Summary
本議定書は、片持ち梁曲げセットアップにおけるマウス大腿骨頸部のための再現性のある試験プラットフォームの開発を記述している。カスタム3Dプリントガイドを使用して、大腿骨を最適なアライメントで一貫してしっかりと固定しました。
Abstract
大腿骨頸部の骨折は、骨粗鬆症を有する個体において一般的な発生である。疾患の状態と治療法を評価するために多くのマウスモデルが開発されており、生体力学的検査が主要な転帰尺度となっています。しかし、従来の生体力学的試験は、長骨の中間軸に適用されるねじりまたは曲げ試験に焦点を当てている。これは、典型的には、骨粗鬆症患者における高リスク骨折の部位ではない。したがって、骨粗鬆症患者が経験する骨折の種類をよりよく再現するために、片持ち梁曲げ荷重でマウス大腿骨の大腿骨頸部を試験する生体力学的試験プロトコルが開発された。生体力学的結果は、大腿骨頸部に対する曲げ荷重方向に大きく依存するため、3Dプリントガイドは、荷重方向に対して20°の角度で大腿骨シャフトを維持するために作成されました。新しいプロトコルは、アライメントのばらつき(21.6°±1.5°、COV = 7.1%、n = 20)を低減し、測定された生体力学的結果の再現性を向上させる(平均COV = 26.7%)ことにより、試験を合理化しました。信頼性の高い試料アライメントのために3Dプリントガイドを使用する新しいアプローチは、骨粗鬆症のマウス研究におけるサンプルサイズを最小限に抑えるはずの、試料ミスアライメントによる測定誤差を低減することにより、厳密さと再現性を向上させます。
Introduction
骨折リスクは、骨粗鬆症に関連する深刻な医学的懸念である。米国だけでも毎年150万件以上の脆弱性骨折が報告されており、主要な骨折タイプ1として股関節、特に大腿骨頸部に骨折が起こっています。女性の18%、男性の6%が一生のうちに大腿骨頚部骨折を経験すると推定され2、 骨折後1年の死亡率は20%を超えています1。したがって、大腿骨頸部の生体力学的試験を可能にするマウスモデルは、脆弱性骨折の研究に適している可能性がある。マウスモデルはまた、骨粗鬆症に潜在的に関与する翻訳可能な細胞および分子事象を解明するための強力なツールを提供する。これは、遺伝子レポーターの利用可能性、機能モデルの利得と喪失、および分子技術と試薬の広範なライブラリによるものです。マウスの骨の機械的検査は、疾患の病因を説明する可能性のある骨の健康状態、遺伝子型および表現型の変動を決定し、骨の質および骨折のリスクの転帰尺度に基づいて治療法を評価するために必要な転帰尺度を提供することができる3。
大腿骨頸部の解剖学的構造は、典型的には曲げ(曲げ)骨折につながるユニークな機械的負荷シナリオを作成する。大腿骨頭は、大腿骨の近位端にある寛骨臼ソケットに装填される。これにより、大腿骨頸部に片持ち梁曲げシナリオが作成され、大腿骨軸に遠位に取り付けられます4。これは、大腿骨中枢骨幹に対する従来の3点または4点曲げ試験とは異なります。これらの試験は有用であるが、骨折位置または負荷シナリオに関して、骨減少性および骨粗鬆症の個体において脆弱性骨折に典型的につながる負荷を再現しない。
マウスにおける脆弱性骨折リスクをよりよく評価するために、マウス大腿骨頸部の片持ち梁曲げ試験の再現性を改善することが求められた。理論的に予測されたように、大腿骨軸に対する大腿骨頭部への荷重角度は、転帰尺度5に大きく影響することが示されており5、それによって報告された転帰の信頼性および再現性に対する課題が生じている。サンプル調製中に大腿骨の適切かつ一貫した位置合わせを確実にするために、C57BL/6マウス大腿骨のμCTスキャンで行われた解剖学的測定に基づいてガイドを設計し、3Dプリントしました。ガイドは、大腿骨シャフトが垂直荷重方向から約20°に維持されるように、サンプルを一貫してポッティングするのに役立つように設計されています。この角度が選択されたのは、大腿骨シャフトに沿った最大曲げモーメントを最小限に抑えながら剛性を最大化し、大腿骨頸部骨折の可能性を高め、より一貫性のある再現性のある試験につながるためです5。ガイドは、サンプル間の解剖学的違いに対応するためにさまざまなサイズで3Dプリントされ、アクリル骨セメントでポッティングしながらサンプルを安定した位置に保持するために使用されました。剛性、最大力、降伏力、および最大エネルギーは、力-変位グラフから計算されました。この試験方法は、前述の生体力学的結果について一貫した結果を示した。練習と3Dプリントガイドの助けを借りて、ミスアライメントによる測定誤差を最小限に抑えることができ、信頼性の高い結果測定が得られます。
