Cantilever bøjning af Murine lårbenshalse

Summary

Den foreliggende protokol beskriver udviklingen af en reproducerbar testplatform for murine lårbenshalse i en udkragende bøjningsopsætning. Brugerdefinerede 3D-trykte guider blev brugt til konsekvent og stift at fastgøre lårbenene i optimal justering.

Abstract

Frakturer i lårbenshalsen er en almindelig forekomst hos personer med osteoporose. Mange musemodeller er blevet udviklet til at vurdere sygdomstilstande og terapier med biomekanisk test som et primært resultatmål. Imidlertid fokuserer traditionel biomekanisk test på torsions- eller bøjningstest, der anvendes på midterakslen af de lange knogler. Dette er typisk ikke stedet for højrisikofrakturer hos osteoporotiske individer. Derfor blev der udviklet en biomekanisk testprotokol, der tester lårbenshalsen på murine lårben i cantilever bøjningsbelastning for bedre at replikere de typer brud, som osteoporosepatienter oplever. Da de biomekaniske resultater er meget afhængige af den bøjningsmæssige belastningsretning i forhold til lårbenshalsen, blev der skabt 3D-trykte guider for at opretholde en lårbensaksel i en vinkel på 20 ° i forhold til belastningsretningen. Den nye protokol strømlinede testen ved at reducere variabiliteten i justering (21,6 ° ± 1,5 °, COV = 7,1%, n = 20) og forbedret reproducerbarhed i de målte biomekaniske resultater (gennemsnitlig COV = 26,7%). Den nye tilgang ved hjælp af de 3D-printede vejledninger til pålidelig prøvejustering forbedrer strenghed og reproducerbarhed ved at reducere målefejlene på grund af prøveforskydning, hvilket bør minimere prøvestørrelser i musestudier af osteoporose.

Introduction

Frakturrisiko er en alvorlig medicinsk bekymring forbundet med osteoporose. Over 1,5 millioner skrøbelighedsfrakturer rapporteres hvert år alene i USA, med brud, der forekommer i hoften, specifikt lårbenshalsen, som den førende ^brudtype1. Det anslås, at 18 % af kvinderne og 6 % af mændene vil opleve et lårbenshalsbrud i deres ^levetid2, og dødeligheden 1 år efter bruddet er større end 20 %¹. Derfor kan musemodeller, der tillader biomekanisk test af lårbenshalsen, være egnede til at studere skrøbelighedsfrakturer. Musemodeller tilbyder også kraftfulde værktøjer til at belyse oversættelige cellulære og molekylære hændelser involveret i osteoporose potentielt. Dette skyldes tilgængeligheden af genetiske reportere, gevinst og tab af funktionsmodeller og det ekspansive bibliotek af molekylære teknikker og reagenser. Mekanisk testning af museknogler kan give de nødvendige resultatmål til bestemmelse af knoglesundhed, genotypiske og fænotypiske variationer, der kan forklare sygdommens ætiologi, og vurdere terapier baseret på resultatmål for knoglens kvalitet og risikoen for ^brud3.

Lårbenshalsens anatomi skaber unikke mekaniske belastningsscenarier, som typisk fører til bøjningsbrud (bøjning). Lårbenshovedet er belastet i acetabulær stikkontakt i den proksimale ende af lårbenet. Dette skaber et udkragende bøjningsscenarie på lårbenshalsen, som er stift fastgjort til lårbensakslen ^distally4. Dette adskiller sig fra traditionelle 3- eller 4-punkts bøjningstest på lårbenets midtdiafyse. Selvom disse tests er nyttige, replikerer de ikke den belastning, der typisk fører til skrøbelighedsfrakturer hos osteopeniske og osteoporotiske individer med hensyn til brudplacering eller belastningsscenariet.

