Summary
Den nåværende protokollen beskriver utviklingen av en reproduserbar testplattform for murine lårhalser i et cantilever bøyeoppsett. Tilpassede 3D-trykte guider ble brukt til å konsekvent og stivt fikse lårbenene i optimal justering.
Abstract
Brudd i lårhalsen er en vanlig forekomst hos personer med osteoporose. Mange musemodeller er utviklet for å vurdere sykdomstilstander og terapier, med biomekanisk testing som et primært resultatmål. Imidlertid fokuserer tradisjonell biomekanisk testing på torsjons- eller bøyetester som brukes på midtakselen av de lange beinene. Dette er vanligvis ikke stedet for høyrisikofrakturer hos osteoporotiske individer. Derfor ble det utviklet en biomekanisk testprotokoll som tester lårhalsene til murine lårben i cantilever bøyebelastning for å gjenskape bedre typer brudd som oppleves av osteoporosepasienter. Siden de biomekaniske resultatene er svært avhengige av den fleksible lasteretningen i forhold til lårhalsen, ble 3D-trykte guider opprettet for å opprettholde en låraksel i en vinkel på 20° i forhold til lasteretningen. Den nye protokollen strømlinjeformet testingen ved å redusere variasjonen i justering (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) og forbedret reproduserbarhet i de målte biomekaniske resultatene (gjennomsnittlig COV = 26,7%). Den nye tilnærmingen ved hjelp av 3D-trykte guider for pålitelig prøvejustering forbedrer strenghet og reproduserbarhet ved å redusere målefeilene på grunn av prøvefeiljustering, noe som bør minimere prøvestørrelser i musestudier av osteoporose.
Introduction
Bruddrisiko er en alvorlig medisinsk bekymring forbundet med osteoporose. Over 1,5 millioner skjørhetsfrakturer rapporteres hvert år bare i USA, med brudd i hoften, spesielt lårhalsen, som den ledende bruddtypen1. Det er anslått at 18% av kvinnene og 6% av mennene vil oppleve et lårhalsbrudd i løpet av livet2, og dødeligheten ved 1 år etter bruddet er større enn 20%1. Derfor kan musemodeller som tillater biomekanisk testing av lårhalsen være egnet for å studere skjørhetsfrakturer. Musemodeller tilbyr også kraftige verktøy for å belyse overførbare cellulære og molekylære hendelser involvert i osteoporose potensielt. Dette skyldes tilgjengeligheten av genetiske reportere, gevinst og tap av funksjonsmodeller, og det ekspansive biblioteket med molekylære teknikker og reagenser. Mekanisk testing av museben kan gi nødvendige utfallstiltak for å bestemme beinhelse, genotypiske og fenotypiske variasjoner som kan forklare sykdommens etiologi, og vurdere terapier basert på utfallsmål for beinets kvalitet og risikoen for brudd3.
Anatomien til lårhalsen skaper unike mekaniske lastescenarier, noe som vanligvis fører til fleksurale (bøyende) brudd. Lårhodet er lastet i acetabulær stikkontakt i den proksimale enden av lårbenet. Dette skaper et cantilever bøyescenario på lårhalsen, som er stivt festet til lårakselen distally4. Dette skiller seg fra tradisjonelle 3- eller 4-punkts bøyetester på lårbenet midtdiafyse. Selv om disse testene er nyttige, replikerer de ikke lasten som vanligvis fører til skjørhetsfrakturer hos osteopeniske og osteoporotiske individer når det gjelder bruddplassering eller lastescenario.