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Protocol
動物実験はロチェスター大学動物資源委員会によって承認された。本試験で用いたマウスは、24~29週齢のC57BL/6雌雄であった。マウスを、食物および水を自由摂取させた標準条件下で飼育した。二酸化炭素吸入 による 安楽死、続いて子宮頸部脱臼に際し、20個の右大腿骨(10個の雄および10個の雌)を収穫し、試験するまで−20°Cで凍結した。
1. カスタム3Dプリントマウントガイドの作成
注:このステップは、異なる株および遺伝的表現型が異なる解剖学的形状を有する可能性があるため、必要であり得る。
- 代表的なサンプルのμCTスキャンを取得します。
- μCTスキャナで代表的なサンプルを、55 kV、145 μA(積分300 ms)、分解能10.5 μmボクセルでスキャンします。
- キャプチャされた領域が大腿骨の近位端をカバーし、中央シャフトを通って下方に続くことを確認します。
注:μCTスキャナが利用できない場合は、代表サンプルの2D平面X線を使用できます。
- μCTスキャンを分析します。
- μCTスキャンの代表的なセットを使用して、近位大腿骨の前方図の2Dレンダリングを得る。
- 中軸から大腿骨の近位端までの分解能10.5μmボクセルのμCT画像を取得します。ソフトウェアを使用してこれらのスライスをコンパイルし( 材料表を参照)、サンプルの 3D レンダリングにします。
- 骨と周囲の組織を区別するためのしきい値を決定し、ノイズリダクションのためにガウスフィルタを適用します。
- 3D レンダリングの向きを変えて、軸外の傾きをなくし、大腿骨の前面が見えるようにします。
- この 3D レンダリングの 2D ビューを、.jpg や .png などのイメージ ファイルとしてエクスポートします。
- 画像解析ソフトウェア( 材料表参照)を用いて、遠位7mmの大腿骨軸に垂直な線と、大転子のピークを通る第2の線を前述の垂線の中点まで引いて、大腿骨軸角度を測定します(図1)。
- 7mmの遠位垂直線に沿って、第3転子の下の大腿骨軸径を測定する。
- μCTスキャンの代表的なセットを使用して、近位大腿骨の前方図の2Dレンダリングを得る。
C57Bl/6マウスの大腿骨のμCT画像を使用して、大転子の上部から中軸の中心を通って遠位約7mmまで測定された平均軸角を計算します。ミッドシャフトの直径もこの位置で測定した。近位大腿骨の3Dレンダリングは、第3転子のプロファイルを表示するために正面図に向けられた。平均軸角は93.13°(SD = 1.19°)、平均中軸径は1.53mm(SD = 0.14mm)(n=20)であった。スケール バー = 1 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 3Dモデリングソフトウェアプログラム( 材料表を参照)を使用して取り付けガイドを作成します(図2、 補足ファイル1)。
メモ:ガイドは、6.25 mm x 3.25 mm x 7mmの長方形の直方体で、斜めのスロットがあり、ステップ1.1.2で決定した平均シャフト直径よりわずかに大きいです。スロットの角度は、垂直から20°の一貫した角度を作成します。ガイドは長さ、高さ、幅が一貫している必要がありますが、骨サンプル間の解剖学的違いに対応するために、さまざまなスロット直径で作成できます。
図2:ガイドの設計 。(A)3Dスケッチと(B)3Dプリント前のミッドシャフト釣り治具の視覚化。以前の文献に基づいて、20°の間の中間軸角度は剛性を最大化します。大腿骨シャフトの最大曲げモーメントを最小限に抑え、首に骨折が発生し、機械的結果の変動性を確保します5。ミッドシャフト平均角度の垂直からの3.13°の偏差を補うために、フィクスチャ角度を73.13°に設定して20°の角度を生成しました。アライメント治具は、さまざまなミッドシャフト直径に適切にフィットするように、直径1.9〜2.2mmで印刷されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 3D プリンターを使用して、ガイドを印刷します。ガイドはテストプロセス中にオンのままにしておくことができるため、ガイドの複数の複製を印刷することは、一度に複数のサンプルを調製するのに有益です。
