Cantilever Bending von murinen Oberschenkelhälsen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung einer reproduzierbaren Testplattform für murine Femurhälse in einem Freischwinger-Biegeaufbau. Kundenspezifische 3D-gedruckte Führungen wurden verwendet, um die Oberschenkelknochen konsequent und starr in optimaler Ausrichtung zu fixieren.

Abstract

Frakturen im Oberschenkelhals treten häufig bei Personen mit Osteoporose auf. Viele Mausmodelle wurden entwickelt, um Krankheitszustände und Therapien zu bewerten, wobei biomechanische Tests ein primäres Ergebnismaß sind. Traditionelle biomechanische Tests konzentrieren sich jedoch auf Torsions- oder Biegetests, die auf die Mittelwelle der langen Knochen angewendet werden. Dies ist in der Regel nicht der Ort von Hochrisikofrakturen bei osteoporotischen Personen. Daher wurde ein biomechanisches Testprotokoll entwickelt, das die Oberschenkelhälse von murinen Femuren in der Cantilever-Biegebelastung testet, um die Arten von Frakturen, die von Osteoporosepatienten erlebt werden, besser zu replizieren. Da die biomechanischen Ergebnisse stark von der Biegebelastungsrichtung relativ zum Oberschenkelhals abhängen, wurden 3D-gedruckte Führungen erstellt, um einen Femurschaft in einem Winkel von 20° relativ zur Belastungsrichtung aufrechtzuerhalten. Das neue Protokoll rationalisierte die Tests, indem es die Variabilität der Ausrichtung (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) reduzierte und die Reproduzierbarkeit der gemessenen biomechanischen Ergebnisse verbesserte (durchschnittlicher COV = 26,7%). Der neue Ansatz, der die 3D-gedruckten Leitfäden für eine zuverlässige Probenausrichtung verwendet, verbessert die Strenge und Reproduzierbarkeit, indem die Messfehler aufgrund von Probenfehlausrichtungen reduziert werden, was die Stichprobengrößen in Mausstudien zur Osteoporose minimieren sollte.

Introduction

Das Frakturrisiko ist ein ernstes medizinisches Problem im Zusammenhang mit Osteoporose. Allein in den Vereinigten Staaten werden jedes Jahr über 1,5 Millionen Fragilitätsfrakturen gemeldet, wobei Frakturen in der Hüfte, insbesondere im Oberschenkelhals, als führender ^Frakturtyp1 auftreten. Es wird geschätzt, dass 18% der Frauen und 6% der Männer in ihrem Leben eine Oberschenkelhalsfraktur erleiden ^werden2, und die Sterblichkeitsrate nach 1 Jahr nach der Fraktur ist größer als 20%¹. Daher können Mausmodelle, die eine biomechanische Untersuchung des Oberschenkelhalses ermöglichen, für die Untersuchung von Fragilitätsfrakturen geeignet sein. Mausmodelle bieten auch leistungsstarke Werkzeuge, um übersetzbare zelluläre und molekulare Ereignisse aufzuklären, die potenziell an Osteoporose beteiligt sind. Dies ist auf die Verfügbarkeit genetischer Reporter, den Gewinn und Verlust von Funktionsmodellen und die umfangreiche Bibliothek molekularer Techniken und Reagenzien zurückzuführen. Mechanische Tests von Mausknochen können notwendige Ergebnismessungen liefern, um die Knochengesundheit, genotypische und phänotypische Variationen zu bestimmen, die die Ätiologie der Krankheit erklären könnten, und Therapien auf der Grundlage von Ergebnismessungen der Knochenqualität und des Frakturrisikos zu ^bewerten3.

Die Anatomie des Oberschenkelhalses erzeugt einzigartige mechanische Belastungsszenarien, die typischerweise zu Biege- (Biege-) Frakturen führen. Der Hüftkopf wird in der Hüftpfanne am proximalen Ende des Femurs belastet. Dadurch entsteht ein Cantilever-Biegeszenario am Oberschenkelhals, der starr am Femurschaft distal befestigt ^ist4. Dies unterscheidet sich von herkömmlichen 3- oder 4-Punkt-Biegetests an der Femurmitteldiaphyse. Während diese Tests hilfreich sind, replizieren sie nicht die Belastung, die typischerweise zu Fragilitätsfrakturen bei osteopenischen und osteoporotischen Personen in Bezug auf die Frakturlokalisation oder das Belastungsszenario führt.

