Summary
Det nuvarande protokollet beskriver utvecklingen av en reproducerbar testplattform för murine femorala halsar i en cantilever böjning uppsättning. Anpassade 3D-utskrivna guider användes för att konsekvent och styvt fixa lårbenen i optimal inriktning.
Abstract
Frakturer i lårbenshalsen är vanliga hos personer med osteoporos. Många musmodeller har utvecklats för att bedöma sjukdomstillstånd och terapier, med biomekanisk testning som ett primärt utfallsmått. Traditionell biomekanisk testning fokuserar dock på vridnings- eller böjningstester som tillämpas på de långa benens mellanaxel. Detta är vanligtvis inte platsen för högriskfrakturer hos osteoporotiska individer. Därför utvecklades ett biomekaniskt testprotokoll som testar lårbenshalsarna av murin lårben i cantilever böjning lastning för att bättre replikera de typer av frakturer som upplevs av osteoporospatienter. Eftersom de biomekaniska resultaten är mycket beroende av den flexurala laddningsriktningen i förhållande till lårbenshalsen, skapades 3D-tryckta guider för att upprätthålla en lårbensaxel i en vinkel på 20° i förhållande till laddningsriktningen. Det nya protokollet effektiviserade testningen genom att minska variationen i anpassning (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) och förbättrad reproducerbarhet i de uppmätta biomekaniska resultaten (genomsnittlig COV = 26,7%). Det nya tillvägagångssättet med hjälp av 3D-utskrivna guider för tillförlitlig provjustering förbättrar rigor och reproducerbarhet genom att minska mätfelen på grund av feljustering av prov, vilket bör minimera provstorlekarna i musstudier av osteoporos.
Introduction
Frakturrisk är ett allvarligt medicinskt problem i samband med osteoporos. Över 1,5 miljoner skörhetsfrakturer rapporteras varje år bara i USA, med frakturer i höften, särskilt lårbenshalsen, som den ledande frakturtypen1. Det uppskattas att 18% av kvinnorna och 6% av männen kommer att uppleva en lårbensfraktur under sin livstid2, och dödligheten vid 1 år efter frakturen är större än 20%1. Därför kan musmodeller som tillåter biomekanisk testning av lårbenshalsen vara lämpliga för att studera skörhetsfrakturer. Musmodeller erbjuder också kraftfulla verktyg för att klargöra översättningsbara cellulära och molekylära händelser som är involverade i osteoporos potentiellt. Detta beror på tillgången på genetiska reportrar, vinst och förlust av funktionsmodeller och det expansiva biblioteket med molekylära tekniker och reagenser. Mekanisk testning av musben kan ge nödvändiga resultatåtgärder för att bestämma benhälsa, genotypiska och fenotypiska variationer som kan förklara sjukdomens etiologi och bedöma terapier baserat på utfallsmått av benkvaliteten och risken för fraktur3.
Lårbenshalsens anatomi skapar unika mekaniska belastningsscenarier, vilket vanligtvis leder till flexurala (böjande) frakturer. Lårbenshuvudet är laddat i acetabuläruttaget vid lårbenets proximala ände. Detta skapar ett cantilever böjningsscenario på lårbenshalsen, som är styvt fäst vid lårbensaxeln distally4. Detta skiljer sig från traditionella 3- eller 4-punkts böjningstester på lårbensmittdiafysen. Även om dessa tester är till hjälp, replikerar de inte belastningen som vanligtvis leder till skörhetsfrakturer hos osteopeniska och osteoporotiska individer när det gäller frakturplats eller belastningsscenariot.