2. サンプル調製
- マウス腹部の周囲を完全に横切開し、切開部から足首まで組織を除去することにより、マウス大腿骨を採取する。これに続いて、股関節ソケットを見つけ、一対の細かい鉗子の先端を慎重に使用して股関節を脱臼させます。追加の軟部組織を切断して、マウスから脚を取り除きます。
- 脚が収穫されたら、メスを使って脱臼し、膝関節を切り裂きます。鉗子、メス、ペーパータオルを使用して、すべての軟部組織の大腿骨を手動で清掃します。
- 採取したサンプルを直ちにテストするか、-20 °C で最大 6 か月間保存します。サンプルが凍結している場合は、室温まで上げてPBSで2時間水分補給してから準備してください。
- 1/4インチ x 1/4インチの正方形アルミチューブ( 材料表を参照)を使用して、チューブセクションを長さ1/2インチから1インチに切断します。エッチングツールを使用して、各アルミニウムセグメントにサンプルIDのラベルを付けます。
- チューブセグメントの半分をパテで満たします。これらのチューブセグメントを固定具に入れて、直立させます。
- クリーニングした大腿骨を3Dプリントされたガイドに入れます。これを行うには、前面が上を向くようにサンプルをベンチトップに平らに置きます。シャフトの直径がより一定になる第3転子の真下にガイドを置きます。
注:これにより、ガイドの上に近位大腿骨の〜7mmが残ります。 - ガイド上に配置中に大腿骨が横側または内側に回転するのを防ぐために、ガイドを塗布するときに片手で近位端と遠位端を持ち、大腿骨を作業台にしっかりと押し付け、もう一方の手で3Dプリントされたガイドを大腿骨の中央軸に置きます。小さすぎるガイドに押し込まれると大腿骨の中央軸がカチッと鳴る可能性があるため、適切な直径ガイドを優しく適用してください。
- ガイドが大腿骨に着いたら、対応するアルミニウムセグメントの前に置きます。骨セメントまたは他の硬化剤を使用して、アルミニウムセグメントをちょうどいっぱいになるまで充填し、変位のための少しの余地を残す。
- ガイド付きの大腿骨を正しいアルミニウムセグメントに置きます。
注:ガイドはアルミニウムセグメントの中央にはなく、大腿骨の遠位端がアルミポットの中央に座るように片側にわずかに座っています。 - 硬化剤の設定を許可します。セットしたら、サンプルを室温のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシャーレに入れ、2時間再水和させます(図3)。
図3:カスタム治具と釣り治具を使用したサンプル調製。 (A)適切な位置合わせが整列したアルミニウムポット内のサンプルは、骨セメントが乾燥している間、3Dプリントされたガイドを使用して維持されます。(B)試験前のX線は、釣り治具の影と大腿骨の遠位端を囲む骨セメントの完全な被覆を示す。アルミポットの底にある飽和した白い領域はパテで、硬化時に骨セメントをポットに保持するために使用されます。スケール バー (パネル B) = 5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. ハードウェアのセットアップ
- 機械試験システム(MTS)を使用して、分解能<1Nのロードセルを取り付けて校正します( 材料表を参照)(図4A)。
注:ロードセルは、ステージに取り付けることができ、可能であれば、好ましくはアクチュエータに取り付けることができます。 - サンプルでアルミニウムセグメントをしっかりと保持する正方形のスロットを備えた固定具を取り付けます。固定具の両側に止めネジを取り付けて、サンプルを所定の位置にしっかりと保持します。(図4B)。
メモ:この固定具は、3Dプリントまたは機械加工してから、ネジ穴でタップしてテストフレームに取り付けることができます。 - ローディングプラテンをアクチュエータに取り付けます。これは、先端が平らになったテーパネジにすぎません(図4C)。
- 実体顕微鏡をMTSの真正面のテーブルまたは表面に置きます。顕微鏡を通してセットアップを見るために追加の照明が必要な場合は、これらをシステムの周りに配置します。