For bedre at vurdere risikoen for skrøbelighedsbrud hos mus blev det søgt at forbedre reproducerbarheden af cantileverbøjningstest af murine lårbenshalse. Som teoretisk forudsagt har belastningsvinklen på lårbenshovedet i forhold til lårbensakslen vist sig at påvirke resultatmålingerne ^betydeligt5, hvilket skaber en udfordring for pålideligheden og reproducerbarheden af rapporterede resultater. For at sikre korrekt og konsekvent justering af lårbenene under prøveforberedelsen blev guider designet og 3D-printet baseret på anatomiske målinger foretaget på μCT-scanninger af C57BL/6 musefminder. Styrene blev designet til at hjælpe med konsekvent at potte prøverne, således at lårbensakslen opretholdes på ~ 20 ° fra den lodrette belastningsretning. Denne vinkel blev valgt, fordi den maksimerer stivheden og samtidig minimerer det maksimale bøjningsmoment langs lårbensakslen, hvilket øger sandsynligheden for lårbenshalsbrud og fører til mere konsistent og reproducerbar ^testning5. Guider blev 3D-printet i forskellige størrelser for at imødekomme anatomiske forskelle mellem prøver og brugt til at holde prøver i en stabil position, mens de pottede i akrylbencement. Stivheden, den maksimale kraft, udbyttekraften og den maksimale energi blev beregnet ud fra kraftforskydningsgraferne. Denne testmetode viste konsistente resultater for det førnævnte biomekaniske resultat. Med praksis og hjælp fra den 3D-printede guide kan målefejl på grund af forkert justering minimeres, hvilket resulterer i pålidelige resultatmål.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af University of Rochester Committee of Animal Resources. Musene, der blev brugt i denne undersøgelse, var C57BL/6 hanner og hunner i alderen 24-29 uger. Mus blev anbragt under standardforhold med mad og vand ad libitum. Ved eutanasi via indånding af kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation blev 20 højre lårben (10 mandlige og 10 kvindelige) høstet og frosset ved -20 ° C, indtil de blev testet.

1. Oprettelse af brugerdefinerede 3D-trykte monteringsguider

BEMÆRK: Dette trin kan være nødvendigt, fordi forskellige stammer og genetiske fænotyper kan have forskellige anatomiske geometrier.

1. Få μCT-scanninger af de repræsentative prøver.
   1. Scan repræsentative prøver på en μCT-scanner med følgende indstillinger: 55 kV, 145 μA i 300 ms integrationstider og opløsning på 10,5 μm voxeller.
   2. Sørg for, at det fangede område dækker den proksimale ende af lårbenet og fortsætter ned gennem midterakslen.
      BEMÆRK: Hvis en μCT-scanner ikke er tilgængelig, kan der anvendes 2D-plane røntgenstråler af de repræsentative prøver.
2. Analysér μCT-scanningerne.
   1. Ved hjælp af det repræsentative sæt μCT-scanninger opnås en 2D-gengivelse af den forreste visning af det proksimale lårben.
      1. Få μCT-billeder med en opløsning på 10,5 μm voxeller fra midterakslen til den proksimale ende af lårbenet. Kompiler disse udsnit ved hjælp af software (se Tabel over materialer) til en 3D-gengivelse af prøven.
      2. Bestem en tærskel for at skelne knogle fra det omgivende væv og anvende et gaussisk filter til støjreduktion.
      3. Orienter 3D-gengivelserne for at eliminere off-axis hældning og sikre, at lårbenets forreste overflade ses.
      4. Eksportér denne 2D-visning af 3D-gengivelsen som en billedfil, f.eks. .jpg eller .png.
   2. Ved hjælp af en billedanalysesoftware (se Tabel over materialer) måles lårbensakselvinklen ved at tegne en linje vinkelret på lårbensakslen 7 mm distalt og en anden linje gennem toppen af den større trochanter til midtpunktet af den førnævnte vinkelrette linje (figur 1).
   3. Langs den 7 mm distale vinkelrette linje måles lårbensakseldiameteren under den tredje trochanter.