För att bättre bedöma risken för skörhetsfrakturer hos möss, försökte man förbättra reproducerbarheten av cantilever böjningstester av murin femorala halsar. Som teoretiskt förutspått har belastningsvinkeln på lårbenshuvudet i förhållande till lårbensaxeln visat sig ha en betydande inverkan på utfallsmåtten5, vilket skapar en utmaning för tillförlitlighet och reproducerbarhet av rapporterade resultat. För att säkerställa korrekt och konsekvent inriktning av lårbenen under provberedningen utformades guider och 3D trycktes baserat på anatomiska mätningar gjorda på μCT-skanningar av C57BL/6 mus lårben. Stödlinjerna utformades för att hjälpa till att konsekvent potting proverna så att lårbensaxeln hålls vid ~ 20° från den vertikala laddningsriktningen. Denna vinkel valdes eftersom den maximerar styvheten samtidigt som den maximala böjningsmomentet längs lårbensaxeln minimeras, vilket ökar sannolikheten för lårbenshalsfrakturer och leder till mer konsekvent och reproducerbar testning5. Guiderna var 3D-printade i olika storlekar för att tillgodose anatomiska skillnader mellan prover och användes för att hålla prover i en stabil position medan de potting i akrylbencement. Styvheten, maximal kraft, avkastningskraften och maximal energi beräknades från kraftförskjutningsgraferna. Denna testmetod visade konsekventa resultat för ovannämnda biomekaniska resultatet. Med övning och hjälp av den 3D-utskrivna styrningen kan mätfel på grund av feljustering minimeras, vilket resulterar i tillförlitliga utfallsmått.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier godkändes av University of Rochester Committee of Animal Resources. Mössen som användes i denna studie var C57BL/6 hanar och honor från 24-29 veckors ålder. Möss var inrymda i standardförhållanden med mat och vatten ad libitum. Vid dödshjälp via koldioxidinandning, följt av livmoderhalscancer förskjutning, skördades 20 högra lårben (10 hanar och 10 honor) och frystes vid -20 °C tills de testades.
1. Skapande av anpassade 3D-utskrivna monteringsguider
OBS: Detta steg kan behövas eftersom olika stammar och genetiska fenotyper kan ha olika anatomiska geometrier.
- Gör μCT-skanningar av de representativa proverna.
- Skanna representativa prover på en μCT-skanner med följande inställningar: 55 kV, 145 μA för 300 ms integrationstider och upplösning på 10,5 μm voxels.
- Se till att den fångade regionen täcker lårbenets proximala ände och fortsätter ner genom mellanaxeln.
OBS: Om en μCT-skanner inte är tillgänglig kan 2D-planarröntgen av de representativa proverna användas.
- Analysera μCT-skanningarna.
- Använd den representativa uppsättningen μCT-skanningar och få en 2D-rendering av den främre vyn av det proximala lårbenet.
- Få μCT-bilder med en upplösning på 10,5 μm voxels från mellanaxeln till lårbenets proximala ände. Kompilera dessa segment med hjälp av programvara (se Tabell över material) till en 3D-rendering av exemplet.
- Bestäm en tröskel för att skilja ben från den omgivande vävnaden och applicera ett Gaussiskt filter för brusreducering.
- Orientera 3D-renderingarna för att eliminera lutning utanför axeln och se till att lårbenets främre yta ses.
- Exportera den här 2D-vyn av 3D-renderingen som en bildfil, till exempel .jpg eller .png.
- Använd en bildanalysprogramvara (se Materialtabellen) genom att rita en linje vinkelrätt mot lårbensaxeln 7 mm distally och en andra linje genom toppen av den större trochantern till mittpunkten på den ovan nämnda vinkelräta linjen (figur 1).
- Längs den 7 mm distala vinkelräta linjen mäter du lårbensaxelns diameter under den tredje trokantern.
- Använd den representativa uppsättningen μCT-skanningar och få en 2D-rendering av den främre vyn av det proximala lårbenet.
Figur 1: μCT-analys. μCT-bilder av lårben på C57Bl/6 möss används för att beräkna den genomsnittliga axelvinkeln, mätt från toppen av den större trokantern genom mitten av mellanaxeln, ~7 mm distally. Mellanaxeldiametern mättes också i denna position. 3D-renderingarna av proximal lårbenet var orienterade i en främre vy för att visa profilen för den tredje trochantern. Den genomsnittliga axelvinkeln var 93,13° (SD = 1,19°), och den genomsnittliga mellanaxeldiametern var 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Skapa monteringsguiderna med hjälp av ett 3D-modelleringsprogram (se Tabell över material) (figur 2, kompletterande fil 1).
OBS: Stödlinjerna är rektangulära kuboider som mäter 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm med ett vinklat spår, något större än den genomsnittliga axeldiametern som bestäms i steg 1.1.2. Vinkelns vinkel skapar en jämn vinkel på 20° från vertikal. Stödlinjerna ska vara konsekventa i längd, höjd och bredd, men kan tillverkas med olika spårdiametrar för att tillgodose anatomiska skillnader mellan benproverna.