Um das Fragilitätsfrakturrisiko bei Mäusen besser beurteilen zu können, wurde versucht, die Reproduzierbarkeit von Freischwinger-Biegetests an murinen Oberschenkelhälsen zu verbessern. Wie theoretisch vorhergesagt, hat sich gezeigt, dass der Belastungswinkel des Hüftkopfes im Verhältnis zum Oberschenkelschaft die Ergebnismessungen signifikant ^beeinflusst5, wodurch eine Herausforderung für die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der berichteten Ergebnisse entsteht. Um eine korrekte und konsistente Ausrichtung der Oberschenkelknochen während der Probenvorbereitung zu gewährleisten, wurden Leitfäden entworfen und auf der Grundlage anatomischer Messungen an μCT-Scans von C57BL/6-Maus-Femuren in 3D gedruckt. Die Führungen wurden entwickelt, um das gleichmäßige Einfüllen der Proben zu unterstützen, so dass der Oberschenkelschaft bei ~ 20 ° von der vertikalen Belastungsrichtung gehalten wird. Dieser Winkel wurde gewählt, weil er die Steifigkeit maximiert und gleichzeitig das maximale Biegemoment entlang des Oberschenkelschafts minimiert, was die Wahrscheinlichkeit von Oberschenkelhalsfrakturen erhöht und zu konsistenteren und reproduzierbareren Tests ^führt5. Die Führungen wurden in verschiedenen Größen in 3D gedruckt, um anatomische Unterschiede zwischen den Proben auszugleichen, und verwendet, um Proben in einer stabilen Position zu halten, während sie in Acrylknochenzement eingegossen wurden. Die Steifigkeit, die maximale Kraft, die Streckgrenze und die maximale Energie wurden aus den Kraft-Weg-Diagrammen berechnet. Diese Testmethode zeigte konsistente Ergebnisse für das oben genannte biomechanische Ergebnis. Mit Übung und hilfe der 3D-gedruckten Führung können Messfehler durch Fehlausrichtung minimiert werden, was zu zuverlässigen Ergebnismessungen führt.

Protocol

Tierversuche wurden vom Committee of Animal Resources der University of Rochester genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren C57BL/6 Männer und Frauen im Alter von 24-29 Wochen. Mäuse wurden unter Standardbedingungen mit Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht. Nach der Euthanasie durch Kohlendioxidinhalation, gefolgt von einer zervikalen Luxation, wurden 20 rechte Oberschenkelknochen (10 männliche und 10 weibliche) geerntet und bei -20 °C eingefroren, bis sie getestet wurden.

1. Erstellung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Montageanleitungen

HINWEIS: Dieser Schritt kann erforderlich sein, da verschiedene Stämme und genetische Phänotypen unterschiedliche anatomische Geometrien aufweisen können.

1. Erhalten Sie μCT-Scans der repräsentativen Proben.
   1. Scannen Sie repräsentative Proben auf einem μCT-Scanner mit den folgenden Einstellungen: 55 kV, 145 μA für 300 ms Integrationszeiten und Auflösung von 10,5 μm Voxeln.
   2. Stellen Sie sicher, dass die erfasste Region das proximale Ende des Femurs bedeckt und sich durch die Mittelwelle fortsetzt.
      HINWEIS: Wenn ein μCT-Scanner nicht verfügbar ist, können planare 2D-Röntgenaufnahmen der repräsentativen Proben verwendet werden.
2. Analysieren Sie die μCT-Scans.
   1. Mit dem repräsentativen Satz von μCT-Scans erhalten Sie ein 2D-Rendering der vorderen Ansicht des proximalen Femurs.
      1. Erhalten Sie μCT-Bilder mit einer Auflösung von 10,5 μm Voxeln von der Mittelwelle bis zum proximalen Ende des Femurs. Kompilieren Sie diese Slices mithilfe einer Software (siehe Materialtabelle) zu einem 3D-Rendering des Beispiels.
      2. Bestimmen Sie einen Schwellenwert, um Knochen vom umgebenden Gewebe zu unterscheiden, und wenden Sie einen Gaußschen Filter zur Rauschunterdrückung an.
      3. Richten Sie die 3D-Renderings aus, um eine Neigung außerhalb der Achse zu vermeiden und sicherzustellen, dass die vordere Oberfläche des Femurs angezeigt wird.
      4. Exportieren Sie diese 2D-Ansicht des 3D-Renderings als Bilddatei, z. B. .jpg oder .png.
   2. Messen Sie mit einer Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) den Femurschaftwinkel, indem Sie eine Linie senkrecht zum Oberschenkelschaft 7 mm distal und eine zweite Linie durch den Peak des größeren Trochanters bis zum Mittelpunkt der oben genannten senkrechten Linie zeichnen (Abbildung 1).
   3. Messen Sie entlang der 7 mm distalen senkrechten Linie den Femurschaftdurchmesser unterhalb des dritten Trochanters.