Figur 1: μCT-analyse. μCT-billeder af lårben af C57Bl/6-mus bruges til at beregne den gennemsnitlige akselvinkel målt fra toppen af den større trochanter gennem midten af midterakslen, ~7 mm distalt. Midterakseldiameteren blev også målt ved denne position. 3D-gengivelserne af det proksimale lårben blev orienteret i en forreste visning for at vise profilen for den tredje trochanter. Den gennemsnitlige akselvinkel var 93,13 ° (SD = 1,19 °), og den gennemsnitlige mellemakseldiameter var 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Opret monteringshjælpelinjerne ved hjælp af et 3D-modelleringsprogram (se Materialetabel) (figur 2, supplerende fil 1).
   BEMÆRK: Styrene er rektangulære kuboider, der måler 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm med en vinklet åbning, lidt større end den gennemsnitlige akseldiameter bestemt i trin 1.1.2. Spaltens vinkel skaber en ensartet vinkel på 20 ° fra lodret. Styrene skal være konsistente i længde, højde og bredde, men kan laves med forskellige spaltediametre for at imødekomme anatomiske forskelle mellem knogleprøverne.

Figur 2: Design af guiderne. (A) 3D-skitse og (B) visualisering af mellemakselfiskerarmatur før 3D-udskrivning. Baseret på tidligere litteratur maksimerer en mellemakselvinkel mellem 20 ° stivheden. Det minimerer det maksimale bøjningsmoment i lårbensakslen for at sikre, at der opstår brud i nakken og variabilitet i mekaniske ^resultater5. For at kompensere for afvigelsen på 3,13° fra vinkelret i gennemsnitsvinklerne på mellemakslen blev armaturvinklen indstillet til 73,13° for at producere en vinkel på 20°. Justeringsarmaturer blev trykt med diametre fra 1,9-2,2 mm for at sikre en korrekt pasform til varierende midterakseldiametre. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Brug en 3D-printer til at udskrive hjælpelinjerne. Hjælpelinjerne kan forblive tændt under testprocessen, så udskrivning af flere replikater af hjælpelinjerne kan være en fordel for at forberede flere prøver på én gang.

2. Prøveforberedelse

1. Høst musefærderne ved at lave et tværgående snit helt rundt om musens mave og fjerne vævet fra snittet til anklerne. Herefter skal du finde hoftestikket og forsigtigt bruge spidsen af et par fine tang til at forskyde hoften. Skær det ekstra bløde væv for at fjerne benet fra musen.
2. Når benet er høstet, skal du bruge en skalpel til at forskyde og skære gennem knæleddet. Rengør lårbenene manuelt på alt blødt væv ved hjælp af tang, skalpeller og køkkenrulle.
3. De høstede prøver testes straks, eller opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. Hvis prøverne er frosne, skal du lade dem komme til stuetemperatur og hydrere i PBS i 2 timer inden forberedelse.
4. Brug 1/4" x 1/4" firkantet aluminiumsrør (se materialetabel) til at skære slangesektioner 1/2" til 1" i længden. Brug et ætsningsværktøj til at mærke hvert aluminiumssegment med prøve-id'erne.
5. Fyld halvdelen af slangesegmenterne med kitt. Placer disse slangesegmenter i en armatur for at holde dem oprejst.
6. Placer de rensede lårben i de 3D-printede guider. For at gøre dette skal du placere prøverne fladt på bordpladen, så den forreste overflade vender op. Placer styret direkte under den tredje trochanter, hvor akseldiameteren bliver mere konsistent.
   BEMÆRK: Dette vil efterlade ~ 7 mm af det proksimale lårben over styret.
7. For at forhindre lårbenet i at rotere til den laterale eller mediale side, mens du placerer på styret, skal du holde de proksimale og distale ender med den ene hånd, når du påfører styrene, trykke lårbenet fast på arbejdsbordet og ved hjælp af din anden hånd placere den 3D-trykte guide på lårbenets midteraksel. Sørg for at påføre den passende diameterstyring forsigtigt, da lårbenets midteraksel kan knække, hvis den tvinges ind i en for lille guide.
8. Når guiderne er på lårbenene, skal du placere dem foran de tilsvarende aluminiumssegmenter. Brug knoglecement eller andre hærdningsmidler til at fylde aluminiumsegmenterne, indtil de er lige fulde, hvilket giver lidt plads til forskydning.
9. Placer lårbenene med guider på i det korrekte aluminiumssegment.
   BEMÆRK: Styrene vil ikke være centreret om aluminiumssegmenterne, der sidder lidt til den ene side for at lade lårbenets distale ende sidde i midten af aluminiumsgryden.
10. Lad hærdningsmidlet sætte sig. Når prøverne er indstillet, anbringes de i en petriskål med fosfatbufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur og rehydreres i 2 timer (figur 3).