図4:ハードウェア のセットアップ(A)適切なサンプル位置決めを保証するための1kNロードセル(分解能<1N)と黒色の2軸ステージを備えた機械試験システムでのテストのセットアップ。(B)ロードセルに取り付けられた3Dプリントされた取り付け器具を、M10ねじ棒とアルミニウムポットを所定の位置に保持するために使用される2本のM4ボルトでクローズアップする。(c)テーパ状の装填具を備えた実体顕微鏡を通しての試料の眺め。スケール バー (パネル C) = 5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. ソフトウェアのセットアップ
- MTS ソフトウェアで、新しい曲げ(曲げ)プロトコルの作成を開始します。プロトコルが変位制御で動作することを確認します。
- プロトコルのロード速度を 0.5 mm/s に設定します。
- ソフトウェアにソフトキーの設定がある場合は、ソフトキー「バランス」と「ゼロエクステンション」をプロトコルに追加します。
注:これにより、各サンプルをテストする前に、負荷とアクチュエータの位置がすぐに0に設定されます。 - ソフトウェア・プログラムが、最小サンプリング・レート100 Hzで、時間を秒単位で、負荷をニュートン単位で、拡張または変位をミリメートル単位で記録することを確認します。
- 新しいプロトコルを保存し、ソフトウェアプログラムのメイン画面に戻り、新しいサンプルセットのテストを開始します。
5. セットアップのテスト
- 試料をMTSに取り付ける前に、アルミニウムポット内の試料のX線画像を得る。一度に複数のサンプルを画像化できます。ポッティング角度の検証測定を可能にするために、サンプルの正面図がキャプチャされていることを確認します(図5)。
図5.サンプルアライメントの評価。 (A)垂直からの軸角は、平面デジタルX線から測定される。(B)代表的な鉢植え大腿骨軸角度は18.11°~23.99°の範囲であり、変動係数(COV)は7.1%(n = 20)であった。解剖学的変異による性差は、片側不対t検定(p <0.05)を用いて決定されたように、統計的に有意ではなかった。スケール バー (パネル A) = 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- サンプルを含むアルミニウムセグメントを保持固定具に入れ、止めネジを締めます。
- 大腿骨頭から数ミリメートル以内になるまでアクチュエータ/ローディングプラテンを下げます。
メモ:サンプルを無理にプリロードしたり、アクチュエータを速く下げすぎないように注意してください。 - 実体顕微鏡を使用して、二軸ステージを調整して、ローディングプラテンの真下にある大腿骨頭の位置を揃えます。2 軸ステージを所定の位置にロックします。
- MTSソフトウェアでは、アクチュエータの位置をゼロにし、ステップ4.3で追加したソフトキーを使用してロードセルのバランスを取ります。
- ロードプロトコルを開始します。ローディングプラテンとサンプルの間にどれだけのスペースが残っていたかに応じて、テストには10〜30秒しかかかりません。
- 試験後、試料の別の前方X線を捕捉する。これは、フラクチャのモードを識別して文書化するために使用されます(図6)。
図6:試験後のサンプルのX線画像。 すべてのサンプルは、大腿骨頸部を通って、そして大腿骨首 - 軸アタッチメント(オレンジ色の円で強調表示されている)に沿って二股に分かれた線で骨折した。スケール バー = 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6. データ解析
- データ収集後、力と変位のデータをソフトウェア( 材料表を参照)にエクスポートし、グラフ化と数学的計算を可能にします。
- 荷重と負荷をプロット する各サンプルの変位(図7A)。線形近似を荷重-変位曲線の線形セグメントに適合させます。この線形適合の傾きは、サンプルの弾性の尺度である剛性を定義します。
- 最大荷重、最大変位、降伏荷重、降伏点での変位、最大荷重に対するエネルギー、降伏点に対するエネルギーなどの追加結果を計算します。
注: 降伏点は、ステップ 6.2 で決定した線形近似値を 0.2% 6 オフセットすることによって決定できます。オフセット線と負荷が 対する点。交差する変位曲線が降伏点を決定することになる。収率をほとんど示さない非常に脆いサンプルの場合、降伏点は最大点と同じであり得る。
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Representative Results