Abbildung 1: μCT-Analyse. μCT-Bilder von Femuren von C57Bl/6-Mäusen werden verwendet, um den durchschnittlichen Schaftwinkel zu berechnen, gemessen von der Oberseite des größeren Trochanters durch die Mitte der Mittelwelle, ~7 mm distal. An dieser Stelle wurde auch der Mittelwellendurchmesser gemessen. Die 3D-Renderings des proximalen Femurs wurden in einer vorderen Ansicht ausgerichtet, um das Profil des dritten Trochanters darzustellen. Der durchschnittliche Wellenwinkel betrug 93,13° (SD = 1,19°) und der durchschnittliche Mittelwellendurchmesser 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Erstellen Sie die Montageanleitungen mit einer 3D-Modellierungssoftware (siehe Materialtabelle) (Abbildung 2, Ergänzende Datei 1).
   HINWEIS: Bei den Führungen handelt es sich um rechteckige Quader mit den Maßen 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm mit einem abgewinkelten Schlitz, der etwas größer ist als der in Schritt 1.1.2 ermittelte durchschnittliche Wellendurchmesser. Der Winkel des Schlitzes erzeugt einen konsistenten Winkel von 20 ° von der Vertikalen. Die Führungen sollten in Länge, Höhe und Breite einheitlich sein, können aber mit verschiedenen Schlitzdurchmessern hergestellt werden, um anatomische Unterschiede zwischen den Knochenproben auszugleichen.

Abbildung 2: Entwerfen der Führungen. (A) 3D-Skizze und (B) Visualisierung der Mittelwellen-Angelvorrichtung vor dem 3D-Druck. Basierend auf früherer Literatur maximiert ein Mittelwellenwinkel zwischen 20° die Steifigkeit. Es minimiert das maximale Biegemoment im Oberschenkelschaft, um sicherzustellen, dass Frakturen im Nacken und Variabilität der mechanischen Ergebnisse ^auftreten5. Um die Abweichung von 3,13° von der Senkrechten in den mittleren Wellenwinkeln auszugleichen, wurde der Befestigungswinkel auf 73,13° eingestellt, um einen Winkel von 20° zu erzeugen. Ausrichtungsvorrichtungen wurden mit Durchmessern von 1,9-2,2 mm gedruckt, um eine korrekte Passform für unterschiedliche Mittelwellendurchmesser zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Drucken Sie die Hilfslinien mit einem 3D-Drucker aus. Die Hilfslinien können während des Testprozesses eingeschaltet bleiben, sodass das Drucken mehrerer Replikate der Hilfslinien für die gleichzeitige Vorbereitung mehrerer Proben von Vorteil sein kann.

2. Probenvorbereitung

1. Ernten Sie die Femuren der Maus, indem Sie einen Querschnitt vollständig um den Bauch der Maus machen und das Gewebe vom Schnitt bis zu den Knöcheln entfernen. Danach lokalisieren Sie die Hüftpfanne und verwenden Sie vorsichtig die Spitze einer feinen Pinzette, um die Hüfte zu verrenken. Schneiden Sie das zusätzliche Weichgewebe ab, um das Bein von der Maus zu entfernen.
2. Sobald das Bein geerntet ist, verwenden Sie ein Skalpell, um das Kniegelenk zu verrenken und zu schneiden. Reinigen Sie die Oberschenkelknochen manuell von allem Weichgewebe mit pinzette, Skalpell und Papiertüchern.
3. Testen Sie die geernteten Proben sofort oder lagern Sie sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate. Wenn die Proben eingefroren sind, lassen Sie sie auf Raumtemperatur kommen und hydratisieren Sie in PBS für 2 h, bevor Sie sich vorbereiten.
4. Schneiden Sie mit 1/4 "x 1/4" quadratischen Aluminiumrohren (siehe Materialtabelle) Schlauchabschnitte von 1/2 " bis 1" Länge. Beschriften Sie jedes Aluminiumsegment mit einem Ätzwerkzeug mit den Proben-IDs.
5. Füllen Sie die Hälfte der Schlauchsegmente mit Kitt. Legen Sie diese Schlauchsegmente in eine Vorrichtung, um sie aufrecht zu halten.
6. Legen Sie die gereinigten Oberschenkelknochen in die 3D-gedruckten Führungen. Legen Sie dazu die Proben flach auf die Tischplatte, so dass die vordere Oberfläche nach oben zeigt. Platzieren Sie die Führung direkt unter dem dritten Trochanter, wo der Wellendurchmesser gleichmäßiger wird.
   HINWEIS: Dadurch bleiben ~ 7 mm des proximalen Femurs über der Führung.
7. Um zu verhindern, dass sich der Femur während der Platzierung auf der Führung zur seitlichen oder medialen Seite dreht, halten Sie beim Auftragen der Führungen die proximalen und distalen Enden mit einer Hand fest auf die Werkbank und legen Sie mit der anderen Hand die 3D-gedruckte Führung auf die Mittelwelle des Femurs. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechende Durchmesserführung vorsichtig auftragen, da die Mittelwelle des Femurs einrasten kann, wenn sie in eine zu kleine Führung gedrückt wird.
8. Sobald sich die Führungen auf den Oberschenkelknochen befinden, platzieren Sie sie vor den entsprechenden Aluminiumsegmenten. Füllen Sie die Aluminiumsegmente mit Knochenzement oder anderen Härtern, bis sie vollständig sind, und lassen Sie ein wenig Platz für die Verschiebung.
9. Platzieren Sie die Oberschenkelknochen mit Führungen im richtigen Aluminiumsegment.
   HINWEIS: Die Führungen werden nicht auf den Aluminiumsegmenten zentriert und leicht zu einer Seite sitzen, damit das distale Ende des Femurs in der Mitte des Aluminiumtopfes sitzen kann.
10. Lassen Sie das Härtungsmittel setzen. Nach dem Fixieren werden die Proben in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur gegeben und 2 h rehydriert (Abbildung 3).

