Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של פלטפורמת בדיקה לשחזור עבור צוואר הירך מורין במערך כיפוף cantilever. קווי עזר מודפסים תלת-ממדיים מותאמים אישית שימשו לתיקון עקבי וקשיח של עצמות הירך ביישור אופטימלי.
Abstract
שברים בצוואר הירך הם תופעה שכיחה אצל אנשים עם אוסטאופורוזיס. מודלים רבים של עכבר פותחו כדי להעריך מצבי מחלות וטיפולים, עם בדיקות ביומכניות כמדד התוצאה העיקרי. עם זאת, בדיקות ביומכניות מסורתיות מתמקדות בבדיקות פיתול או כיפוף המוחלות על אמצע השלושה של העצמות הארוכות. זה בדרך כלל לא האתר של שברים בסיכון גבוה אצל אנשים אוסטאופורוטיקה. לכן, פותח פרוטוקול בדיקה ביומכנית הבודק את צוואר הירך של עצמות הירך בעומס כיפוף cantilever כדי לשכפל טוב יותר את סוגי השברים שחווים חולי אוסטאופורוזיס. מכיוון שהתוצאות הביומכניות תלויות מאוד בכיוון הטעינה הפלקסורלית ביחס לצוואר הירך, נוצרו מדריכים מודפסים תלת-ממדיים לשמירה על פיר הירך בזווית של 20° ביחס לכיוון הטעינה. הפרוטוקול החדש ייעל את הבדיקה על ידי הפחתת השונות ביישור (21.6° ± 1.5°, COV = 7.1%, n = 20) ושיפור יכולת הרבייה בתוצאות הביומכניות הנמדדות (COV ממוצע = 26.7%). הגישה החדשה באמצעות קווי עזר מודפסים 3D עבור יישור דגימה אמין משפר את הקפדה ושחזור על ידי הפחתת שגיאות המדידה עקב אי התאמה דגימה, אשר אמור למזער את גודל המדגם במחקרי עכבר של אוסטאופורוזיס.
Introduction
סיכון לשבר הוא דאגה רפואית חמורה הקשורה לאוסטאופורוזיס. מעל 1.5 מיליון שברים שבירים מדווחים מדי שנה בארצות הברית לבדה, עם שברים המתרחשים בירך, במיוחד הצוואר הירך, כמו סוג השבר המוביל1. ההערכה היא כי 18% מהנשים ו -6% מהגברים יחוו שבר בצוואר הירך במהלך חייהם2, ושיעור התמותה בשנה אחת לאחר השבר גדול מ -20%1. לכן, מודלים עכבר המאפשרים בדיקה ביומכנית של צוואר הירך יכול להיות מתאים לחקר שברים שבירים. מודלים של עכברים מציעים גם כלים רבי עוצמה כדי להבהיר אירועים תאיים ומולקולריים הניתנים לתרגום המעורבים באוסטאופורוזיס באופן פוטנציאלי. הסיבה לכך היא הזמינות של כתבים גנטיים, רווח ואובדן של מודלים פונקציה, ואת הספרייה הרחבה של טכניקות מולקולריות ריאגנטים. בדיקה מכנית של עצמות עכבר יכולה לספק את אמצעי התוצאה הדרושים כדי לקבוע את בריאות העצם, וריאציות גנוטיפיות ופנוטיפיות שיכולות להסביר את האטיולוגיה של המחלה, ולהעריך טיפולים המבוססים על מדדי תוצאה של איכות העצם ואת הסיכון לשבר3.
האנטומיה של צוואר הירך יוצרת תרחישי טעינה מכניים ייחודיים, אשר בדרך כלל להוביל שברים גמישים (כיפוף). ראש הירך נטען בשקע האצטבולרי בקצה הפרוקסימלי של עצם הירך. זה יוצר תרחיש כיפוף cantilever על צוואר הירך, אשר מחובר בקשיחות לפיר הירך distally4. זה שונה מבדיקות כיפוף מסורתיות של 3 או 4 נקודות על עצם הירך באמצע הדיאפיאזיס. בעוד בדיקות אלה מועילות, הם אינם משכפלים את הטעינה שמובילה בדרך כלל לשברים שבריריים אצל אנשים אוסטאופניים ואוסטאופורוטיקה במונחים של מיקום השבר או תרחיש הטעינה.