Figur 3: Prøveforberedelse ved hjælp af brugerdefinerede jigs og lystfiskerarmaturer. (A) Prøver i aluminiumspotter med korrekt justering opretholdes ved hjælp af de 3D-trykte guider, mens knoglecementen tørrer. (B) Røntgen før testning viser skyggen af fiskearmaturer og fuldstændig dækning af knoglecement omkring den distale ende af lårben. Det mættede hvide område i bunden af aluminiumspotterne er kitt, der bruges til at holde knoglecement i gryder ved hærdning. Skalabjælke (panel B) = 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Opsætning af hardware

1. Ved hjælp af et mekanisk testsystem (MTS) skal du fastgøre og kalibrere en vejecelle med opløsning <1 N (se materialetabellen) (figur 4A).
   BEMÆRK: Vejecellen kan monteres på scenen eller helst aktuatoren, når det er muligt.
2. Fastgør en armatur med en firkantet slot, der fastholder aluminiumssegmenterne med prøverne. Fastgør de indstillede skruer til de to sider af holdearmaturet for at holde prøverne på plads. (Figur 4B).
   BEMÆRK: Denne armatur kan 3D-printes eller bearbejdes og derefter tappes med gevindskruehuller for at montere på testrammen.
3. Fastgør en ilægningspladen til aktuatoren. Dette kan simpelthen være en koniske skrue med en flad spids (figur 4C).
4. Placer et stereomikroskop på et bord eller en overflade direkte foran MTS. Hvis der er behov for yderligere belysning for at se opsætningen gennem mikroskopet, skal du placere disse omkring systemet.

Figur 4: Hardwareopsætning. (A) Opsætning af test på mekanisk testsystem med 1 kN vejecelle (opløsning < 1 N) og sort biaksialt trin for at sikre korrekt prøvepositionering. (B) Nærbillede af det 3D-printede monteringsarmatur, der er fastgjort til vejecellen med en M10-gevindstang og to M4-bolte, der bruges til at holde aluminiumsgryden på plads. (C) Visning af prøven gennem et stereomikroskop med en konisk belastningsarmatur. Skalabjælke (panel C) = 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Opsætning af software

1. I MTS-softwaren skal du begynde oprettelsen af en ny bøjningsprotokol (bøjning). Sørg for, at protokollen fungerer i forskydningskontrol.
2. Indstil protokollens belastningshastighed til 0,5 mm/s.
3. Hvis softwaren har en indstilling for softkeys, skal du tilføje softkeys "Balance" og "Zero Extension" til protokollen.
   BEMÆRK: Dette indstiller hurtigt belastnings- og aktuatorpositionen til 0, før hver prøve testes.
4. Sørg for, at softwareprogrammet registrerer tiden i sekunder, belastning i Newton og forlængelse eller forskydning i millimeter med en minimumsprøveudtagningshastighed på 100 Hz.
5. Gem den nye protokol, og vend tilbage til hovedskærmen i softwareprogrammet for at begynde at teste et nyt prøvesæt.

5. Opsætning af test

1. Før du monterer prøverne på MTS, skal du få et røntgenbillede af prøverne i aluminiumspotterne. Flere prøver kan afbildes på én gang. Sørg for, at det forreste billede af prøverne registreres for at muliggøre verifikationsmålinger af pottevinklen (figur 5).