Abbildung 3: Probenvorbereitung mit benutzerdefinierten Vorrichtungen und Angelvorrichtungen. (A) Proben in Aluminiumtöpfen mit der richtigen Ausrichtung werden mit den 3D-gedruckten Führungen gepflegt, während der Knochenzement trocknet. (B) Röntgenaufnahmen vor der Prüfung zeigen den Schatten der Angelvorrichtungen und die vollständige Abdeckung von Knochenzement, der das distale Ende der Oberschenkelknochen umgibt. Der gesättigte weiße Bereich am Boden der Aluminiumtöpfe ist Kitt, der verwendet wird, um Knochenzement in Töpfen beim Aushärten zu halten. Maßstabsleiste (Panel B) = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Hardware-Setup

1. Befestigen und kalibrieren Sie mit einem mechanischen Prüfsystem (MTS) eine Wägezelle mit einer Auflösung <1 N (siehe Materialtabelle) (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Die Wägezelle kann nach Möglichkeit auf der Bühne oder vorzugsweise am Aktuator montiert werden.
2. Befestigen Sie eine Halterung mit einem quadratischen Schlitz, der die Aluminiumsegmente mit den Proben fest hält. Befestigen Sie Stellschrauben an den beiden Seiten der Haltevorrichtung, um die Proben fest an Ort und Stelle zu halten. (Abbildung 4B).
   HINWEIS: Diese Vorrichtung kann 3D-gedruckt oder bearbeitet und dann mit Gewindeschraubenlöchern gebohrt werden, um sie am Prüfrahmen zu montieren.
3. Befestigen Sie eine Ladeplatte am Aktuator. Dies kann einfach eine konische Schraube mit einer abgeflachten Spitze sein (Abbildung 4C).
4. Platzieren Sie ein Stereomikroskop auf einem Tisch oder einer Oberfläche direkt vor dem MTS. Wenn zusätzliche Beleuchtung benötigt wird, um den Aufbau durch das Mikroskop zu sehen, platzieren Sie diese um das System herum.

Abbildung 4: Hardware-Aufbau. (A) Einrichtung der Prüfung auf einem mechanischen Prüfsystem mit 1 kN Wägezelle (Auflösung < 1 N) und schwarzem Biaxialtisch, um eine ordnungsgemäße Probenpositionierung zu gewährleisten. (B) Nahaufnahme der 3D-gedruckten Montagevorrichtung, die an der Wägezelle befestigt ist, mit einer M10-Gewindestange und zwei M4-Schrauben, die zum Halten des Aluminiumtopfes verwendet werden. (C) Ansicht der Probe durch ein Stereomikroskop mit einer konischen Ladevorrichtung. Maßstabsleiste (Panel C) = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Software-Einrichtung

1. Beginnen Sie in der MTS-Software mit der Erstellung eines neuen Biegeprotokolls. Stellen Sie sicher, dass das Protokoll bei der Verschiebungssteuerung funktioniert.
2. Stellen Sie die Laderate des Protokolls auf 0,5 mm/s ein.
3. Wenn die Software eine Einstellung für Softkeys hat, fügen Sie dem Protokoll die Softkeys "Balance" und "Zero Extension" hinzu.
   HINWEIS: Dadurch wird die Last- und Aktorposition schnell auf 0 eingestellt, bevor jede Probe getestet wird.
4. Stellen Sie sicher, dass das Softwareprogramm die Zeit in Sekunden, die Last in Newton und die Ausdehnung oder Verschiebung in Millimetern bei einer Minimalabtastrate von 100 Hz aufzeichnet.
5. Speichern Sie das neue Protokoll und kehren Sie zum Hauptbildschirm des Softwareprogramms zurück, um mit dem Testen eines neuen Beispielsatzes zu beginnen.

5. Testaufbau

1. Bevor Sie die Proben auf dem MTS montieren, erhalten Sie ein Röntgenbild der Proben in den Aluminiumtöpfen. Mehrere Proben können gleichzeitig abgebildet werden. Stellen Sie sicher, dass die vordere Ansicht der Proben erfasst wird, um Verifizierungsmessungen des Vergusswinkels zu ermöglichen (Abbildung 5).