כדי להעריך טוב יותר את הסיכון לשבר שברירי בעכברים, הוא ביקש לשפר את יכולת הרבייה של בדיקות כיפוף cantilever של צוואר הירך מורין. כפי שחזינו תיאורטית, זווית הטעינה על ראש הירך ביחס לפיר הירך הוכח להשפיע באופן משמעותי על מדדי התוצאה5, ובכך ליצור אתגר לאמינות ושחזור של התוצאות שדווחו. כדי להבטיח יישור נכון ועקבי של עצמות הירך במהלך הכנת הדגימה, מדריכים תוכננו, והודפסו בתלת-ממד בהתבסס על מדידות אנטומיות שנעשו על סריקות μCT של עצם הירך של C57BL/6 עכבר. המדריכים נועדו לסייע בעקביות עציצים את הדגימות, כך פיר הירך נשמר ב ~ 20 ° מכיוון הטעינה האנכית. זווית זו נבחרה מכיוון שהיא ממקסמת את הנוקשות תוך מזעור רגע הכיפוף המקסימלי לאורך פיר הירך, מה שמגביר את הסבירות לשברים בצוואר הירך ומוביל לבדיקות עקביות יותר הניתנות לשחזור5. המדריכים הודפסו בתלת-ממד בגדלים שונים כדי להתאים להבדלים אנטומיים בין דגימות ושימשו להחזקת דגימות במצב יציב תוך כדי עציצים במלט עצם אקרילי. הנוקשות, הכוח המרבי, כוח התשואה והאנרגיה המקסימלית חושבו מהגרפים של תזוזת הכוח. שיטת בדיקה זו הראתה תוצאות עקביות לתוצאה הביומכנית הנ"ל. בעזרת התרגול ובסיוע המדריך המודפס בתלת-ממד, ניתן למזער שגיאות מדידה עקב אי-התאמה, וכתוצאה מכך ניתן למזער את מדדי התוצאה האמינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת משאבי בעלי החיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. העכברים ששימשו במחקר זה היו C57BL/6 זכרים ונקבות החל מגיל 24-29 שבועות. עכברים שוכנו בתנאים סטנדרטיים עם מזון ומים עד ליביטום. עם המתת חסד באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, ואחריו נקע צוואר הרחם, 20 עצמות ירך ימניות (10 זכרים ו -10 נקבות) נקצרים והוקפאו ב -20 מעלות צלזיוס עד לבדיקה.
1. יצירת מדריכי הרכבה מודפסים בתלת-ממד מותאמים אישית
הערה: ייתכן שיהיה צורך בשלב זה מכיוון שלזנים שונים ולפנוטיפים גנטיים עשויים להיות גיאומטריות אנטומיות שונות.
- להשיג סריקות μCT של הדגימות הייצוגיות.
- סרוק דוגמאות מייצגות בסורק μCT עם ההגדרות הבאות: 55 kV, 145 μA עבור זמני אינטגרציה של 300 אלפיות השנייה, ורזולוציה של 10.5 מיקרומטר ווקסלים.
- ודא שהאזור שנתפס מכסה את הקצה הפרוקסימלי של עצם הירך וממשיך למטה דרך האמצע.
הערה: אם סורק μCT אינו זמין, ניתן להשתמש בצילומי רנטגן דו-ממדיים של הדגימות הייצוגיות.
- לנתח את סריקות μCT.
- באמצעות הקבוצה הייצוגית של סריקות μCT, לקבל עיבוד 2D של התצוגה הקדמית של עצם הירך הפרוקסימלית.
- להשיג תמונות μCT עם רזולוציה של 10.5 מיקרומטר voxels מן midshaft לקצה הפרוקסימלי של עצם הירך. בצעו קומפילציה של פרוסות אלה באמצעות תוכנה (ראו טבלת חומרים) לעיבוד תלת-ממדי של הדגימה.
- קבעו סף כדי להבחין בין העצם לבין הרקמה שמסביב והחלו מסנן גאוסיאן להפחתת רעשים.