Figur 5. Vurdering af prøvejustering. (A) Akselvinklen fra lodret måles fra plane digitale røntgenstråler. (B) Repræsentative lårbensakselvinkler i potte varierede fra 18,11° til 23,99° med en variationskoefficient (COV) på 7,1% (n = 20). Kønsforskelle på grund af anatomiske variationer var ikke statistisk signifikante, som bestemt ved hjælp af en en-halet uparret t-test (p < 0,05). Skalabjælke (panel A) = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Anbring aluminiumssegmentet med prøve i holdearmaturet, og stram sætskruerne.
3. Sænk aktuatoren/belastningspladen, indtil den er inden for få millimeter fra lårbenshovedet.
   BEMÆRK: Forindlæs ikke prøven med nogen kraft, og pas på ikke at sænke aktuatoren for hurtigt, da det er meget let at beskadige prøver.
4. Brug stereomikroskopet til at justere det biaksiale trin for at justere lårbenshovedets position direkte under belastningspladen. Lås biaksiale fase på plads.
5. I MTS-softwaren nulstilles aktuatorens position, og vejecellen afbalanceres ved hjælp af de taster, der blev tilføjet i trin 4.3.
6. Begynd indlæsningsprotokollen. Afhængigt af hvor meget plads der var tilbage mellem lastpladen og prøven, vil testen kun tage 10-30 s.
7. Efter testning skal du fange en anden forreste røntgen af prøven. Dette vil blive brugt til at skelne og dokumentere brudmåden (figur 6).

Figur 6: Røntgenbillede af prøver efter testning. Alle prøver brækkede i en forgrenet linje gennem lårbenshalsen og langs lårbenshalsen (fremhævet af den orange cirkel). Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Analyse af data

1. Efter dataindsamling eksporteres kraft- og forskydningsdata til software (se tabel over materialer), der giver mulighed for grafer og matematiske beregninger.
2. Plot belastningen vs. forskydning for hver prøve (figur 7A). Tilpas en lineær tilnærmelse til det lineære segment af belastningsforskydningskurven. Hældningen af denne lineære pasform vil definere stivheden, et mål for prøvens elasticitet.
3. Beregn de yderligere resultater såsom maksimal belastning, maksimal forskydning, udbyttebelastning, forskydning ved udbyttepunkt, energi til maksimal belastning og energi til udbyttepunkt.
   BEMÆRK: Udbyttepunktet kan bestemmes ved at modindsætte den lineære tilnærmelse bestemt i trin 6,2 med 0,2 %⁶. Det punkt, hvor den modstillede linje og belastningen vs. forskydningskurve skærer hinanden bestemmer udbyttepunktet. I tilfælde af meget sprøde prøver, der viser ringe udbytte, kan udbyttepunktet være det samme som det maksimale punkt.

Representative Results

Når de blev pottet ved hjælp af styret, blev lårbensakslerne justeret ved 21,6 ° ± 1,5 °. Selv om dette repræsenterer <10 % afvigelse fra den tilsigtede vinkel på 20°, var variationskoefficienterne (COV) for pottevinklen på tværs af alle testede prøver henholdsvis 7,6 % og 6,5 % for han- og hunmus (n = 10 pr. gruppe) som verificeret ved plane røntgenstråler før testen (figur 5). Derudover bør røntgenstrålerne efter testning bruges til at vurdere den tilstand, hvor prøverne mislykkedes. Svigt blev konsekvent observeret i lårbenshalsen, som tilsigtet, på en forgrenet måde med en brudlinje parallelt med lårbensakslen og den anden linje vinkelret på lårbenshalsen (figur 6). Hvis der skulle forekomme betydelige variationer i brudmønsteret blandt prøver, kunne knoglekvaliteten af prøver vurderes yderligere via μCT ved at måle resultater såsom volumetrisk knoglemineraltæthed, trabekulær og kortikal tykkelse, afstand og mineralisering. Hvis svigt ikke konsekvent induceres i lårbenshalsen, kan de 3D-trykte guider justeres.

De biomekaniske resultatmål, der er rapporteret heri, er i overensstemmelse med værdier rapporteret i lignende aksiale bøjninger af lårbenshalsekonfigurationer7,8,9,10,11,12,13,14. Den konsekvente justering, der blev opnået ved hjælp af de 3D-trykte guider, forbedrede imidlertid generelt COV for den maksimale belastning i særdeleshed (tabel 1).