Abbildung 5. Beurteilung der Stichprobenausrichtung. (A) Der Wellenwinkel von der Vertikalen wird aus planaren digitalen Röntgenstrahlen gemessen. (B) Repräsentative Verguss-Oberschenkelwellenwinkel lagen zwischen 18,11° und 23,99°, mit einem Variationskoeffizienten (COV) von 7,1% (n = 20). Geschlechtsunterschiede aufgrund anatomischer Variationen waren statistisch nicht signifikant, wie mit einem einseitigen ungepaarten t-Test bestimmt (p < 0,05). Maßstabsleiste (Tafel A) = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Legen Sie das Aluminiumsegment mit Probe in die Haltevorrichtung und ziehen Sie die Stellschrauben fest.
3. Untere Betätigungs-/Ladeplatte, bis sie sich innerhalb weniger Millimeter vom Hüftkopf befindet.
   HINWEIS: Laden Sie die Probe nicht mit irgendeiner Kraft vor und achten Sie darauf, den Aktuator nicht zu schnell abzusenken, da es sehr leicht ist, Proben zu beschädigen.
4. Stellen Sie mit dem Stereomikroskop die biaxiale Stufe so ein, dass die Position des Hüftkopfes direkt unter der Ladeplatte ausgerichtet wird. Sperren Sie die biaxiale Stufe an Ort und Stelle.
5. In der MTS-Software die Position des Aktuators auf Null setzen und die Wägezelle mit den in Schritt 4.3 hinzugefügten Softkeys ausgleichen.
6. Starten Sie das Ladeprotokoll. Je nachdem, wie viel Platz zwischen Ladeplatte und Probe noch übrig war, dauert die Prüfung nur 10-30 s.
7. Erfassen Sie nach dem Test eine weitere vordere Röntgenaufnahme der Probe. Dies wird verwendet, um die Art der Fraktur zu erkennen und zu dokumentieren (Abbildung 6).

Abbildung 6: Röntgenaufnahme von Proben nach der Prüfung. Alle Proben brachen in einer gegabelten Linie durch den Oberschenkelhals und entlang des Oberschenkelhals-Schaft-Aufsatzes (hervorgehoben durch den orangefarbenen Kreis). Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Datenanalyse

1. Exportieren Sie nach der Datenerfassung Kraft- und Verschiebungsdaten in eine Software (siehe Materialtabelle), die grafische darstellungen und mathematische Berechnungen ermöglicht.
2. Plotten Sie die Last vs. Verschiebung für jede Probe (Abbildung 7A). Passen Sie eine lineare Annäherung an das lineare Segment der Last-Weg-Kurve an. Die Steigung dieser linearen Passung definiert die Steifigkeit, ein Maß für die Elastizität der Probe.
3. Berechnen Sie die zusätzlichen Ergebnisse wie maximale Last, maximale Verschiebung, Ertragslast, Verschiebung am Ertragspunkt, Energie zur maximalen Last und Energie zur Ertragspunkt.
   ANMERKUNG: Die Streckgrenze kann bestimmt werden, indem die in Schritt 6.2 ermittelte lineare Näherung um 0,2 %⁶ versetzt wird. Der Punkt, an dem die Offset-Linie und die Last vs. Die Verschiebungskurvenschnitte bestimmen den Streckgrenzepunkt. Bei sehr spröden Proben, die eine geringe Ausbeute aufweisen, kann die Streckgrenze mit dem Maximalpunkt übereinstimmen.

Representative Results

Beim Verguss mit Hilfe der Führung wurden die Oberschenkelschäfte bei 21,6° ± 1,5° ausgerichtet. Während dies <10% Abweichung vom beabsichtigten Winkel von 20° entspricht, betrugen die Variationskoeffizienten (COV) des Vergusswinkels über alle getesteten Proben hinweg 7,6% bzw. 6,5% für männliche und weibliche Mäuse (n = 10 pro Gruppe), wie durch planare Röntgenaufnahmen vor dem Test verifiziert wurde (Abbildung 5). Darüber hinaus sollten die Röntgenaufnahmen nach dem Test verwendet werden, um den Modus zu beurteilen, in dem die Proben versagt haben. In den Oberschenkelhälsen wurde wie beabsichtigt konsequent ein Versagen in einer gegabelten Weise beobachtet, wobei eine Frakturlinie parallel zum Oberschenkelschaft und die andere Linie senkrecht zum Oberschenkelhals verlief (Abbildung 6). Wenn signifikante Variationen im Bruchmuster zwischen den Proben auftreten würden, könnte die Knochenqualität der Proben über μCT weiter beurteilt werden, indem Ergebnisse wie volumetrische Knochenmineraldichte, trabekuläre und kortikale Dicke, Abstand und Mineralisierung gemessen werden. Wenn das Versagen im Oberschenkelhals nicht konsequent induziert wird, können die 3D-gedruckten Führungen angepasst werden.