Bild 2: Utformning av stödlinjerna. (A) 3D-skiss och (B) visualisering av midshaft mete fixtur före 3D-utskrift. Baserat på tidigare litteratur maximerar en mellanaxelvinkel mellan 20° styvheten. Det minimerar det maximala böjmomentet i lårbensaxeln för att säkerställa att frakturer uppstår i nacken och variationer i mekaniska resultat5. För att kompensera för 3,13° avvikelsen från vinkelrät i medelvinkeln för mellanaxeln, ställdes fixturens vinkel till 73,13° för att producera en vinkel på 20°. Justeringsarmaturer trycktes med diametrar från 1,9-2,2 mm för att säkerställa en korrekt passform för olika midshaftdiametrar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
- Skriv ut stödlinjerna med en 3D-skrivare. Stödlinjerna kan finnas kvar under testprocessen, så att skriva ut flera replikat av stödlinjerna kan vara fördelaktigt för att förbereda flera exempel samtidigt.
2. Provberedning
- Skörda mus lårbenet genom att göra ett tvärgående snitt helt runt mus buken och ta bort vävnaden från snittet till anklarna. Därefter, lokalisera höftuttaget och använd försiktigt spetsen på ett par fina tångar för att rubba höften. Skär den extra mjukvävnaden för att ta bort benet från musen.
- När benet har skördats, använd en skalpell för att rubba och skära genom knäleden. Rengör lårbenet manuellt i all mjukvävnad med tång, skalpeller och pappershanddukar.
- Testa de skördade proverna omedelbart eller förvara dem vid -20 °C i upp till 6 månader. Om proverna är frysta, låt dem komma till rumstemperatur och hydratisera i PBS i 2 timmar innan du förbereder.
- Använd 1/4" x 1/4 " fyrkantiga aluminiumrör (se Tabell av material), skär rörsektionerna 1/2" till 1" i längd. Med hjälp av ett etsningsverktyg, märk varje aluminiumsegment med prov-ID: n.
- Fyll hälften av rörsegmenten med kitt. Placera dessa rörsegment i en fixtur för att hålla dem upprätt.
- Placera de rengjorda lårbenen i de 3D-utskrivna stödlinjerna. För att göra detta, placera proverna platt på bänkskivan så att den främre ytan är vänd uppåt. Placera styrningen direkt under den tredje trokantern, där axeldiametern blir mer konsekvent.
OBS: Detta kommer att lämna ~ 7mm av det proximala lårbenet ovanför guiden. - För att förhindra att lårbenet roterar till den laterala eller mediala sidan medan du placerar på ledaren, håll de proximala och distala ändarna med en hand när du applicerar guiderna, tryck fast lårbenet på arbetsbänken och använd den andra handen, placera den 3D-utskrivna ledaren på lårbenets mittaxel. Se till att applicera lämplig diameterstyrning försiktigt, eftersom lårbenets mittaxel kan snäppa om det tvingas in i en styrning för liten.
- När guiderna är på lårbenen, placera dem framför motsvarande aluminiumsegment. Använd bencement eller andra härdningsmedel, fyll aluminiumsegmenten tills de är bara fulla och lämna lite utrymme för förskjutning.
- Placera lårbenen med guider på i rätt aluminiumsegment.
OBS: Guiderna kommer inte att centreras på aluminiumsegmenten, sittande något åt ena sidan för att tillåta lårbenets distala ände att sitta i mitten av aluminiumkrukan. - Låt härdningsmedlet ställa in. När du har ställt in dem placerar du proverna i en Petriskål med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i rumstemperatur och låter rehydrera i 2 timmar (figur 3).
Bild 3: Provberedning med anpassade jiggar och metefixturer. (A) Prover i aluminiumkrukor med rätt inriktning underhålls med hjälp av de 3D-utskrivna guiderna medan bencementet torkar. B) Röntgen före provning visar skuggan av metefixturer och fullständig täckning av bencement som omger lårbenets distala ände. Det mättade vita området längst ner i aluminiumkrukorna är kitt, används för att hålla bencement i krukor vid härdning. Skalstreck (panel B) = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Maskinvaruuppsättning
- Använd ett mekaniskt testsystem (MTS) och fäst och kalibrera en lastcell med upplösning <1 N (se Materialtabell) (figur 4A).
OBS: Lastcellen kan monteras på scenen eller helst ställdonet när det är möjligt. - Fäst en fixtur med en fyrkantig slits som håller aluminiumsegmenten ordentligt med proverna. Fäst de inställda skruvarna på de två sidorna av hållfixturen för att hålla fast proverna på plats. (Figur 4B).
