pots lors du durcissement. Barre d’échelle (panneau B) = 5 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
3. Configuration matérielle
- À l’aide d’un système d’essai mécanique (MTS), fixez et étalonnez un capteur de pesage d’une résolution <1 N (voir tableau des matériaux) (figure 4A).
REMARQUE: Le capteur de pesage peut être monté sur la scène ou, de préférence, sur l’actionneur lorsque cela est possible. - Fixez un luminaire avec une fente carrée qui maintiendra fermement les segments d’aluminium avec les échantillons. Fixez des vis fixes sur les deux côtés du dispositif de maintien pour maintenir fermement les échantillons en place. (Figure 4B).
REMARQUE: Ce luminaire peut être imprimé ou usiné en 3D, puis taraudé avec des trous de vis filetés pour être monté sur le cadre de test. - Fixez une plaque de chargement à l’actionneur. Il peut s’agir simplement d’une vis conique avec une pointe aplatie (Figure 4C).
- Placez un stéréomicroscope sur une table ou une surface directement devant le MTS. Si un éclairage supplémentaire est nécessaire pour voir la configuration à travers le microscope, placez-les autour du système.
Figure 4 : Configuration matérielle. (A) Configuration des essais sur le système d’essai mécanique, avec un capteur de pesage de 1 kN (résolution < 1 N) et un étage biaxial noir pour assurer le bon positionnement de l’échantillon. (B) Gros plan du support de montage imprimé en 3D fixé au capteur de pesage avec une tige filetée M10 et deux boulons M4 utilisés pour maintenir le pot en aluminium en place. (C) Vue de l’échantillon à l’aide d’un stéréomicroscope avec un dispositif de chargement conique. Barre d’échelle (panneau C) = 5 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
4. Configuration du logiciel
- Dans le logiciel MTS, commencez la création d’un nouveau protocole de flexion (flexion). Assurez-vous que le protocole fonctionnera dans le contrôle du déplacement.
- Réglez le taux de chargement du protocole sur 0,5 mm/s.
- Si le logiciel dispose d’un paramètre pour les touches programmables, ajoutez les touches programmables « Balance » et « Zero Extension » au protocole.
REMARQUE: Cela réglera rapidement la position de la charge et de l’actionneur sur 0 avant de tester chaque échantillon. - Assurez-vous que le logiciel enregistrera le temps en secondes, la charge en Newtons et l’extension ou le déplacement en millimètres à une fréquence d’échantillonnage minimale de 100 Hz.
- Enregistrez le nouveau protocole et revenez à l’écran principal du logiciel pour commencer à tester un nouvel ensemble d’exemples.
5. Configuration des tests
- Avant de monter les échantillons sur le MTS, obtenez une image radiographique des échantillons dans les pots en aluminium. Plusieurs échantillons peuvent être imagés à la fois. Assurez-vous que la vue antérieure des échantillons est capturée pour permettre des mesures de vérification de l’angle d’empotage (figure 5).
Graphique 5. Évaluation de l’alignement de l’échantillon. (A) L’angle de l’arbre par rapport à la verticale est mesuré à partir de rayons X numériques planaires. (B) Les angles représentatifs de l’arbre fémoral en pot variaient de 18,11 ° à 23,99 °, avec un coefficient de variation (COV) de 7,1 % (n = 20). Les différences entre les sexes dues aux variations anatomiques n’étaient pas statistiquement significatives, telles que déterminées à l’aide d’un test t non apparié à une queue (p < 0,05). Barre d’échelle (panneau A) = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
- Placez le segment en aluminium avec l’échantillon dans le dispositif de maintien et serrez les vis de serrage.
- Actionneur inférieur / plateau de chargement jusqu’à ce qu’il soit à quelques millimètres de la tête fémorale.