ガイドの助けを借りて鉢植えにすると、大腿骨シャフトは21.6°±1.5°に整列した。これは意図した角度20°から<10%のずれを表していますが、試験前の平面X線で検証されたように、試験したすべてのサンプルにわたるポッティング角度の変動係数(COV)は、雄マウスと雌マウスでそれぞれ7.6%と6.5%(1群あたりn = 10)でした(図5)。さらに、テスト後のX線を使用して、サンプルが失敗したモードを評価する必要があります。骨折は、意図したように、大腿骨頸部において、1本の骨折線が大腿骨軸に平行で、もう1本の線が大腿骨頚部に垂直な状態で、二股に分かれて一貫して観察された(図6)。サンプル間で破損パターンに著しいばらつきが生じた場合、体積骨塩密度、骨梁および皮質の厚さ、間隔、石灰化などの結果を測定することによって、μCT を介して サンプルの骨品質をさらに評価することができます。大腿骨頸部に障害が一貫して誘発されない場合は、3Dプリントガイドを調整することができます。
本明細書で報告される生体力学的転帰尺度は、大腿骨頚部構成の同様の軸方向曲げにおいて報告された値と一致している7、8、9、10、11、12、13、14。しかし、3Dプリントガイドを使用して達成された一貫したアライメントは、一般的に特に最大荷重のCOVを改善しました(表1)。
| 現在の研究 | 性 | ミッドシャフト角度 | 最大負荷 | 硬直 | 失敗への取り組み |
| 男性 | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| 女性 | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | 男性 | ティッカー | 22% | ティッカー | ティッカー |
| Jämsä et al8 | 男性 | ティッカー | 19% | ティッカー | ティッカー |
| カマルら9 | 女性 | ティッカー | 16%-25% | 11%-28% | ティッカー |
| ミドルトンら7 | 女性 | ティッカー | 24%-27% | ティッカー | ティッカー |
| ブレントら11 | 女性 - ラット | ティッカー | 18%-24% | ティッカー | ティッカー |
| ブロマーら12* | 女性 | ティッカー | 11%-27% | ティッカー | ティッカー |
| ヴェッガーら13* | 女性 | ティッカー | 16%-32% | ティッカー | ティッカー |
| ロードベリ14* | 女性 | ティッカー | 11%-45% | ティッカー | ティッカー |
| NR: 報告なし | |||||
| *:公表された数値から外注したデータ | |||||
表1:マウス大腿骨頸部の曲げ特性の測定のための変動係数。 変動係数は、データセットの標準偏差と平均の比を表します。COVが減少するにつれて、これは平均の周りの個々のデータポイントのより緊密なグループ化を示します。このプロトコルは、同様のテストを実行する他のパブリケーションと比較して、最大負荷のCOVを削減しました。
予想通り、測定された機械的特性に性差が認められた。統計解析は、片側非対応t検定を用いて実施した。雄マウスの大腿骨頸部は、雌マウスの標本よりも有意に強く、硬直していた(それぞれp = 0.009およびp = 0.0006)。さらに、雌の大腿骨頸部は、雄マウスの標本と比較して、より有意な変形(p = 0.014)を経験し、障害(p = 0.024)に働いた(p = 0.024)。これは、女性の骨塩密度が低いことと一致し、生理学的に関連する違いを検出するためのテストの感度を強調しています。この研究で用いた雄マウスおよび雌マウスコホートでは、二重エネルギーX線吸収光度法スキャン(DEXA)および片側不対t検定(p = 0.036)によって決定されたように、雌マウスの骨塩密度は雄マウスのそれよりも有意に低かった。