Die hierin berichteten biomechanischen Ergebnismessungen stimmen mit den Werten überein^, die in ähnlichen axialen Biegungen der Femurhalskonfigurationen7,8,9,10,11,12,13,14 berichtet werden. Die konsistente Ausrichtung, die mit den 3D-gedruckten Führungen erreicht wurde, verbesserte jedoch in der Regel insbesondere den COV der Maximallast (Tabelle 1).

Aktuelle Studie	Sex	Mittelwellenwinkel	Max. Last	Steifigkeit	Arbeiten bis zum Scheitern
	Männlich	8%	10%	20%	24%
	Weiblich	7%	9%	35%	38%
Jämsä et al10	Männlich	NR	22%	NR	NR
Jämsä et al8	Männlich	NR	19%	NR	NR
Kamal et al9	Weiblich	NR	16%-25%	11%-28%	NR
Middleton et al7	Weiblich	NR	24%-27%	NR	NR
Brent et al.11	Weibchen - Ratten	NR	18%-24%	NR	NR
Bromer et al.12*	Weiblich	NR	11%-27%	NR	NR
Vegger et al13*	Weiblich	NR	16%-32%	NR	NR
Lodberg14*	Weiblich	NR	11%-45%	NR	NR
NR: Nicht gemeldet
*: Daten extrapoliert aus veröffentlichten Zahlen

Tabelle 1: Variationskoeffizienten für die gemessenen Biegeeigenschaften von Oberschenkelhälsen der Maus. Die Variationskoeffizienten stellen ein Verhältnis von Standardabweichung und Mittelwert eines Datensatzes dar. Wenn der COV abnimmt, deutet dies auf eine engere Gruppierung der einzelnen Datenpunkte um den Mittelwert hin. Dieses Protokoll verringerte den COV für maximale Belastung im Vergleich zu anderen Publikationen, die ähnliche Tests durchführten.

Erwartungsgemäß wurden Geschlechtsunterschiede bei den gemessenen mechanischen Eigenschaften beobachtet. Statistische Analysen wurden mit einem einseitigen ungepaarten t-Test durchgeführt. Oberschenkelhälse von männlichen Mäusen waren signifikant stärker und steifer als Proben von weiblichen Mäusen (p = 0,009 bzw. p = 0,0006). Darüber hinaus erfuhren die weiblichen Oberschenkelhälse signifikantere Deformationen (p = 0,014) und arbeiteten bis zum Versagen (p = 0,024) im Vergleich zu Proben von männlichen Mäusen (Abbildung 7). Dies steht im Einklang mit der geringeren Knochenmineraldichte bei Frauen und unterstreicht die Sensitivität des Tests, physiologisch relevante Unterschiede zu erkennen. In den männlichen und weiblichen Mäusekohorten, die in dieser Studie verwendet wurden, war die Knochenmineraldichte der weiblichen Mäuse signifikant niedriger als bei ihren männlichen Gegenstücken, wie durch einen Dual-Energy-Röntgenabsorptiometrie-Scan (DEXA) und einen einseitigen ungepaarten t-Test (p = 0,036) bestimmt wurde.

Abbildung 7: Biomechanische Ergebnisse. (A) Eine repräsentative Kraft-Weg-Kurve mit einer linearen Anpassung von 0,2 % wird verwendet, um die Steifigkeit und den Streckgrenze abzuleiten. Ausgewählte Ergebnismaße werden streudiagrammiert und zeigen Mittelwert und Standardabweichung an, einschließlich (B) maximaler Last (bei Ausfall), (C) Steifigkeit, (D) maximaler Verschiebung (bei Ausfall) und (E) Arbeit bis zum Versagen (Bereich unter der Kurve bis zum Fehlerpunkt). Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede hin, die mit einem einseitigen ungepaarten t-Test bestimmt wurden (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 pro Geschlechtskohorte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um zu bestätigen, dass die leichten Variationen des Vergusswinkels nicht zur experimentellen Variabilität beitrugen, wurde jedes biomechanische Ergebnismaß gegen den Vergusswinkel aufgetragen und eine einfache lineare Regression für die männliche Kohorte, die weibliche Kohorte und alle Zusammengruppen durchgeführt (Abbildung 8). Anschließend wurde die Hypothese getestet, dass die lineare Regressionssteigung nicht Null ist. Die Regressionsanalyse zeigte, dass bis auf die Steifigkeit die leichten Variationen des Vergusswinkels (Bereich 18° bis 24°) die biomechanischen Outcome-Messgrößen nicht beeinflussten. Für die Steifigkeit gab es eine signifikante lineare Korrelation mit dem Vergusswinkel (^R2 = 0,29, p < 0,05).