REMARQUE: Ne préchargez pas l’échantillon avec une force quelconque et veillez à ne pas abaisser l’actionneur trop rapidement, car il est très facile d’endommager les échantillons. - À l’aide du stéréomicroscope, ajustez l’étage biaxial pour aligner la position de la tête fémorale directement sous la plaque de chargement. Verrouiller l’étage biaxial en place.
- Dans le logiciel MTS, mettez à zéro la position de l’actionneur et équilibrez le capteur de pesage à l’aide des touches programmables ajoutées à l’étape 4.3.
- Commencez le protocole de chargement. Selon l’espace restant entre la plaque de chargement et l’échantillon, les tests ne prendront que 10 à 30 s.
- Après le test, capturez une autre radiographie antérieure de l’échantillon. Cela servira à discerner et à documenter le mode de fracture (Figure 6).
Figure 6 : Image radiographique des échantillons après analyse. Tous les échantillons se sont fracturés en une ligne bifurquée à travers le col du fémur et le long de la fixation du col du fémur (souligné par le cercle orange). Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Analyse des données
- Après la collecte des données, exportez les données de force et de déplacement dans un logiciel (voir Tableau des matériaux) qui permet des calculs graphiques et mathématiques.
- Tracez la charge par rapport à. déplacement pour chaque échantillon (figure 7A). Ajuster une approximation linéaire au segment linéaire de la courbe charge-déplacement. La pente de cet ajustement linéaire définira la rigidité, une mesure de l’élasticité de l’échantillon.
- Calculez les résultats supplémentaires tels que la charge maximale, le déplacement maximal, la charge d’élasticité, le déplacement au point d’élasticité, l’énergie à la charge maximale et l’énergie au point d’élasticité.
REMARQUE: La limite d’élasticité peut être déterminée en décalant l’approximation linéaire déterminée à l’étape 6.2 par 0.2%6. Le point auquel la ligne de décalage et la charge vs. l’intersection de la courbe de déplacement déterminera la limite d’élasticité. Dans le cas d’échantillons très fragiles qui présentent peu de rendement, la limite d’élasticité peut être la même que la limite maximale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lorsqu’ils étaient mis en pot à l’aide du guide, les arbres fémoraux étaient alignés à 21,6° ± 1,5°. Bien que cela représente un écart de <10 % par rapport à l’angle prévu de 20°, les coefficients de variation (COV) de l’angle d’empotage sur tous les échantillons testés étaient de 7,6 % et 6,5 % pour les souris mâles et femelles, respectivement (n = 10 par groupe), tels que vérifiés par les radiographies planes pré-test (Figure 5). De plus, les rayons X post-test doivent être utilisés pour évaluer le mode dans lequel les échantillons ont échoué. Une défaillance a été systématiquement observée dans le col du fémur, comme prévu, de manière bifurquée, avec une ligne de fracture parallèle à l’arbre fémoral et l’autre ligne perpendiculaire au col du fémur (figure 6). Si des variations significatives devaient se produire dans le schéma de rupture entre les échantillons, la qualité osseuse des échantillons pourrait être évaluée plus avant via μCT en mesurant des résultats tels que la densité minérale osseuse volumétrique, l’épaisseur trabéculaire et corticale, l’espacement et la minéralisation. Si la défaillance n’est pas induite de manière cohérente dans le col du fémur, les guides imprimés en 3D peuvent être ajustés.
Les mesures biomécaniques des résultats rapportées ici sont cohérentes avec les valeurs rapportées dans des configurations similaires de flexion axiale du col fémoral7,8,9,10,11,12,13,14. Cependant, l’alignement cohérent obtenu à l’aide des guides imprimés en 3D a généralement amélioré le COV de la charge maximale en particulier (tableau 1).