OBS: Denna fixtur kan 3D-skrivas ut eller bearbetas och sedan knackas med gängade skruvhål för att monteras på testramen. - Fäst en lastplåt på ställdonet. Detta kan helt enkelt vara en avsmalnande skruv med en tillplattad spets (bild 4C).
- Placera ett stereomikroscope på ett bord eller en yta direkt framför MTS. Om ytterligare belysning behövs för att se upplägget genom mikroskopet, placera dessa runt systemet.
Bild 4: Maskinvaruuppsättning (A) Inställda provningar på mekaniskt provningssystem, med 1 kN-belastningscell (upplösning < 1 N) och svart biaxialsteg för att säkerställa korrekt provpositionering. (B) Närbild på den 3D-utskrivna monteringsfixturen som är fäst vid lastcellen med en M10 gängad stång och två M4-bultar som används för att hålla aluminiumkrukan på plats. (C) Vy över provet genom ett stereomikroskop med en avsmalnande lastfixtur. Skalstreck (panel C) = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Programvaruuppsättning
- I MTS-programvaran börjar du skapa ett nytt flexuralt (böjnings)protokoll. Se till att protokollet fungerar i förskjutningskontroll.
- Ställ in protokollets laddningshastighet till 0,5 mm/s.
- Om programvaran har en inställning för mjuka nycklar lägger du till de mjuka tangenterna "Balans" och "Noll förlängning" i protokollet.
OBS: Detta ställer snabbt in last- och ställdonspositionen till 0 innan du testar varje prov. - Se till att programvaran registrerar tiden i sekunder, laddas i Newtons och förlängning eller förskjutning i millimeter med en minsta samplingshastighet på 100 Hz.
- Spara det nya protokollet och gå tillbaka till programmets huvudskärm för att börja testa en ny provuppsättning.
5. Testa upplägget
- Innan du monterar proverna på MTS, skaffa en röntgenbild av proverna i aluminiumkrukorna. Flera exempel kan avbildas samtidigt. Se till att den främre vyn av proverna fångas in för att möjliggöra verifieringsmätningar av pottingvinkeln (figur 5).
Figur 5. Bedömning av provjustering. A) Axelvinkeln från vertikal mäts från plana digitala röntgenstrålar. B) Representativa torktumlar varierade från 18,11° till 23,99°, med en variationskoefficient (COV) på 7,1% (n = 20). Könsskillnader på grund av anatomiska variationer var inte statistiskt signifikanta, enligt ett ensidigt opared t-test (p < 0,05). Skalstreck (panel A) = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Placera aluminiumsegmentet med prov i hållfixturen och dra åt setskruvarna.
- Sänk ställdonet/lastplattan tills den är inom några millimeter från lårbenshuvudet.
OBS: Förladda inte provet med någon kraft och var försiktig så att du inte sänker ställdonet för snabbt, eftersom det är mycket lätt att skada prover. - Använd stereomikroscopet och justera biaxialsteget för att justera lårbenshuvudets position direkt under lastplattan. Lås biaxialstadiet på plats.
- I MTS-programvaran nollställer du ställdonets position och balanserar lastcellen med hjälp av de mjuka tangenterna som läggs till i steg 4.3.
- Påbörja laddningsprotokollet. Beroende på hur mycket utrymme som fanns kvar mellan lastplattan och provet tar testningen bara 10-30 s.
- Efter testningen, fånga en annan främre röntgen av provet. Detta kommer att användas för att urskilja och dokumentera frakturläget (figur 6).
Bild 6: Röntgenbild av prover efter provning. Alla prover som bryts i en bifurcated linje genom lårbenshalsen och längs lårbenshalsaxfästet (markeras av den orange cirkeln). Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Dataanalys
- Efter datainsamling exporterar du kraft- och förskjutningsdata till programvara (se Tabell över material) som möjliggör grafering och matematiska beräkningar.
- Rita lasten kontra förskjutning för varje prov (figur 7A). Passa en linjär approximation till det linjära segmentet i belastningsförskjutningskurvan. Lutningen på denna linjära passform kommer att definiera styvheten, ett mått på provets elasticitet.
- Beräkna ytterligare resultat som maximal belastning, maximal deplacement, utbytesbelastning, förskjutning vid utbytespunkt, energi till maximal belastning och energi till avkastningspunkten.