Abbildung 8: Einfluss des Vergusswinkels auf biomechanische Ergebnisse. Biomechanische Ergebnismessungen, einschließlich (A) maximaler Belastung, (B) Steifigkeit, (C) maximaler Verschiebung und (D) Arbeit bis zum Versagen, wurden gegen den Vergusswinkel aufgetragen und unter Verwendung einer einfachen linearen Regression für die männliche Kohorte, die weibliche Kohorte und alle zusammen gruppierten Proben korreliert. Durchgezogene schwarze Linien zeigen eine lineare Regression gruppierter Stichproben, wobei gepunktete Linien Konfidenzintervalle anzeigen. Die Variabilität des Vergusswinkels hatte keinen signifikanten Einfluss auf die maximale Belastung, die maximale Verschiebung oder die Ausfallarbeit. Als jedoch der Vergusswinkel zunahm, nahm die Steifigkeit zu, wie durch einen Pearson-Test bestimmt (p = 0,0126, n = 20). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Standard Triangle Language (. STL) Datei der Leitfäden. Diese Datei kann verwendet werden, um die im Protokoll beschriebenen Anleitungen zu drucken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen zuverlässigen Cantilever-Biegetest für murine Oberschenkelhälse. Das natürliche Cantilever-Biegeszenario, das am Oberschenkelhals auftritt, wird in standardisierten 3- und 4-Punkt-Biegetests typischerweise nicht ^dargestellt5. Diese Testmethode ist besser und repliziert zuverlässiger die Art von Oberschenkelhalsfrakturen, die bei Knochenbrüchigkeitspatienten auftreten. Das Hauptaugenmerk bei der Durchführung dieses Protokolls liegt auf der Beseitigung der Variabilität aufgrund eines inkonsistenten Vergießens des Femurschafts. Die genaue Einhaltung der im ersten und vierten Abschnitt des Protokolls beschriebenen Schritte stellt entscheidend sicher, dass die Erstellung der Leitfäden und des Ladeprotokolls das repliziert, was in dieser Veröffentlichung berichtet wird. Wie theoretisch vorhergesagt und experimentell gezeigt werden kann, kann der Mittelwellenwinkel relativ zur Belastungsachse die Belastungen des Oberschenkelhalses und die Wahrscheinlichkeit, dass die Fraktur am Oberschenkelhals auftritt, beeinflussen. Frühere Gruppen haben gezeigt, dass der Mittelwellenwinkel die Drucksteifigkeit und -stärke des Femurs signifikant beeinflusst, wenn er durch den Hüftkopf belastet wird. Eine parametrische Analyse der Auswirkungen von Neigungswinkeln der Mittelwelle zeigte, dass die maximalen Biegemomente in den Oberschenkelwellen bei Mittelwellenwinkeln zwischen 15° und 25° ein Minimum erfahren, was auch die Wellensteifigkeit ^maximiert5. Dieser Winkel minimiert daher die Wahrscheinlichkeit von Kompressionsfrakturen im Schaft und erhöht die Wahrscheinlichkeit von Biegefrakturen im Oberschenkelhals.

Mehrere Parameter könnten die Ergebnisse eines biomechanischen Tests beeinflussen und die Fähigkeit, signifikante Unterschiede aufgrund physiologisch relevanter experimenteller Variablen zu erkennen, beeinträchtigen. Diese Variabilität wird durch die geringe Größe langer Mausknochen verstärkt. Zu den Parametern, die bei diesem Test aufmerksamkeitsbedürftig sind, gehören insbesondere die Anzahl der Gefrier-Tau-Zyklen und der Hydratationszustand des Knochens, die Belastungsrate und die Ausrichtung der Femurwelle relativ zur Belastungsachse. Das Protokoll sieht vor, dass alle Proben die gleiche Anzahl von Gefrier-Tau-Zyklen und ein 2-Stunden-Fenster für die Hydratation in PBS bei Raumtemperatur durchlaufen. Die Belastungsrate ist ebenfalls auf einen einheitlichen Wert von 0,5 mm/^s3,4 eingestellt. Darüber hinaus wurden 3D-gedruckte Führungen entwickelt, um den Femur während des Vergussschritts konsistent in einem Mittelwellenwinkel von ~ 20 ° zu positionieren. Dies führte zu konsistenten Mittenwellenwinkeln im Bereich von 18° bis 24°, ohne signifikante Geschlechtseffekte aufgrund anatomischer Unterschiede und Variationskoeffizienten von 7,6% bzw. 6,5% für männliche und weibliche Mäuse. Diese Leitfäden sind zugänglich, können leicht mit Standard-Solid-Modeling-Software modifiziert und bei Bedarf mit einem kostengünstigen Desktop-3D-Drucker reproduziert werden.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigten, dass das Testprotokoll empfindlich auf subtile physiologische Unterschiede wie Geschlecht reagiert, mit einer angemessenen Stichprobengröße von n = 10. Eine retrospektive Leistungsanalyse, die experimentell ermittelte Größeneffekte (δ = Δmean/SD) bei n = 10 berücksichtigte, ergab, dass die Leistung auf 57% für die maximale Last bei Ausfall (δ = 0,8), >95% für die Steifigkeit (δ = 1,77) und die maximale Verschiebung (δ = 1,9) bzw. 83% für die Arbeit bis zum Ausfall (δ = 1,77) geschätzt wurde. Zusammen mit den geringen Variationskoeffizienten (Tabelle 1) bestätigt diese Leistungsanalyse, dass die Variation des Vergusswinkels die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Protokolls negativ beeinflusst hat.