For bedre å vurdere skjørhetsbruddrisiko hos mus, ble det forsøkt å forbedre reproduserbarheten av cantilever bøyetester av murine lårhalser. Som teoretisk anslått har lastevinkelen på lårhodet i forhold til lårakselen vist seg å påvirke utfallstiltakene5 betydelig, og dermed skape en utfordring for pålitelighet og reproduserbarhet av rapporterte resultater. For å sikre riktig og konsistent justering av lårbenene under prøvepreparering, ble guider designet, og 3D trykt basert på anatomiske målinger gjort på μCT-skanninger av C57BL / 6 muse lårben. Føringene ble designet for å hjelpe til med å konsekvent potte prøvene slik at lårakselen opprettholdes ved ~ 20 ° fra den vertikale lasteretningen. Denne vinkelen ble valgt fordi den maksimerer stivheten samtidig som den minimerer det maksimale bøyemomentet langs lårakselen, noe som øker sannsynligheten for lårhalsbrudd og fører til mer konsistent og reproduserbar testing5. Guider ble 3D trykt i forskjellige størrelser for å imøtekomme anatomiske forskjeller mellom prøver og brukes til å holde prøver i en stabil posisjon mens potting i akrylbensement. Stivheten, maksimal kraft, utbyttekraft og maksimal energi ble beregnet ut fra kraftforskyvningsgrafene. Denne testmetoden viste konsistente resultater for det nevnte biomekaniske utfallet. Med øvelse og hjelp av den 3D-trykte guiden kan målefeil på grunn av feiljustering minimeres, noe som resulterer i pålitelige utfallstiltak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble godkjent av University of Rochester Committee of Animal Resources. Musene som ble brukt i denne studien var C57BL/6 menn og kvinner fra 24-29 uker. Mus ble plassert i standardforhold med mat og vann ad libitum. Ved eutanasi via karbondioksidinnånding, etterfulgt av cervical dislokasjon, ble 20 høyre lårben (10 hann og 10 kvinner) høstet og frosset ved -20 °C til de ble testet.
1. Opprettelse av tilpassede 3D-trykte monteringsveiledninger
MERK: Dette trinnet kan være nødvendig fordi forskjellige stammer og genetiske fenotyper kan ha forskjellige anatomiske geometrier.
- Få μCT-skanninger av de representative prøvene.
- Skann representative prøver på en μCT-skanner med følgende innstillinger: 55 kV, 145 μA for 300 ms integrasjonstider og oppløsning på 10,5 μm voxels.
- Sørg for at den fangede regionen dekker den proksimale enden av lårbenet og fortsetter ned gjennom midtakselen.
MERK: Hvis en μCT-skanner ikke er tilgjengelig, kan 2D-planare røntgenbilder av de representative prøvene brukes.
- Analyser μCT-skanningene.
- Bruk det representative settet med μCT-skanninger, få en 2D-gjengivelse av den fremre visningen av den proksimale lårbenet.
- Få μCT-bilder med en oppløsning på 10,5 μm voxels fra midtakselen til den proksimale enden av lårbenet. Kompiler disse stykkene ved hjelp av programvare (se Tabell over materialer) i en 3D-gjengivelse av eksemplet.
- Bestem en terskel for å skille bein fra det omkringliggende vevet og påfør et gaussisk filter for støyreduksjon.
- Plasser 3D-gjengivelsene for å eliminere vippe utenfor aksen og sikre at lårbenets fremre overflate vises.
- Eksporter denne 2D-visningen av 3D-gjengivelsen som en bildefil, for eksempel .jpg eller .png.
- Bruk en bildeanalyseprogramvare (se Materialliste) til å måle femoral akselvinkelen ved å tegne en linje vinkelrett på lårakselen 7 mm distalt og en annen linje gjennom toppen av den større trochanteren til midtpunktet på den nevnte vinkelrette linjen (figur 1).
- Langs den 7 mm distale vinkelrette linjen måler du lårakseldiameteren under den tredje trochanteren.
- Bruk det representative settet med μCT-skanninger, få en 2D-gjengivelse av den fremre visningen av den proksimale lårbenet.