| Étude en cours | Sexe | Angle de l’arbre intermédiaire | Charge maximale | Raideur | Du travail à l’échec |
| Mâle | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Femelle | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Mâle | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | Mâle | NR | 19% | NR | NR |
| Kamal et al9 | Femelle | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| Middleton et al7 | Femelle | NR | 24%-27% | NR | NR |
| Brent et al11 | Femelle - rats | NR | 18%-24% | NR | NR |
| Bromer et al12* | Femelle | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | Femelle | NR | 16%-32% | NR | NR |
| Lodberg14* | Femelle | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR : Non signalé | |||||
| *: Données extrapolées à partir des chiffres publiés | |||||
Tableau 1 : Coefficients de variation des propriétés de flexion mesurées du col fémoral de souris. Les coefficients de variation représentent un rapport entre l’écart-type et la moyenne d’un ensemble de données. À mesure que le COV diminue, cela indique un regroupement plus serré des points de données individuels autour de la moyenne. Ce protocole a réduit le COV pour la charge maximale par rapport à d’autres publications effectuant des tests similaires.
Comme prévu, des différences entre les sexes ont été observées dans les propriétés mécaniques mesurées. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un test t non apparié à une queue. Le cou fémoral de souris mâles était significativement plus fort et plus rigide que celui des spécimens de souris femelles (p = 0,009 et p = 0,0006, respectivement). De plus, les cols fémoraux femelles ont présenté des déformations plus importantes (p = 0,014) et ont travaillé jusqu’à l’échec (p = 0,024) par rapport aux échantillons de souris mâles (figure 7). Ceci est cohérent avec la densité minérale osseuse plus faible chez les femelles et souligne la sensibilité du test pour détecter les différences physiologiquement pertinentes. Dans les cohortes de souris mâles et femelles utilisées dans cette étude, la densité minérale osseuse des souris femelles était significativement inférieure à celle de leurs homologues mâles, telle que déterminée par une absorptiométrie à rayons X à double énergie (DEXA) et un test t non apparié à une queue (p = 0,036).
Figure 7: Résultats biomécaniques. (A) Une courbe force-déplacement représentative, affichant un ajustement linéaire décalé de 0,2%, est utilisée pour calculer la rigidité et la limite d’élasticité. Les mesures de résultat sélectionnées sont des diagrammes de dispersion affichant la moyenne et l’écart-type, y compris (B) la charge maximale (à la défaillance), (C) la rigidité, (D) le déplacement maximal (à la défaillance) et (E) le travail à la défaillance (zone sous la courbe jusqu’au point de défaillance). Les astérisques indiquent des différences significatives déterminées à l’aide d’un test t non apparié à une queue (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 par cohorte sexuelle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour confirmer que les légères variations de l’angle d’empotage n’ont pas contribué à la variabilité expérimentale, chaque mesure de résultat biomécanique a été tracée par rapport à l’angle de rempotage et a effectué une régression linéaire simple pour la cohorte masculine, la cohorte féminine et tous les échantillons regroupés (figure 8). L’hypothèse a ensuite été testée que la pente de régression linéaire n’est pas nulle. L’analyse de régression a démontré qu’à l’exception de la rigidité, les légères variations de l’angle d’empotage (plage de 18° à 24°) n’affectaient pas les mesures biomécaniques des résultats. Pour la rigidité, il y avait une corrélation linéaire significative avec l’angle d’empotage (R2 = 0,29, p < 0,05).