Die subjektive Analyse der Art des Versagens zeigte auch, dass 100% der untersuchten Proben im Oberschenkelhals versagten, da alle eine gegabelte Fraktur zeigten, wobei eine Frakturlinie parallel zum Schaft an der Stelle verlief, an der sie auf den Hals trifft, und eine weitere Frakturlinie senkrecht zum Oberschenkelhals an der Spitze der Bifurkation. Dies umfasst Merkmale aus zwei klinisch relevanten Modi von Oberschenkelhalsfrakturen; die intertrochanteren und transzervikalen ^{Halsfrakturen15}. Femurhals-Cantilever-Biegetests werden in der Literatur nicht so häufig verwendet und beschrieben wie Standard-Torsions- oder Biegetests von Femur- und Tibiamittelwellen bei Nagetiermodellen der Osteoporose. Nur eine Handvoll Studien wurden identifiziert, um solche Protokolle unter Verwendung von Maus- und Rattenmodellen zu beschreiben5,7,8,9,16,17. Der Winkel, in dem die Oberschenkelknochen während des Tests positioniert wurden, wird nicht immer angegeben. Einige mit detaillierten Beschreibungen verwenden eine übermäßige Menge an benutzerdefinierten Vorrichtungen und Software, um ihre Proben ^{auszurichten5} greifen aber immer noch auf das Vergießen von Hand zurück, was den gleichen menschlichen Fehler in anderen Protokollen einführt.

Dieses Protokoll ist für Murinenproben konzipiert und für C57Bl/6-Mäuse spezifiziert, könnte aber leicht an große Tiermodelle oder andere murine Stämme mit unterschiedlicher Femurgeometrie angepasst werden. Zukünftige Forscher, die dieses Protokoll verwenden, müssen möglicherweise die Menge des freiliegenden Knochens ändern, da der dritte Trochanter möglicherweise nicht genau 7 mm vom Hüftkopf entfernt ist. Zu den weiteren Modifikationen des Protokolls gehört die Verwendung eines Härters, das nach dem Testen erweicht werden kann, um die Probe freizugeben, wenn weitere Tests gewünscht werden. Dies könnte mit einer Wismutlegierung geschehen, die nach dem Test zur Freisetzung der Probe in einem heißen Wasserbad geschmolzen werden ^könnte7. Die letzte Änderung, die Benutzer an diesem Protokoll vornehmen könnten, entzieht sich in Schritt 3.1, nämlich dem Typ und der Positionierung der Wägezelle. Eine axiale Wägezelle sollte mit einer Auflösung von unter 1 N verwendet werden. Eine 50-N-Wägezelle wäre auf der Grundlage der beobachteten Maximallasten geeignet. Darüber hinaus sollte eine Wägezelle, die nur die Spannung oder Kompression misst, verwendet werden, um ein compoundierendes Biegemoment zu vermeiden, das die Wägezelle durch exzentrische Belastung relativ zur Wägezelle erfahren kann. Eine andere Möglichkeit, zusammengesetzte Kraftmessungen zu vermeiden, besteht darin, die Wägezelle am Aktuator zu befestigen, um sicherzustellen, dass die Belastungskraft mit der Wägezelle übereinstimmt.

Dieses Protokoll vereinfacht den Bedarf an kundenspezifischen Vorrichtungen, beschreibt, wie Leitfäden auf jedem handelsüblichen 3D-Drucker gedruckt werden können, und verwendet gängige Laborgeräte, um Proben gründlich und reproduzierbar zu testen, wie die in der aktuellen Studie berichteten niedrigeren Variationskoeffizienten zeigen (Tabelle 1). Dieses Protokoll ist jedoch nicht durch die Notwendigkeit eines 3D-Druckers eingeschränkt. Es gibt kommerziell erhältliche Lösungen, bei denen die 3D-Rendering-Dateien an Druckereien gesendet und die Teile zurückgeschickt werden können. Darüber hinaus simuliert diese Art der Biegebelastung des Oberschenkelhalses den Ort und die Art der klinisch angetroffenen Frakturen. Mit der Anzahl der Menschen mit hohem Risiko für Fragilitätsfrakturen wird prognostiziert, dass es bis 205018 jedes Jahr mehr als 21,3 Millionen Hüftfrakturen geben wird. Die immense gesellschaftliche, finanzielle und medizinische Belastung, die dies darstellt, zuverlässige Tests in Nagetiermodellen können die Strenge und Reproduzierbarkeit der Forschung verbessern, die darauf abzielt, die Ätiologie der Osteoporose und Therapeutika zu verstehen, um sie effektiv zu behandeln.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.