Figur 1: μCT-analyse. μCT-bilder av lårben av C57Bl/6-mus brukes til å beregne gjennomsnittlig akselvinkel, målt fra toppen av den større trochanteren gjennom midten av midtakselen, ~ 7 mm distalt. Midtakseldiameteren ble også målt i denne posisjonen. 3D-gjengivelsene av den proksimale lårbenet var orientert i en fremre visning for å vise profilen til den tredje trochanteren. Gjennomsnittlig akselvinkel var 93,13° (SD = 1,19°), og gjennomsnittlig midtakseldiameter var 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Skalastang = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Lag monteringsveiledningene ved hjelp av et 3D-modelleringsprogram (se Tabell over materialer) (Figur 2, Tilleggsfil 1).
MERK: Styrene er rektangulære cuboider som måler 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm med et vinklet spor, litt større enn den gjennomsnittlige akseldiameteren som er bestemt i trinn 1.1.2. Vinkelen på sporet vil skape en konsistent vinkel på 20° fra vertikal. Styrene skal være konsistente i lengde, høyde og bredde, men kan gjøres med forskjellige spordiametre for å imøtekomme anatomiske forskjeller mellom beinprøvene.
Figur 2: Utforme støttelinjene. (A) 3D-skisse og (B) visualisering av midtakselfiskearmatur før 3D-utskrift. Basert på tidligere litteratur maksimerer en midtakselvinkel mellom 20° stivheten. Det minimerer det maksimale bøyemomentet i lårakselen for å sikre at brudd oppstår i nakken og variasjon i mekaniske utfall5. For å kompensere for 3,13° avviket fra vinkelrett i midtakselens gjennomsnittsvinkler, ble armaturvinkelen satt til 73,13° for å produsere en vinkel på 20°. Justeringsarmaturer ble trykt med diametre fra 1,9-2,2 mm for å sikre en riktig passform for varierende midtakseldiametre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Skriv ut støttelinjene ved hjelp av en 3D-skriver. Veiledningene kan forbli på under testprosessen, så utskrift av flere replikeringer av guidene kan være gunstig for å forberede flere prøver samtidig.
2. Prøvepreparering
- Høst muse lårbenene ved å lage et tverrgående snitt helt rundt musens underliv og fjerne vevet fra snittet til anklene. Etter dette, finn hoftekontakten og bruk forsiktig spissen av et par fine tang for å dislokere hoften. Klipp det ekstra bløtvevet for å fjerne benet fra musen.
- Når benet er høstet, bruk en skalpell for å dislokere og kutte gjennom kneleddet. Rengjør lårbenene i alt bløtvev manuelt ved hjelp av tang, skalpeller og papirhåndklær.
- Test de høstede prøvene umiddelbart eller oppbevar dem ved -20 °C i opptil 6 måneder. Hvis prøvene er frosset, la dem komme til romtemperatur og hydrere i PBS i 2 timer før du forbereder dem.
- Bruk 1/4" x 1/4" firkantede aluminiumsrør (se Materialbord), kutt slangedelene 1/2" til 1" i lengde. Bruk et etseverktøy til å merke hvert aluminiumssegment med prøve-IDene.
- Fyll halvparten av rørsegmentene med kitt. Plasser disse slangesegmentene i en armatur for å holde dem oppreist.
- Plasser de rensede lårbenene i de 3D-trykte støttelinjene. For å gjøre dette, plasser prøvene flatt på benken slik at den fremre overflaten vender opp. Plasser føringen rett under den tredje trochanteren, der akseldiameteren blir mer konsistent.
MERK: Dette vil etterlate ~7mm av den proksimale lårbenet over guiden. - For å hindre at lårbenet roterer til side- eller medialsiden mens du plasserer på føringen, hold de proksimale og distale endene med den ene hånden når du påfører styrene, trykk femuren fast på arbeidsbenken og bruk den andre hånden, plasser den 3D-trykte føringen på midtakselen på lårbenet. Sørg for å påføre den riktige diameterføreren forsiktig, da midtakselen på lårbenet kan klikke hvis den tvinges inn i en guide for liten.
- Når guidene er på lårbenene, plasser dem foran de tilsvarende aluminiumssegmentene. Bruk beinsement eller andre herdingsmidler, fyll aluminiumssegmentene til de bare er fulle, og gi litt rom for forskyvning.