Figure 8 : Effet de l’angle d’empotage sur les résultats biomécaniques. Les mesures des résultats biomécaniques, y compris (A) la charge maximale, (B) la rigidité, (C) le déplacement maximal et (D) le travail jusqu’à l’échec, ont été tracées par rapport à l’angle d’empotage et corrélées à l’aide d’une régression linéaire simple pour la cohorte masculine, la cohorte féminine et tous les échantillons regroupés. Les lignes noires pleines montrent une régression linéaire des échantillons groupés, avec des lignes pointillées indiquant les intervalles de confiance. La variabilité de l’angle d’empotage n’a pas eu d’incidence significative sur la charge maximale, le déplacement maximal ou le travail de défaillance. Cependant, à mesure que l’angle d’empotage augmentait, la rigidité augmentait, comme déterminé par un test de Pearson (p = 0,0126, n = 20). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Langage du triangle standard (. STL) des guides. Ce fichier peut être utilisé pour imprimer les guides décrits dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit un test de flexion en porte-à-faux fiable pour les cols fémoraux murins. Le scénario de flexion naturelle en porte-à-faux qui se produit au niveau du col du fémur n’est généralement pas représenté dans les tests de flexion standard à 3 et 4 points5. Cette méthode de test est meilleure et reproduit de manière plus fiable le type de fractures du col du fémur subies par les patients atteints de fragilité osseuse. L’objectif principal lors de l’exécution de ce protocole est d’éliminer la variabilité due à un rempotage incohérent de l’arbre fémoral. De manière critique, en suivant de près les étapes décrites dans les première et quatrième sections du protocole, on s’assurera que la création des guides et du protocole de chargement reproduira ce qui est rapporté dans cette publication. Comme on peut le prédire théoriquement et le montrer expérimentalement, l’angle de l’arbre moyen par rapport à l’axe de charge peut affecter les contraintes subies par le col fémoral et la probabilité que la fracture se produise au niveau du col fémoral. Les groupes précédents ont démontré que l’angle de l’arbre moyen influence de manière significative la rigidité et la résistance à la compression du fémur lorsqu’il est chargé à travers la tête fémorale. L’analyse paramétrique des effets des angles d’inclinaison de l’arbre moyen a montré que les moments de flexion maximaux dans les arbres fémoraux connaissent un minimum à des angles d’arbre moyen compris entre 15° et 25°, ce qui maximise également la rigidité de l’arbre5. Cet angle minimise donc la probabilité de fractures par compression dans l’arbre et augmente la probabilité de fractures de flexion dans le col du fémur.
Plusieurs paramètres pourraient affecter les résultats de tout test biomécanique et confondre la capacité de détecter des différences significatives dues à des variables expérimentales physiologiquement pertinentes. Cette variabilité est aggravée par la petite taille des os longs de souris. Parmi les paramètres qui nécessitent une attention particulière dans cet essai, en particulier, figurent le nombre de cycles de gel-dégel et l’état d’hydratation de l’os, le taux de charge et l’alignement de l’arbre fémoral par rapport à l’axe de charge. Le protocole stipule que tous les échantillons passent par le même nombre de cycles de gel-dégel et une fenêtre de 2 h pour l’hydratation dans le PBS à température ambiante. Le taux de charge est également réglé sur une valeur uniforme de 0,5 mm/s3,4. De plus, les guides imprimés en 3D ont été conçus pour positionner de manière cohérente le fémur à un angle médian d’environ 20 ° pendant l’étape de rempotage. Il en a résulté des angles d’arbre moyen constants compris entre 18° et 24°, sans effets sexuels significatifs en raison de différences anatomiques et de coefficients de variation de 7,6% et 6,5% pour les souris mâles et femelles, respectivement. Ces guides sont accessibles, facilement modifiables à l’aide d’un logiciel de modélisation solide standard et reproduits à la demande à l’aide d’une imprimante 3D de bureau peu coûteuse.
Les résultats représentatifs ont démontré que le protocole de test est sensible aux différences physiologiques subtiles, telles que le sexe, avec une taille d’échantillon raisonnable de n = 10. Une analyse rétrospective de la puissance tenant compte des effets de taille déterminés expérimentalement (δ = Δmean/SD) à n = 10 a suggéré que la puissance était estimée à 57 % pour la charge maximale à la défaillance (δ = 0,8), à >95 % pour la rigidité (δ = 1,77) et le déplacement maximal (δ = 1,9), et à 83 % pour le travail jusqu’à la défaillance (δ = 1,77), respectivement. En plus des petits coefficients de variation (tableau 1), cette analyse de puissance confirme que la variation de l’angle d’empotage a nui à la sensibilité et à la fiabilité du protocole.