- כוונו את העיבודים התלת-ממדיים כדי למנוע הטיה מחוץ לציר וודאו שמשטח הירך הקדמי של עצם הירך מוצג.
- יצא תצוגה דו-ממדית זו של העיבוד התלת-ממדי כקובץ תמונה, כגון .jpg או .png.
- באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים), למדוד את זווית פיר הירך על ידי ציור קו מאונך לפיר הירך 7 מ"מ distally וקו שני דרך השיא של trochanter גדול יותר עד לנקודת האמצע של הקו הניצב הנ"ל (איור 1).
- לאורך קו הניצב הדיסטלי 7 מ"מ, למדוד את קוטר פיר הירך מתחת trochanter השלישי.
- באמצעות הקבוצה הייצוגית של סריקות μCT, לקבל עיבוד 2D של התצוגה הקדמית של עצם הירך הפרוקסימלית.
איור 1: ניתוח μCT. תמונות μCT של עצם הירך של עכברי C57Bl/6 משמשות לחישוב זווית הפיר הממוצעת, הנמדדת מראש הטרוצ'נטר הגדול יותר דרך מרכז האמצע, ~ 7 מ"מ מזקק. קוטר האמצע נמדד גם במצב זה. העיבודים התלת-ממדיים של עצם הירך הפרוקסימלית היו מכוונים בתצוגה קדמית כדי להציג את הפרופיל של הטרוכנטר השלישי. זווית הפיר הממוצעת הייתה 93.13° (SD = 1.19°), והקוטר הממוצע של midshaft היה 1.53 מ"מ (SD = 0.14 מ"מ) (n = 20). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- צרו את קווי העזר להרכבה באמצעות תוכנת מידול תלת-ממדית (ראו טבלת חומרים) (איור 2, קובץ משלים 1).
הערה: קווי העזר הם קובואידים מלבניים בגודל 6.25 מ"מ x 3.25 מ"מ x 7 מ"מ עם חריץ זוויתי, מעט גדול יותר מקוטר הפיר הממוצע שנקבע בשלב 1.1.2. זווית החריץ תיצור זווית עקבית של 20° אנכית. קווי העזר צריכים להיות עקביים באורך, בגובה וברוחב, אך ניתן לעשות זאת עם קטרי חריץ שונים כדי להכיל הבדלים אנטומיים בין דגימות העצם.
איור 2: עיצוב קווי העזר. (A) סקיצה תלת-ממדית ו-(ב) תצוגה חזותית של גוף הדיג באמצע-צורה לפני הדפסה בתלת-ממד. בהתבסס על ספרות קודמת, זווית בינונית בין 20° ממקסמת את הנוקשות. זה ממזער את רגע הכיפוף המקסימלי בפיר הירך כדי להבטיח שברים להתרחש בצוואר ושונות בתוצאות מכניות5. כדי לפצות על הסטייה של 3.13° מהניצב בזוויות הממוצעות של אמצע ההדבקה, זווית האבזור נקבעה ל- 73.13° כדי לייצר זווית של 20°. גופי יישור הודפסו בקטרים הנעים בין 1.9-2.2 מ"מ כדי להבטיח התאמה נאותה לקטטרים בינוניים משתנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את קווי העזר. המדריכים יכולים להישאר פועלים במהלך תהליך הבדיקה, כך שהדפסת שכפולים מרובים של המדריכים יכולה להועיל להכנת דגימות מרובות בבת אחת.
2. הכנה לדוגמה
- לקצור את עצמות הירך של העכבר על ידי ביצוע חתך רוחבי לחלוטין סביב בטן העכבר והסרת הרקמה מהחתך לקרסוליים. לאחר מכן, לאתר את שקע הירך בזהירות להשתמש בקצה של זוג מלקחיים עדינים כדי לפרוק את הירך. חותכים את הרקמה הרכה הנוספת כדי להסיר את הרגל מהעכבר.
- לאחר שהרגל נקטפת, השתמש באזמל כדי לפרוק ולחתוך דרך מפרק הברך. יש לנקות ידנית את עצם הירך של כל הרקמות הרכות באמצעות מלקחיים, אזמלים ומגבות נייר.