OBS: Avkastningspunkten kan bestämmas genom att den linjära approximationen som bestäms i steg 6,2 med 0,2 %6 avstämds. Den punkt där den inställda linjen och belastningen kontra. förskjutningskurvan skär ut utbytespunkten. När det gäller mycket spröda prover som uppvisar liten avkastning kan avkastningspunkten vara densamma som den maximala punkten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När de krukades med hjälp av guiden, var lårbensaxlarna inriktade på 21,6 ° ± 1,5°. Även om detta representerar <10% avvikelse från den avsedda vinkeln på 20°, var variationskoefficienterna (COV) för pottingvinkeln för alla prov som testades 7,6% respektive 6,5% för han- och honmöss(n = 10 per grupp) som verifierats av förtestplanerade röntgenstrålar (figur 5). Dessutom bör röntgenbilderna efter testningen användas för att bedöma i vilket läge proverna misslyckades. Misslyckande observerades konsekvent i lårbenshalsarna, som avsett, på ett bifurcated sätt, med en frakturlinje parallellt med lårbensaxeln och den andra linjen vinkelrätt mot lårbenshalsen (figur 6). Om betydande variationer skulle uppstå i brottsmönstret bland proverna, skulle provernas benkvalitet kunna bedömas ytterligare via μCT genom att mäta resultat som volymetrisk benmineraltäthet, trabekulär och när tjocklek, avstånd och mineralisering. Om fel inte konsekvent induceras i lårbenshalsen kan de 3D-utskrivna stödlinjerna justeras.
De biomekaniska utfallsmåtten som rapporteras häri överensstämmer med värden som rapporteras i liknande axiella böjning av lårbenshalskonfigurationer7,8,9,10,11,12,13,14. Den konsekventa justering som uppnåddes med hjälp av de 3D-utskrivna stödlinjerna förbättrade dock i allmänhet cov för den maximala belastningen i synnerhet (tabell 1).
| Aktuell studie | Sex | Medelaxelvinkel | Max belastning | Stelhet | Arbete till misslyckande |
| Manlig | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Kvinnlig | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Manlig | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | Manlig | NR | 19% | NR | NR |
| Kamal et al9 | Kvinnlig | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| Middleton et al7 | Kvinnlig | NR | 24%-27% | NR | NR |
| Brent et al11 | Hona - råttor | NR | 18%-24% | NR | NR |
| Bromer et al12* | Kvinnlig | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | Kvinnlig | NR | 16%-32% | NR | NR |
| Lodberg14* | Kvinnlig | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: Inte rapporterat | |||||
| *: Data extrapolerade från publicerade siffror | |||||
Tabell 1: Variationskoefficienter för uppmätta flexurala egenskaper hos musfeorala halsar. Variationskoefficienterna representerar ett förhållande mellan standardavvikelsen och medelvärdet för en datauppsättning. När COV minskar indikerar detta en snävare gruppering av de enskilda datapunkterna runt medelvärdet. Detta protokoll minskade COV för maximal belastning jämfört med andra publikationer som utför liknande tester.
Som förväntat observerades könsskillnader i de uppmätta mekaniska egenskaperna. Statistiska analyser utfördes med hjälp av ett ensidigt oparerat t-test. Femorala halsar från hanmöss var betydligt starkare och styvare än exemplar från honmöss (p = 0,009 respektive p = 0, 0006). Dessutom upplevde de kvinnliga lårbenshalsarna mer betydande deformationer (p = 0,014) och arbetade för att misslyckas (p = 0,024) jämfört med exemplar från hanmöss (figur 7). Detta överensstämmer med den lägre benmineraltätheten hos honor och understryker testets känslighet för att upptäcka fysiologiskt relevanta skillnader. I de han- och honmöskohorter som användes i denna studie var honmössens benmineraltäthet betydligt lägre än deras manliga motsvarigheter, vilket bestäms av en dubbelenergiröntgen absorptiometriskanning (DEXA) och ett enstjärtat oparerat t-test (p = 0, 036).