- Plasser lårbenene med guider på i riktig aluminiumssegment.
MERK: Styrene vil ikke være sentrert på aluminiumssegmentene, sittende litt på den ene siden slik at den distale enden av lårbenet kan sitte i midten av aluminiumskannen. - La herdingsmiddelet stilles inn. Når prøvene er stilt inn, plasseres de i en Petri-tallerken med fosfatbufret saltvannssalve (PBS) for romtemperatur og tillater rehydrering i 2 timer (figur 3).
Figur 3: Prøvepreparering ved hjelp av tilpassede stikk og sportsfiskearmaturer. (A) Prøver i aluminiumspotter med riktig justering opprettholdes ved hjelp av 3D-trykte guider mens beinsementen tørker. (B) Røntgen før testing viser skyggen av sportsfiskearmaturer og fullstendig dekning av beinsement rundt den distale enden av lårbenet. Det mettede hvite området på bunnen av aluminiumspottene er kitt, som brukes til å holde beinsement i potter ved herding. Skalastang (panel B) = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Maskinvareoppsett
- Bruk et mekanisk testsystem (MTS), fest og kalibrer en veiecelle med oppløsning <1 N (se Materialfortegnelse) (figur 4A).
MERK: Veiecellen kan monteres på scenen eller helst aktuatoren når det er mulig. - Fest en armatur med et firkantet spor som holder aluminiumssegmentene godt med prøvene. Fest settskruene til de to sidene av holdearmaturen for å holde prøvene godt på plass. (Figur 4B).
MERK: Denne armaturen kan trykkes eller bearbeides i 3D og deretter tappes med gjengede skruehull for å montere på testrammen. - Fest en lasteplaten til aktuatoren. Dette kan ganske enkelt være en konisk skrue med en flatt spiss (figur 4C).
- Plasser et stereomikroskop på et bord eller en overflate rett foran MTS. Hvis det er behov for ekstra belysning for å se oppsettet gjennom mikroskopet, plasserer du disse rundt systemet.
Figur 4: Maskinvareoppsett. (A) Oppsett av testing på mekanisk testsystem, med 1 kN lastcelle (oppløsning < 1 N) og svart biaxial stadium for å sikre riktig prøveposisjonering. (B) Nærbilde av den 3D-trykte monteringsarmaturen festet til lastcellen med en M10 gjenget stang og to M4-bolter som brukes til å holde aluminiumskannen på plass. (C) Visning av prøven gjennom et stereomikroskop med konisk lastearmatur. Skalastang (panel C) = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Oppsett av programvare
- I MTS-programvaren begynner du opprettelsen av en ny flexural (bøyende) protokoll. Kontroller at protokollen fungerer i forskyvningskontroll.
- Sett innlastingshastigheten for protokollen til 0,5 mm/s.
- Hvis programvaren har en innstilling for myke taster, legger du til tastene "Balanse" og "Zero Extension" i protokollen.
MERK: Dette vil raskt sette belastnings- og aktuatorposisjonen til 0 før du tester hver prøve. - Forsikre deg om at programvaren vil registrere tiden i sekunder, laste inn i Newtons og utvidelse eller forskyvning i millimeter med en minimum samplingsfrekvens på 100 Hz.
- Lagre den nye protokollen og gå tilbake til hovedskjermen i programmet for å begynne å teste et nytt eksempelsett.
5. Testing av oppsett
- Før du monterer prøvene på MTS, må du få et røntgenbilde av prøvene i aluminiumspottene. Flere prøver kan avbildes samtidig. Sørg for at den fremre visningen av prøver er tatt for å muliggjøre verifikasjonsmålinger av pottevinkel (figur 5).