Aktuel undersøgelse	Køn	Midterste akselens vinkel	Maks. belastning	Stivhed	Arbejde til fiasko
	Mandlig	8%	10%	20%	24%
	Kvindelig	7%	9%	35%	38%
Jämsä et al10	Mandlig	NR	22%	NR	NR
Jämsä et al8	Mandlig	NR	19%	NR	NR
Kamal et al9	Kvindelig	NR	16%-25%	11%-28%	NR
Middleton et al7	Kvindelig	NR	24%-27%	NR	NR
Brent et al11	Kvinde - rotter	NR	18%-24%	NR	NR
Bromer et al12*	Kvindelig	NR	11%-27%	NR	NR
Vegger et al13*	Kvindelig	NR	16%-32%	NR	NR
Lodberg14*	Kvindelig	NR	11%-45%	NR	NR
NR: Ikke indberettet
*: Data ekstrapoleret fra offentliggjorte tal

Tabel 1: Variationskoefficienter for målte bøjningsegenskaber af musens lårbenshalse. Variationskoefficienterne repræsenterer et forhold mellem standardafvigelsen og gennemsnittet af et datasæt. Efterhånden som COV falder, indikerer dette en strammere gruppering af de enkelte datapunkter omkring middelværdien. Denne protokol reducerede COV for maksimal belastning sammenlignet med andre publikationer, der udførte lignende test.

Som forventet blev kønsforskelle observeret i de målte mekaniske egenskaber. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en en-halet uparret t-test. Lårbenshalsen fra hanmus var signifikant stærkere og stivere end prøver fra hunmus (henholdsvis p = 0,009 og p = 0,0006). Derudover oplevede de kvindelige lårbenshalse mere signifikante deformationer (p = 0,014) og arbejdede til fiasko (p = 0,024) sammenlignet med prøver fra hanmus (figur 7). Dette er i overensstemmelse med den lavere knoglemineraltæthed hos kvinder og understreger testens følsomhed for at detektere fysiologisk relevante forskelle. I de kohorter af han- og hunmus, der blev anvendt i denne undersøgelse, var knoglemineraltætheden hos hunmus signifikant lavere end deres mandlige modstykker, som bestemt ved en dual-energy røntgenabsorptivometriscanning (DEXA) og en en-halet uparret t-test (p = 0,036).

Figur 7: Biomekaniske resultater. (A) En repræsentativ kraftforskydningskurve, der viser en 0,2% forskudt lineær pasform, bruges til at udlede stivhed og udbyttepunkt. Udvalgte resultatmål er scatter plottet, der viser middel- og standardafvigelse, herunder (B) maksimal belastning (ved fejl), (C) stivhed, (D) maksimal forskydning (ved fejl) og (E) arbejde til fiasko (område under kurven op til fejlpunktet). Stjerner angiver signifikante forskelle bestemt ved hjælp af en uparret t-test med én hale (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 pr. kønskohorte). Klik her for at se en større version af denne figur.

For at bekræfte, at de små variationer i pottevinklen ikke bidrog til den eksperimentelle variabilitet, blev hvert biomekanisk resultatmål plottet mod pottevinklen og udført en simpel lineær regression for den mandlige kohorte, den kvindelige kohorte og alle prøver grupperet sammen (figur 8). Hypotesen blev derefter testet, at den lineære regressionshældning ikke er nul. Regressionsanalysen viste, at bortset fra stivheden påvirkede de små variationer i pottevinklen (intervallet 18° til 24°) ikke de biomekaniske resultatmål. For stivhed var der en signifikant lineær korrelation med pottevinklen (^R2 = 0,29, p < 0,05).