Figur 7: Biomekaniska resultat. (A) En representativ kraftförskjutningskurva, som uppvisar en linjär förskjutningspassning på 0,2 %, används för att härleda styvheten och utbytespunkten. Valda utfallsmått är punktdiagram som visar medelvärde och standardavvikelse, inklusive (B) maximal belastning (vid fel), (C) styvhet, (D) maximal förskjutning (vid fel) och (E) arbete till misslyckande (område under kurvan upp till felpunkten). Asterisker indikerar signifikanta skillnader som bestäms med hjälp av ett ensidigt oparerat t-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 per kön kohort). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
För att bekräfta att de små variationerna i pottingvinkeln inte bidrog till den experimentella variabiliteten, ritades varje biomekaniskt utfallsmått mot pottingvinkeln och utförde en enkel linjär regression för den manliga kohorten, den kvinnliga kohorten och alla prover grupperade tillsammans (figur 8). Hypotesen testades sedan att den linjära regressionslutningen inte är noll. Regressionsanalysen visade att de små variationerna i pottingvinkeln (intervall 18° till 24° med undantag för styvheten inte påverkade de biomekaniska utfallsmåtten. För styvhet fanns det en signifikant linjär korrelation med pottingvinkeln (R2 = 0,29, s < 0,05).
Figur 8: Pottingvinkelns effekt på biomekaniska resultat. Biomekaniska utfallsmått inklusive (A) maximal belastning, (B) styvhet, (C) maximal förskjutning och (D) arbete till misslyckande plottades mot pottingvinkeln och korrelerades med hjälp av en enkel linjär regression för den manliga kohorten, den kvinnliga kohorten och alla prover grupperade tillsammans. Helsvarta linjer visar linjär regression av grupperade exempel, med prickade linjer som anger konfidensintervall. Variabiliteten i pottingvinkeln påverkade inte avsevärt maximal belastning, maximal förskjutning eller felarbete. Men när pottingvinkeln ökade ökade styvheten, vilket bestäms av en Pearsons test (p = 0,0126, n = 20). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande fil 1: Standard triangelspråk (. STL) fil av guiderna. Den här filen kan användas för att skriva ut stödlinjerna som beskrivs i protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver ett tillförlitligt cantilever böjningstest för murine femorala halsar. Det naturliga cantilever flexure scenariot som uppstår vid lårbenshalsen är vanligtvis inte representerat i standard 3- och 4-punkts böjningstester5. Denna testmetod är bättre och mer tillförlitligt replikerar den typ av femorala halsfrakturer som upplevs av ben bräcklighet patienter. Huvudfokus när du utför detta protokoll är att eliminera variabiliteten på grund av inkonsekvent potting av lårbensaxeln. Om du noga följer stegen i det första och fjärde avsnittet i protokollet kommer det att säkerställas att skapandet av stödlinjerna och laddningsprotokollet replikerar det som rapporteras i den här publikationen. Som teoretiskt kan förutsägas och visas experimentellt kan mellanaxelvinkeln i förhållande till lastaxeln påverka de påfrestningar som lårbenshalsen upplever och sannolikheten för att frakturen uppstår vid lårbenshalsen. Tidigare grupper har visat att mellanaxelvinkeln väsentligt påverkar lårbenets kompressiva styvhet och styrka när den laddas genom lårbenshuvudet. Parametrisk analys av effekterna av midshaft lutningsvinklar visade att de maximala böjningsmomenten i lårbensaxlarna upplever ett minimum vid mellanaxelvinklar mellan 15° och 25°, vilket också maximerar axelstyvheten5. Denna vinkel minimerar därför sannolikheten för kompressionsfrakturer i axeln och ökar sannolikheten för flexurala frakturer i lårbenshalsen.
Flera parametrar kan påverka resultaten av alla biomekaniska tester och förvirra förmågan att upptäcka betydande skillnader på grund av fysiologiskt relevanta experimentella variabler. Denna variabilitet förvärras av den lilla storleken på långa musben. Bland de parametrar som kräver uppmärksamhet i detta test är i synnerhet antalet frys-tina cykler och hydreringstillstånd i benet, laddningshastigheten och justeringen av lårbensaxeln i förhållande till lastaxeln. Protokollet föreskriver att alla prover går igenom samma antal frys-tina cykler och ett 2 h fönster för hydrering i PBS vid rumstemperatur. Lasthastigheten är också inställd på ett enhetligt värde på 0,5 mm/s3,4. Dessutom utformades 3D-utskrivna guider för att konsekvent placera lårbenet i en medelaxelvinkel på ~ 20° under pottingsteget. Detta resulterade i konsekventa midshafts vinklar i intervallet 18° till 24°, med inga betydande könseffekter på grund av att funktionella skillnader och variationskoefficienter på 7,6% respektive 6,5% för manliga och kvinnliga möss. Dessa guider är tillgängliga, lätt att modifiera med hjälp av standard programvara för solid modellering och återges på begäran med en billig stationär 3D-skrivare.