Figur 5. Vurdering av prøvejustering. (A) Akselvinkelen fra vertikal måles fra plane digitale røntgenstråler. (B) Representative potteformede femorale akselvinkler varierte fra 18,11° til 23,99°, med en variasjonskoeffisient (COV) på 7,1% (n = 20). Kjønnsforskjeller på grunn av anatomiske variasjoner var ikke statistisk signifikante, som bestemt ved hjelp av en ensidig uparret t-test (p < 0,05). Skalastang (panel A) = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Plasser aluminiumssegmentet med prøve inn i holdearmaturen og stram settskruene.
- Senk aktuatoren/lasteplaten til den er innenfor noen få millimeter av lårhodet.
MERK: Ikke forhåndslast prøven med noen kraft og vær forsiktig så du ikke senker aktuatoren for raskt, da det er veldig enkelt å skade prøver. - Bruk stereomikroskopet til å justere biaksialtrinnet for å justere posisjonen til lårhodet rett under lasteplaten. Lås biaxialstadiet på plass.
- I MTS-programvaren nullstiller du aktuatorens posisjon og balanserer veiecellen ved hjelp av de myke tastene som er lagt til i trinn 4.3.
- Start innlastingsprotokollen. Avhengig av hvor mye plass som var igjen mellom lasteplaten og prøven, vil testing bare ta 10-30 s.
- Etter testing, ta en annen fremre røntgen av prøven. Dette vil bli brukt til å skjelne og dokumentere bruddmodusen (figur 6).
Figur 6: Røntgenbilde av prøver etter testing. Alle prøver oppsprukket i en bifurcated linje gjennom lårhalsen og langs lårhalsakselfestet (uthevet av den oransje sirkelen). Skalastang = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Dataanalyse
- Etter datainnsamling, eksportkraft og forskyvningsdata til programvare (se Materialfortegnelse) som muliggjør grafer og matematiske beregninger.
- Plott lasten i forhold til forskyvning for hver prøve (figur 7A). Tilpass en lineær tilnærming til det lineære segmentet i lastforskyvningskurven. Hellingen av denne lineære passformen vil definere stivheten, et mål på elastisiteten til prøven.
- Beregn tilleggsresultatene som maksimal belastning, maksimal forskyvning, utbyttebelastning, forskyvning ved avkastningspunkt, energi til maksimal belastning og energi til avkastningspunkt.
MERK: Avkastningspunktet kan bestemmes ved å sette den lineære tilnærmingen som er bestemt i trinn 6.2 av 0,2%6. Punktet der den koblede linjen og lasten i forhold til forskyvningskurven krysser vil bestemme avkastningspunktet. Når det gjelder svært sprø prøver som viser lite utbytte, kan utbyttepunktet være det samme som det maksimale punktet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved potte ved hjelp av føringen ble lårakslene justert ved 21,6° ± 1,5°. Selv om dette representerer <10 % avvik fra den tiltenkte vinkelen på 20 °, var variasjonskoeffisientene (COV) til pottevinkelen på tvers av alle prøvene som ble testet henholdsvis 7,6 % og 6,5 % for mannlige og kvinnelige mus (n = 10 per gruppe) som verifisert av pre-test plane røntgenstråler (figur 5). I tillegg bør røntgenbildene etter testing brukes til å vurdere modusen der prøvene mislyktes. Svikt ble konsekvent observert i lårhalsene, som beregnet, på en bifurcated måte, med en bruddlinje parallelt med lårakselen og den andre linjen vinkelrett på lårhalsen (figur 6). Hvis betydelige variasjoner skulle forekomme i bruddmønsteret blant prøver, kunne beinkvaliteten på prøver vurderes videre via μCT ved å måle resultater som volumetrisk benmineraltetthet, trabekulær og kortikale tykkelser, avstand og mineralisering. Hvis svikt ikke er konsekvent indusert i lårhalsen, kan de 3D-trykte styrene justeres.