図7:生体力学的結果。 (A)0.2%のオフセット線形適合を示す代表的な力-変位曲線を使用して、剛性と降伏点を導出します。選択した結果メジャーは散布図で、(B) 最大荷重 (破損時)、(C) 剛性、(D) 最大変位 (破損時)、および (E) 破損までの作業 (破損点までの曲線下面積) を含む平均と標準偏差が表示されます。アスタリスクは、片側非対応t検定を用いて決定された有意差を示す(*p <0.05、**p <0.01、***p <0.001、性別コホート当たりn=10)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ポッティング角度のわずかな変動が実験的変動に寄与しないことを確認するために、各生体力学的結果尺度をポッティング角度に対してプロットし、男性コホート、女性コホート、およびグループ化されたすべてのサンプルについて単純な線形回帰を実施した(図8)。次に、線形回帰の傾きがゼロではないという仮説を検定しました。回帰分析は、剛性を除いて、ポッティング角度のわずかな変化(18°〜24°の範囲)が生体力学的転帰測定に影響しないことを実証した。剛性については、ポッティング角度と有意な線形相関があった(R2 = 0.29、 p <0.05)。
図8:生体力学的結果に対するポッティング角度の影響。 (A)最大荷重、(B)剛性、(C)最大変位、および(D)故障までの作業を含む生体力学的アウトカム測定値をポッティング角度に対してプロットし、男性コホート、女性コホート、およびグループ化されたすべてのサンプルについて単純線形回帰を使用して相関させた。黒い実線はグループ化されたサンプルの線形回帰を示し、点線は信頼区間を示します。ポッティング角度の変動は、最大荷重、最大変位、または破損作業に大きく影響しませんでした。ただし、ポッティング角度が大きくなるにつれて、ピアソン検定(p = 0.0126、n = 20)によって決定されるように、剛性が増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: 標準三角形言語 (.STL) ガイドのファイル。このファイルは、プロトコルに記述されているガイドを印刷するために使用できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、マウス大腿骨頸部に対する信頼性の高い片持ち梁曲げ試験の概要を示しています。大腿骨頸部で起こる自然な片持ち梁屈曲シナリオは、通常、標準的な3点および4点曲げ試験では表されません5。この試験方法は、骨脆弱性患者が経験する大腿骨頚部骨折のタイプをより良くかつより確実に複製する。このプロトコルを実行する際の主な焦点は、大腿骨シャフトの不整合なポッティングによる変動性を排除することである。重要なことに、プロトコルの第 1 セクションと第 4 セクションで概説されている手順に厳密に従うことで、ガイドの作成と読み込みプロトコルによって、このドキュメントで報告されている内容が確実に再現されます。理論的に予測され、実験的に示されるように、荷重軸に対する中間軸角度は、大腿骨頸部が経験する応力および骨折が大腿骨頚部で起こる確率に影響を与える可能性がある。以前のグループは、中軸角度が大腿骨頭部を通して装填されたときの大腿骨の圧縮剛性と強度に大きく影響することを実証している。中軸傾斜角の影響をパラメトリック解析したところ、大腿骨軸の最大曲げモーメントは、15°~25°の中間軸角度で最小になり、シャフト剛性も最大化されることが示されました5。したがって、この角度は、シャフトの圧縮骨折の可能性を最小限に抑え、大腿骨頸部の曲げ骨折の可能性を高める。
いくつかのパラメータは、あらゆる生体力学的試験の結果に影響を与え、生理学的に関連する実験変数による有意差を検出する能力を混乱させる可能性がある。この変動性は、長いマウスの骨のサイズが小さいことによって悪化します。この試験で注意が必要なパラメータの中には、特に、凍結融解サイクル数および骨の水和状態、負荷速度、および負荷軸に対する大腿骨軸の位置合わせが含まれる。このプロトコルは、すべてのサンプルが同じ数の凍結融解サイクルと、室温でPBS中で水和するための2時間のウィンドウを通過することを規定しています。荷重速度も0.5mm/s3,4の均一な値に設定されます。さらに、3Dプリントされたガイドは、ポッティングステップ中に約20°の中間軸角度で大腿骨を一貫して配置するように設計されています。これにより、18°〜24°の範囲の一貫したミッドシャフト角度が得られ、解剖学的差異による有意な性影響はなく、雄マウスと雌マウスの変動係数はそれぞれ7.6%および6.5%であった。これらのガイドはアクセス可能で、標準のソリッドモデリングソフトウェアを使用して簡単に変更でき、安価なデスクトップ3Dプリンタを使用してオンデマンドで再現できます。