De representativa resultaten visade att testprotokollet är känsligt för subtila fysiologiska skillnader, såsom kön, med en rimlig provstorlek på n = 10. En retrospektiv effektanalys som redovisar experimentellt bestämda storlekseffekter (δ = Δmean/SD) vid n = 10 föreslog att effekten uppskattades till 57% för den maximala belastningen vid fel (δ = 0,8), >95% för styvheten (δ = 1,77) respektive den maximala förskjutningen (δ = 1,9) och 83% för arbetet att misslyckas (δ. Tillsammans med de små variationskoefficienterna (tabell 1) bekräftar denna effektanalys att variationen i pottingvinkeln påverkade protokollets känslighet och tillförlitlighet negativt.
Den subjektiva analysen av felläget visade också att 100% av de testade proverna misslyckades i lårbenshalsen, eftersom alla visade en bifurcated fraktur, med en fraktur linje löper parallellt med axeln på platsen möter den nacken och en annan fraktur linje vinkelrätt mot femorala hals vid toppen av bifurcation. Detta omfattar funktioner från två kliniskt relevanta lägen av femorala halsfrakturer; intertrochanteriska och transcerviska nackfrakturer15. Femorala hals cantilever böjning tester är inte lika vanliga används och beskrivs i litteraturen som standard vridning eller flexure testning av femorala och tibial midshafts i gnagare modeller av osteoporos. Endast en handfull studier identifierades för att beskriva sådana protokoll med hjälp av mus- och råttamodeller5,7,8,9,16,17. Vinkeln där lårbenen placerades under provningen rapporteras inte alltid. Vissa med detaljerade beskrivningar använder en överdriven mängd anpassade fixturer och programvara för att justera sina prover5 men tillgriper fortfarande potting för hand, vilket introducerar samma mänskliga fel i andra protokoll.
Detta protokoll är utformat för murinprover och specificeras för C57Bl/6 möss men kan enkelt anpassas till stora djurmodeller eller andra murinstammar med olika femorala geometri. Framtida utredare som använder detta protokoll kan behöva ändra mängden exponerat ben, eftersom den tredje trochantern kanske inte är exakt 7 mm distally från lårbenshuvudet. Ytterligare ändringar av protokollet inkluderar användning av ett härdnings medel som kan mjukas upp efter testningen för att släppa provet om ytterligare testning önskas. Detta kan göras med en vismutlegering som kan smältas i ett varmvattenbad efter testning för att släppa provet7. Den slutliga ändringen som användare kan göra i det här protokollet gäckas till i steg 3.1, vilket är typ och placering av belastningscellen. En axiell belastningscell ska användas med upplösning under 1 N. En 50 N-belastningscell skulle vara lämplig baserat på de maximala belastningar som observerats. Dessutom bör en belastningscell som endast mäter spänning eller komprimering användas för att undvika eventuella sammansatta böjmoment som lastcellen kan uppleva från excentrisk belastning i förhållande till belastningscellen. Ett annat sätt att undvika sammansatta kraftmätningar skulle vara att fästa lastcellen på ställdonet för att säkerställa att lastkraften är i linje med belastningscellen.
Detta protokoll förenklar behovet av anpassade fixturer, beskriver hur guider kan skrivas ut på alla kommersiellt tillgängliga 3D-skrivare och använder vanlig laboratorieutrustning för att noggrant och reproducerbart testa prover, vilket framgår av de lägre variationskoefficienter som rapporterats i den aktuella studien (tabell 1). Det här protokollet begränsas dock inte av behovet av en 3D-skrivare. Det finns kommersiellt tillgängliga lösningar, där 3D-renderingsfilerna kan skickas till tryckerier och delarna kan skickas tillbaka. Dessutom simulerar detta sätt att böja belastning på lårbenshalsen platsen och typerna av frakturer kliniskt påträffade. Med en hög risk för skörhetsfrakturer förutspås det att det kommer att finnas uppemot 21,3 miljoner höftfrakturer varje år fram till 205018. Den enorma samhälleliga, finansiella och medicinska börda som detta innebär, tillförlitlig testning i gnagaremodeller kan förbättra rigor och reproducerbarhet av forskning inriktad på att förstå etiologin för osteoporos och terapier för att behandla den effektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av NIH P30AR069655 och R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