Figur 8: Pottevinklens effekt på biomekaniske resultater. Biomekaniske resultatmål, herunder (A) maksimal belastning, (B) stivhed, (C) maksimal forskydning og (D) arbejde til fiasko blev plottet mod pottevinklen og korreleret ved hjælp af en simpel lineær regression for den mandlige kohorte, kvindelige kohorte og alle prøver grupperet sammen. Faste sorte linjer viser lineær regression af grupperede prøver, med prikkede linjer, der angiver konfidensintervaller. Variabilitet i pottevinklen påvirkede ikke signifikant den maksimale belastning, maksimale forskydning eller fejlarbejde. Efterhånden som pottevinklen steg, steg stivheden imidlertid, som bestemt af en Pearsons test (p = 0,0126, n = 20). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Standard trekantsprog (. STL) fil af guiderne. Denne fil kan bruges til at udskrive de vejledninger, der er beskrevet i protokollen. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol skitserer en pålidelig udkragende bøjningstest for murine lårbenshalse. Det naturlige udkragelsesfleksurscenarie, der forekommer ved lårbenshalsen, er typisk ikke repræsenteret i standard 3- og 4-punktsbøjningstest5. Denne testmetode er bedre og mere pålideligt replikerer den type lårbenshalsbrud, som patienter med knoglesvaghed oplever. Hovedfokus ved udførelse af denne protokol er at eliminere variabiliteten på grund af inkonsekvent potting af lårbensakslen. Det er kritisk, at nøje at følge de trin, der er skitseret i protokollens første og fjerde afsnit, vil sikre, at oprettelsen af guiderne og indlæsningsprotokollen replikerer det, der rapporteres i denne publikation. Som det teoretisk kan forudsiges og vises eksperimentelt, kan midterakselvinklen i forhold til belastningsaksen påvirke de belastninger, der opleves af lårbenshalsen og sandsynligheden for, at bruddet opstår ved lårbenshalsen. Tidligere grupper har vist, at mellemakselvinklen signifikant påvirker lårbenets trykstivhed og styrke, når den belastes gennem lårbenshovedet. Parametrisk analyse af virkningerne af hældningsvinkler på mellemakslen viste, at de maksimale bøjningsmomenter i lårbensakslerne oplever et minimum ved midterakselvinkler mellem 15° og 25°, hvilket også maksimerer akselstivheden5. Denne vinkel minimerer derfor sandsynligheden for kompressionsbrud i akslen og øger sandsynligheden for bøjningsbrud i lårbenshalsen.

Flere parametre kan påvirke resultaterne af enhver biomekanisk test og forvirre evnen til at detektere signifikante forskelle på grund af fysiologisk relevante eksperimentelle variabler. Denne variabilitet forværres af den lille størrelse af lange museknogler. Blandt de parametre, der kræver opmærksomhed i denne test, er især antallet af fryse-optøningscyklusser og hydreringstilstand af knoglen, belastningshastigheden og justeringen af lårbensakslen i forhold til belastningsaksen. Protokollen fastsætter, at alle prøver gennemgår det samme antal fryse-optøningscyklusser og et 2 timers vindue til hydrering i PBS ved stuetemperatur. Belastningshastigheden indstilles også til en ensartet værdi på 0,5 mm/^s3,4. Desuden blev 3D-trykte guider designet til konsekvent at placere lårbenet i en midterakselens vinkel på ~ 20 ° under pottetrinnet. Dette resulterede i konsistente mellemakselvinkler i området fra 18 ° til 24 °, uden signifikante kønseffekter på grund af anatomiske forskelle og variationskoefficienter på henholdsvis 7,6% og 6,5% for han- og hunmus. Disse vejledninger er tilgængelige, let modificerede ved hjælp af standard solid modelleringssoftware og gengives efter behov ved hjælp af en billig desktop 3D-printer.

De repræsentative resultater viste, at testprotokollen er følsom over for subtile fysiologiske forskelle, såsom køn, med en rimelig prøvestørrelse på n = 10. En retrospektiv effektanalyse, der tegner sig for eksperimentelt bestemte størrelseseffekter (δ = Δmean / SD) ved n = 10, foreslog, at effekten blev anslået til at være 57% for den maksimale belastning ved svigt (δ = 0,8), >95% for stivheden (δ = 1,77) og den maksimale forskydning (δ = 1,9) og 83% for arbejdet til fiasko (δ = 1,77). Sammen med de små variationskoefficienter (tabel 1) bekræfter denne effektanalyse, at variationen i pottevinklen påvirkede protokollens følsomhed og pålidelighed negativt.