代表的な結果は、試験プロトコルが性別などの微妙な生理学的差に敏感であり、n = 10の合理的なサンプルサイズであることを実証した。n = 10 で実験的に決定されたサイズ効果(δ = Δmean/SD)を考慮した遡及的検出力分析では、破損時の最大荷重(δ = 0.8)で 57%、剛性 (> = 1.77) で δ 95%、破損する作業 (δ = 1.77) でそれぞれ 83% と推定されました(δ = 1.77)。この検出力分析では、小さな変動係数(表1)に加えて、ポッティング角度の変動がプロトコルの感度と信頼性に悪影響を及ぼしたことを確認しています。
失敗様式の主観的分析はまた、試験されたサンプルの100%が二股頸部で失敗したことを実証し、それらのすべてが二股骨折を示し、1つの骨折線が首に接する部位でシャフトに平行に走り、分岐部の頂点で大腿骨頸部に垂直な別の骨折線を有する。これは、大腿骨頚部骨折の2つの臨床的に関連するモードの特徴を包含する。転子間および経頸部頸部骨折15。大腿骨頸部片持ち梁曲げ試験は、骨粗鬆症のげっ歯類モデルにおける大腿骨および脛骨中軸の標準的なねじりまたは屈曲試験ほど一般的に使用されておらず、文献に記載されている。マウスおよびラットモデルを用いてそのようなプロトコールを記述するために同定された研究はほんの一握りであった5,7,8,9,16,17。試験中に大腿骨が位置付けられた角度は、常に報告されるわけではない。詳細な説明があるものの中には、サンプルを整列させるために大量のカスタムフィクスチャとソフトウェアを使用しているものもあります5が、それでも手作業によるポッティングに頼っているため、他のプロトコルでも同じ人為的エラーが発生します。
このプロトコルはマウスサンプル用に設計されており、C57Bl/6マウス用に規定されていますが、大型動物モデルや大腿骨形状が異なる他のマウス系統に容易に適合させることができます。このプロトコルを使用する将来の研究者は、第3転子体が大腿骨頭から正確に7mm離れているわけではない可能性があるため、露出した骨の量を変更する必要があるかもしれません。プロトコルに対するさらなる修正には、さらなる試験が望まれる場合に試料を放出するために試験後に軟化することができる硬化剤を使用することが含まれる。これは、サンプル7を放出する試験後に温水浴中で溶融することができるビスマス合金で行うことができる。ユーザーがこのプロトコルに加えることができる最終的な変更は、ロードセルのタイプと位置であるステップ3.1で回避されます。軸方向ロードセルは、1 N以下の分解能で使用する必要があります。50 Nロードセルは、観測された最大荷重に基づいて適切です。さらに、張力または圧縮のみを測定するロードセルを使用して、ロードセルがロードセルに対して偏心荷重から経験する可能性のある複合曲げモーメントを回避する必要があります。複合力測定を回避するもう1つの方法は、ロードセルをアクチュエータに固定して、荷重がロードセルと一致していることを確認することです。
このプロトコルは、カスタムフィクスチャの必要性を簡素化し、市販の3Dプリンタでガイドを印刷する方法を説明し、現在の研究で報告された変動係数が低いことから明らかなように、一般的な実験装置を利用してサンプルを完全かつ再現性よくテストします(表1)。ただし、このプロトコルは、3Dプリンタの必要性によって制限されません。市販のソリューションが存在し、3Dレンダリングファイルを印刷会社に送信し、部品を返送することができます。さらに、大腿骨頸部へのこの曲げ荷重のモードは、臨床的に遭遇する骨折の位置およびタイプをシミュレートする。脆弱性骨折のリスクが高い人の数で、205018年までに毎年2,130万人以上の股関節骨折があると予測されています。これがもたらす莫大な社会的、財政的、および医学的負担、げっ歯類モデルでの信頼性の高い検査は、骨粗鬆症の病因の理解に向けた研究の厳密さと再現性を向上させ、効果的に治療することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、NIH P30AR069655およびR01AR070613(H. A. A.)によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
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