De biomekaniske utfallstiltakene som rapporteres her, er i samsvar med verdier rapportert i lignende aksial bøyning av lårhalskonfigurasjoner7,8,9,10,11,12,13,14. Den konsekvente justeringen som oppnås ved hjelp av de 3D-trykte veiledningene, forbedret imidlertid vanligvis COV-en for maksimal belastning spesielt (tabell 1).
| Nåværende studie | Sex | Midtaksel vinkel | Maksimal belastning | Stivhet | Arbeid til feil |
| Mannlig | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Kvinnelig | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Mannlig | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | Mannlig | NR | 19% | NR | NR |
| Kamal et al9 | Kvinnelig | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| Middleton et al7 | Kvinnelig | NR | 24%-27% | NR | NR |
| Brent et al11 | Kvinne - rotter | NR | 18%-24% | NR | NR |
| Bromer et al12* | Kvinnelig | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | Kvinnelig | NR | 16%-32% | NR | NR |
| Lodberg14* | Kvinnelig | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: Ikke rapportert | |||||
| *: Data ekstrapolert fra publiserte tall | |||||
Tabell 1: Variasjonskoeffisienter for målte fleksurale egenskaper til musens lårhalser. Variasjonskoeffisientene representerer forholdet mellom standardavviket og gjennomsnittet for et datasett. Etter hvert som COV reduseres, indikerer dette en strammere gruppering av de enkelte datapunktene rundt gjennomsnittet. Denne protokollen reduserte COV for maksimal belastning sammenlignet med andre publikasjoner som utførte lignende testing.
Som forventet ble det observert kjønnsforskjeller i de målte mekaniske egenskapene. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en ensidig uparret t-test. Lårhalser fra hannmus var betydelig sterkere og stivere enn prøver fra kvinnelige mus (p = 0,009 og p = henholdsvis 0,0006). I tillegg opplevde de kvinnelige lårhalsene mer signifikante deformasjoner (p = 0,014) og arbeidet med å mislykkes (p = 0,024) sammenlignet med prøver fra hannmus (figur 7). Dette er i samsvar med den nedre benmineraltettheten hos kvinner og understreker følsomheten til testen for å oppdage fysiologisk relevante forskjeller. I de mannlige og kvinnelige musenes kohorter som ble brukt i denne studien, var de kvinnelige musene benmineraltetthet betydelig lavere enn sine mannlige kolleger, som bestemt av en dual-energy røntgenaborptiometriskanning (DEXA) og en ensidig uparret t-test (p = 0,036).
Figur 7: Biomekaniske resultater. (A) En representativ kraftforskyvningskurve, som viser en 0,2% offset lineær passform, brukes til å utlede stivheten og utbyttepunktet. Utvalgte utfallsmål er spredt som viser gjennomsnitts- og standardavvik, inkludert (B) maksimal belastning (ved feil), (C) stivhet, (D) maksimal forskyvning (ved feil), og (E) arbeid for å mislykkes (område under kurven opp til feilpunktet). Stjerner indikerer signifikante forskjeller bestemt ved hjelp av en ensidig uparret t-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 per kjønnskohort). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å bekrefte at de små variasjonene i pottevinkelen ikke bidro til eksperimentell variasjon, ble hvert biomekaniske utfallsmål plottet mot pottevinkelen og utført en enkel lineær regresjon for den mannlige kohorten, den kvinnelige kohorten og alle prøvene gruppert sammen (figur 8). Hypotesen ble deretter testet at den lineære regresjonshellingen ikke er null. Regresjonsanalysen viste at bortsett fra stivheten, påvirket de små variasjonene i pottevinkelen (område 18° til 24°) ikke de biomekaniske utfallstiltakene. For stivhet var det en signifikant lineær korrelasjon med pottevinkelen (R2 = 0,29, p < 0,05).