Den subjektive analyse af fejlmåde viste også, at 100% af de testede prøver mislykkedes i lårbenshalsen, da de alle viste en forgrenet brud, med en brudlinje, der løber parallelt med akslen på det sted, den møder nakken, og en anden brudlinje vinkelret på lårbenshalsen i toppen af bifurcationen. Dette omfatter træk fra to klinisk relevante tilstande af lårbenshalsbrud; de intertrochanteriske og transcervikale ^nakkebrud15. Femoral hals cantilever bøjningstest er ikke så almindeligt anvendt og beskrevet i litteraturen som standard torsion eller flexure test af lårben og tibiale mellemaksler i gnavermodeller af osteoporose. Kun en håndfuld undersøgelser blev identificeret for at beskrive sådanne protokoller ved hjælp af muse- og rottemodeller5,7,8,9,16,17. Den vinkel, hvor lårbenene blev placeret under testen, rapporteres ikke altid. Nogle med detaljerede beskrivelser bruger en overdreven mængde brugerdefinerede armaturer og software til at justere deres ^prøver5, men tyer stadig til potting i hånden og introducerer den samme menneskelige fejl i andre protokoller.

Denne protokol er designet til murineprøver og er specificeret til C57Bl/6-mus, men kunne let tilpasses store dyremodeller eller andre murinestammer med forskellig lårbensgeometri. Fremtidige efterforskere, der bruger denne protokol, skal muligvis ændre mængden af eksponeret knogle, da den tredje trochanter muligvis ikke er nøjagtigt 7 mm distally fra lårbenshovedet. Yderligere ændringer af protokollen omfatter anvendelse af et hærdningsmiddel, der kan blødgøres efter test for at frigive prøven, hvis yderligere test ønskes. Dette kunne gøres med en vismutlegering, der kunne smeltes i et varmtvandsbad efter test for at frigive ^prøven7. Den endelige ændring, som brugerne kan foretage af denne protokol, undgås i trin 3.1, idet den er vejecellens type og placering. Der bør anvendes en aksial vejecelle med en opløsning under 1 N. En 50 N-vejecelle vil være hensigtsmæssig på grundlag af de maksimale belastninger, der observeres. Desuden bør en vejecelle, der kun måler spænding eller kompression, anvendes for at undgå ethvert sammensat bøjningsmoment, som vejecellen kan opleve ved excentrisk belastning i forhold til vejecellen. En anden måde at undgå målinger af sammensatte kraft på ville være at fastgøre vejecellen til aktuatoren for at sikre, at belastningskraften er i overensstemmelse med vejecellen.

Denne protokol forenkler behovet for brugerdefinerede armaturer, beskriver, hvordan guider kan udskrives på enhver kommercielt tilgængelig 3D-printer, og bruger fælles laboratorieudstyr til grundigt og reproducerbart at teste prøver, som det fremgår af de lavere variationskoefficienter, der er rapporteret i den aktuelle undersøgelse (tabel 1). Denne protokol er dog ikke begrænset af behovet for en 3D-printer. Der findes kommercielt tilgængelige løsninger, hvor 3D-renderingsfilerne kan sendes til trykkerier, og delene kan sendes retur. Derudover simulerer denne form for bøjningsbelastning på lårbenshalsen placeringen og typerne af brud, der klinisk opstår. Med antallet af personer med høj risiko for skrøbelighedsbrud forudsiges det, at der vil være op mod 21,3 millioner hoftebrud hvert år i ²⁰⁵⁰¹⁸. Den enorme samfundsmæssige, økonomiske og medicinske byrde, dette udgør, pålidelig test i gnavermodeller kan forbedre strengheden og reproducerbarheden af forskning rettet mod at forstå ætiologien af osteoporose og terapi til at behandle det effektivt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.