- בדוק את הדגימות שנקטפו באופן מיידי או לאחסן אותם ב -20 °C (6 °F) עד 6 חודשים. אם הדגימות קפואות, אפשרו להם להגיע לטמפרטורת החדר ולהעניק לחות ב-PBS למשך 2 שעות לפני ההכנה.
- שימוש בצינורות אלומיניום מרובעים בגודל 1/4 אינץ' x 1/4 אינץ' (ראו טבלת חומרים), חותכים את מקטעי הצינורות באורך 1/2 אינץ' עד 1 אינץ'. באמצעות כלי תחריט, סמן כל מקטע אלומיניום במזהי הדגימה.
- מלאו מחצית מקטעי הצינורות במרק. מניחים את מקטעי הצינורות האלה במתקן כדי להחזיק אותם זקופים.
- מניחים את עצמות הירך המנוקות בקווי העזר המודפסים בתלת-ממד. לשם כך, הניחו את הדגימות שטוחות על הספסל כך שהמשטח הקדמי פונה כלפי מעלה. מקם את המדריך ישירות מתחת לטרוכנטר השלישי, שם קוטר הפיר הופך עקבי יותר.
הערה: זה ישאיר ~ 7 מ"מ של עצם הירך הפרוקסימלית מעל המדריך. - כדי למנוע מעצם הירך להסתובב לצד הצדדי או המדיאלי תוך כדי הצבה על המדריך, החזק את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים ביד אחת בעת החלת המדריכים, לחץ בחוזקה על עצם הירך על שולחן העבודה והשתמש ביד השנייה, הנח את המדריך המודפס התלת-ממדי על אמצע עצם הירך. הקפד ליישם את מדריך הקוטר המתאים בעדינות, כמו midshaft של עצם הירך יכול להישבר אם נאלץ לתוך מדריך קטן מדי.
- ברגע שהמדריכים על עצם הירך, הניחו אותם מול מקטעי האלומיניום המתאימים. באמצעות מלט עצם או חומרים התקשות אחרים, למלא את מקטעי האלומיניום עד רק מלא, משאיר קצת מקום לעקירה.
- מניחים את עצמות הירך עם מדריכים על במגזר האלומיניום הנכון.
הערה: המדריכים לא יהיו מרוכזים על מקטעי האלומיניום, יושבים מעט בצד אחד כדי לאפשר את הקצה הדיסטלי של עצם הירך לשבת במרכז סיר האלומיניום. - אפשר לסוכן הקשוח להגדיר. לאחר ההגדרה, הניחו את הדגימות בצלחת פטרי עם תמיסת מלח עם אגירת פוספט בטמפרטורת החדר (PBS) ואפשרו להתייבשות למשך 2 שעות (איור 3).
איור 3: הכנה לדוגמה באמצעות פאזלים מותאמים אישית ואביזרי דיג. (A) דגימות בסירי אלומיניום עם היישור הנכון נשמרות באמצעות קווי עזר מודפסים 3D בזמן מלט העצם מתייבש. (B) צילום רנטגן לפני הבדיקה מראה את הצל של גופי הדיג וכיסוי מלא של מלט עצם המקיף את הקצה הדיסטלי של עצם הירך. האזור הלבן הרווי בתחתית סירי האלומיניום הוא מרק, המשמש לשמירה על מלט עצם בסירים בעת התקשות. סרגל קנה מידה (לוח B) = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. הגדרת חומרה
- באמצעות מערכת בדיקה מכנית (MTS), חבר וכייל תא עומס ברזולוציה <1 N (ראו טבלת חומרים) (איור 4A).
הערה: ניתן לטעון את תא העומס על הבמה או, רצוי, את המפעיל במידת האפשר. - חבר גוף עם חריץ מרובע שיחזיק בחוזקה את מקטעי האלומיניום עם הדגימות. חבר ברגים קבועים לשני צידי מתקן ההחזקה כדי להחזיק בחוזקה דגימות במקום. (איור 4ב).