L’analyse subjective du mode de défaillance a également démontré que 100% des échantillons testés ont échoué dans le col du fémur, car tous présentaient une fracture bifurquée, avec une ligne de fracture parallèle à l’arbre au site où elle rencontre le cou et une autre ligne de fracture perpendiculaire au col fémoral au sommet de la bifurcation. Cela englobe les caractéristiques de deux modes cliniquement pertinents de fractures du col du fémur; les fractures intertrochantériques et transcervicales du cou15. Les tests de flexion en porte-à-faux du col fémoral ne sont pas aussi couramment utilisés et décrits dans la littérature que les tests standard de torsion ou de flexion des arbres moyens fémoraux et tibiaux dans les modèles rongeurs d’ostéoporose. Seule une poignée d’études ont été identifiées pour décrire de tels protocoles à l’aide de modèles de souris et de rats5,7,8,9,16,17. L’angle auquel les fémurs ont été positionnés pendant les tests n’est pas toujours rapporté. Certains avec des descriptions détaillées utilisent une quantité excessive de luminaires et de logiciels personnalisés pour aligner leurs échantillons5, mais ont toujours recours au rempotage à la main, introduisant la même erreur humaine dans d’autres protocoles.
Ce protocole est conçu pour les échantillons murins et est spécifié pour les souris C57Bl/6 mais pourrait facilement être adapté à de grands modèles animaux ou à d’autres souches murines avec une géométrie fémorale différente. Les futurs chercheurs utilisant ce protocole devront peut-être modifier la quantité d’os exposé, car le troisième trochanter peut ne pas être exactement à 7 mm de la tête fémorale. D’autres modifications au protocole comprennent l’utilisation d’un agent de durcissement qui peut être adouci après les tests pour libérer l’échantillon si d’autres tests sont souhaités. Cela pourrait être fait avec un alliage de bismuth qui pourrait être fondu dans un bain d’eau chaude après avoir testé pour libérer l’échantillon7. La dernière modification que les utilisateurs pourraient apporter à ce protocole est éludée à l’étape 3.1, à savoir le type et le positionnement de la cellule de charge. Un capteur de pesage axial doit être utilisé avec une résolution inférieure à 1 N. Un capteur de pesage de 50 N serait approprié en fonction des charges maximales observées. En outre, un capteur de pesage qui ne mesure que la tension ou la compression doit être utilisé pour éviter tout moment de flexion composé que le capteur de pesage peut subir en raison d’une charge excentrique par rapport au capteur de pesage. Une autre façon d’éviter les mesures de force de composition serait de fixer le capteur de pesage à l’actionneur pour s’assurer que la force de charge est en ligne avec le capteur de pesage.
Ce protocole simplifie le besoin de luminaires personnalisés, décrit comment les guides peuvent être imprimés sur n’importe quelle imprimante 3D disponible dans le commerce et utilise de l’équipement de laboratoire commun pour tester les échantillons de manière approfondie et reproductible, comme le démontrent les coefficients de variation inférieurs rapportés dans la présente étude (tableau 1). Cependant, ce protocole n’est pas limité par la nécessité d’une imprimante 3D. Il existe des solutions disponibles dans le commerce, où les fichiers de rendu 3D peuvent être envoyés aux imprimeries et les pièces peuvent être renvoyées. De plus, ce mode de charge de flexion sur le col du fémur simule l’emplacement et les types de fractures cliniquement rencontrées. Avec le nombre de personnes à haut risque de fractures de fragilité, on prévoit qu’il y aura plus de 21,3 millions de fractures de la hanche chaque année d’ici 205018. L’immense fardeau sociétal, financier et médical que cela pose, des tests fiables dans des modèles de rongeurs peuvent améliorer la rigueur et la reproductibilité de la recherche axée sur la compréhension de l’étiologie de l’ostéoporose et des thérapies pour la traiter efficacement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
L’étude a été soutenue par les NIH P30AR069655 et R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