Figur 8: Effekt av pottevinkelen på biomekaniske utfall. Biomekaniske utfallstiltak, inkludert (A) maksimal belastning, (B) stivhet, (C) maksimal forskyvning, og (D) arbeid med å mislykkes ble plottet mot pottevinkelen og korrelert ved hjelp av en enkel lineær regresjon for den mannlige kohorten, den kvinnelige kohorten og alle prøver gruppert sammen. Heldekkende svarte linjer viser lineær regresjon av grupperte prøver, med prikkede linjer som angir konfidensintervaller. Variasjon i pottevinkelen påvirket ikke maksimal belastning, maksimal forskyvning eller feilarbeid betydelig. Men etter hvert som pottevinkelen økte, økte stivheten, som bestemt av en Pearsons test (p = 0,0126, n = 20). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Standard trekantspråk (. STL)-filen til veiledningene. Denne filen kan brukes til å skrive ut støttelinjene som er beskrevet i protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen skisserer en pålitelig cantilever bøyningstest for murine lårhalser. Det naturlige cantilever flexure-scenariet som oppstår ved lårhalsen er vanligvis ikke representert i standard 3- og 4-punkts bøyetester5. Denne testmetoden er bedre og mer pålitelig replikerer typen lårhalsbrudd som oppleves av beinskjørhetspasienter. Hovedfokuset når du utfører denne protokollen er å eliminere variasjonen på grunn av inkonsekvent potting av lårakselen. Kritisk, følg trinnene som er beskrevet i første og fjerde del av protokollen, for å sikre at opprettelsen av veiledningene og innlastingsprotokollen vil replikere det som rapporteres i denne publikasjonen. Som det teoretisk kan forutsies og vises eksperimentelt, kan midtakselvinkelen i forhold til lasteaksen påvirke belastningene som oppleves av lårhalsen og sannsynligheten for at bruddet oppstår ved lårhalsen. Tidligere grupper har vist at midtakselvinkelen i betydelig grad påvirker lårbenets kompressive stivhet og styrke når den lastes gjennom lårhodet. Parametrisk analyse av effektene av midtakselhellingsvinkler viste at de maksimale bøyemomentene i lårakslene opplever et minimum i midtakselvinkler mellom 15° og 25°, noe som også maksimerer akselstivheten5. Denne vinkelen minimerer derfor sannsynligheten for kompresjonsbrudd i akselen og øker sannsynligheten for fleksurale brudd i lårhalsen.
Flere parametere kan påvirke resultatene av enhver biomekanisk test og forvirre evnen til å oppdage betydelige forskjeller på grunn av fysiologisk relevante eksperimentelle variabler. Denne variasjonen er sammensatt av den lille størrelsen på lange museben. Blant parametrene som krever oppmerksomhet i denne testen, spesielt, er antall fryse-tine sykluser og hydrering tilstand av beinet, lastehastigheten, og justering av lårbenet aksel i forhold til aksen for lasting. Protokollen fastslår at alle prøver går gjennom samme antall fryse-tine sykluser og et 2 h vindu for hydrering i PBS ved romtemperatur. Lastehastigheten er også satt til en jevn verdi på 0,5 mm/s3,4. Videre ble 3D-trykte guider designet for å konsekvent plassere lårbenet i en midtakselvinkel på ~ 20 ° under pottetrinnet. Dette resulterte i konsistente midtakselvinkler i området 18° til 24°, uten signifikante kjønnseffekter på grunn av anatomiske forskjeller og koeffisienter av variasjon på henholdsvis 7,6% og 6,5% for mannlige og kvinnelige mus. Disse veiledningene er tilgjengelige, enkelt modifisert ved hjelp av standard solid modelleringsprogramvare og reprodusert på forespørsel ved hjelp av en rimelig stasjonær 3D-skriver.
De representative resultatene viste at testprotokollen er følsom for subtile fysiologiske forskjeller, for eksempel kjønn, med en rimelig utvalgsstørrelse på n = 10. En retrospektiv kraftanalyse som tar høyde for eksperimentelt bestemte størrelseseffekter (δ = Δmean/SD) ved n = 10, antydet at effekten ble anslått til å være 57 % for maksimal belastning ved svikt (δ = 0,8), >95% for stivheten (δ = 1,77) og maksimal forskyvning (δ = 1,9) og 83% for arbeidet å mislykkes (δ = 1,77). Sammen med de små variasjonskoeffisientene (tabell 1) bekrefter denne kraftanalysen at variasjonen i pottevinkelen påvirket følsomheten og påliteligheten til protokollen negativt.
Den subjektive analysen av feilmodusen viste også at 100% av prøvene som ble testet mislyktes i lårhalsen, da alle viste en bifurcated brudd, med en bruddlinje som går parallelt med akselen på stedet den møter nakken og en annen bruddlinje vinkelrett på lårhalsen ved bifurkasjonens apex. Dette omfatter funksjoner fra to klinisk relevante moduser for lårhalsbrudd; de intertrokanittiske og transcervical nakkefrakturene15. Femoral nakke cantilever bøyningstester er ikke så vanlig brukt og beskrevet i litteraturen som standard torsjon eller flexure testing av lår- og tibiale midtshafts i gnagermodeller av osteoporose. Bare en håndfull studier ble identifisert for å beskrive slike protokoller ved hjelp av mus- og rottemodeller5,7,8,9,16,17. Vinkelen der lårbenene ble plassert under testing, rapporteres ikke alltid. Noen med detaljerte beskrivelser bruker en overdreven mengde tilpassede inventar og programvare for å justere prøvene sine5, men tyr fortsatt til potting for hånd, og introduserer den samme menneskelige feilen i andre protokoller.
Denne protokollen er designet for murine prøver og er spesifisert for C57Bl / 6 mus, men kan lett tilpasses store dyremodeller eller andre murine stammer med forskjellig lårbensgeometri. Fremtidige etterforskere som bruker denne protokollen, må kanskje endre mengden eksponert bein, da den tredje trochanteren kanskje ikke er nøyaktig 7 mm distalt fra lårhodet. Ytterligere endringer i protokollen inkluderer bruk av et herdemiddel som kan mykes opp etter testing for å frigjøre prøven hvis ytterligere testing ønskes. Dette kan gjøres med en vismutlegering som kan smeltes i et varmtvannsbad etter testing for å frigjøre prøven7. Den endelige endringen brukere kan gjøre i denne protokollen, unngås i trinn 3.1, og er typen og plasseringen av lastcellen. En aksial lastcelle bør brukes med sub 1 N oppløsning. En 50 N lastcelle vil være hensiktsmessig basert på de maksimale belastningene som er observert. Videre bør en veiecelle som bare måler spenning eller kompresjon brukes til å unngå et sammensatt bøyemoment som veiecellen kan oppleve fra eksentrisk lasting i forhold til lastcellen. En annen måte å unngå sammensatte kraftmålinger ville være å fikse lastcellen til aktuatoren for å sikre at lastekraften er i tråd med lastcellen.
Denne protokollen forenkler behovet for tilpassede armaturer, beskriver hvordan guider kan skrives ut på en hvilken som helst kommersielt tilgjengelig 3D-skriver, og benytter vanlig laboratorieutstyr til grundige og reproduseringstestprøver, som vist av de lavere variasjonskoeffisientene som er rapportert i den aktuelle studien (tabell 1). Denne protokollen er imidlertid ikke begrenset av behovet for en 3D-skriver. Det finnes kommersielt tilgjengelige løsninger, der 3D-gjengivelsesfilene kan sendes til trykkerier, og delene kan sendes tilbake. I tillegg simulerer denne modusen for bøying på lårhalsen plasseringen og typene brudd som er klinisk påtruffet. Med en høy risiko for brudd i skjørhet, er det spådd at det vil være opp mot 21,3 millioner hoftebrudd hvert år innen 205018. Den enorme samfunnsmessige, økonomiske og medisinske byrden dette utgjør, pålitelig testing i gnagermodeller kan forbedre strengheten og reproduserbarheten av forskning rettet mot å forstå etiologien til osteoporose og terapeutiske midler for å behandle den effektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Studien ble støttet av NIH P30AR069655 og R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