הערה: מתקן זה יכול להיות מודפס בתלת-ממד או במכונה ולאחר מכן להקיש עליו עם חורי בורג משורשרים כדי לעלות למסגרת הבדיקה. - חבר צלחת טעינה למפעיל. זה יכול להיות פשוט בורג מחודד עם קצה שטוח (איור 4C).
- הנח סטריאומיקרוסקופ על שולחן או משטח ישירות מול ה- MTS. אם יש צורך בתאורה נוספת כדי לראות את ההגדרה דרך המיקרוסקופ, מקם אותם סביב המערכת.
איור 4: הגדרת חומרה. (A) הגדרת בדיקות במערכת הבדיקות המכניות, עם תא עומס של 1 kN (רזולוציה < 1 N) ושלב דו-שנתי שחור כדי להבטיח מיקום מדגם תקין. (B) תקריב של גוף ההרכבה המודפס בתלת-ממד המחובר לתא העומס עם מוט השחלה M10 ושני ברגי M4 המשמשים להחזקת סיר האלומיניום במקומו. (ג) הצג את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם גוף טעינה מחודד. סרגל קנה מידה (לוח C) = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
4. הגדרת תוכנה
- בתוכנת MTS, התחל ביצירת פרוטוקול flexural (כיפוף) חדש. ודא שהפרוטוקול יפעל בבקרת תזוזה.
- הגדר את קצב הטעינה של הפרוטוקול ל- 0.5 מ"מ/ש'.
- אם התוכנה כוללת הגדרה עבור מקשים רכים, הוסף את המקשים הרכים "איזון" ו "אפס הרחבה" לפרוטוקול.
הערה: פעולה זו תגדיר במהירות את מיקום העומס והמפעיל ל- 0 לפני בדיקת כל דגימה. - ודא שהתוכנה תתעד את הזמן בשניות, תטען בניוטון ותרחיב או תזוזה במילימטרים בקצב דגימה מינימלי של 100 הרץ.
- שמור את הפרוטוקול החדש וחזור למסך הראשי של התוכנה כדי להתחיל בבדיקת ערכת מדגמים חדשה.
5. הגדרת בדיקה
- לפני הרכבת הדגימות על MTS, לקבל תמונת רנטגן של הדגימות בסירי האלומיניום. ניתן לצלם דוגמאות מרובות בו-זמנית. ודאו שהתצוגה הקדמית של הדגימות תילכד כדי לאפשר מדידות אימות של זווית העציצים (איור 5).
איור 5. הערכה של יישור מדגם. (A) זווית הפיר מאנכי נמדדת מצילומי רנטגן דיגיטליים מישוריים. (B) זוויות פיר הירך בעציץ מייצג נע בין 18.11° ל 23.99 °, עם מקדם של וריאציה (COV) של 7.1% (n = 20). הבדלי מין עקב וריאציות אנטומיות לא היו מובהקים סטטיסטית, כפי שנקבע באמצעות מבחן t חד-זנבי לא מזווג (p < 0.05). סרגל קנה מידה (לוח A) = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- מניחים את קטע האלומיניום עם מדגם לתוך גוף ההחזקה ומהדקים ברגים מוגדרים.
- מנמיכים את לוחית ההנעה/טעינה עד שהיא נמצאת במרחק של כמה מילימטרים מראש הירך.
הערה: אין לטעון מראש את המדגם בכל כוח ולהיזהר שלא להוריד את המפעיל מהר מדי, שכן קל מאוד לפגוע בדגימות. - באמצעות סטריאומיקרוסקופ, להתאים את השלב הדו-שנתי כדי ליישר את המיקום של ראש הירך ישירות מתחת ללוח הטעינה. נעל שלב דו-אקסיאלי במקום.
- בתוכנת MTS, אפס את מיקום המפעיל ואיזון תא העומס באמצעות המקשים הרכים שנוספו בשלב 4.3.
- התחל את פרוטוקול הטעינה. תלוי כמה מקום נשאר בין צלחת הטעינה לדגימה, הבדיקה תיקח רק 10-30 שניות.
- לאחר הבדיקה, ללכוד עוד רנטגן קדמי של המדגם. זה ישמש כדי להבחין ולתעד את אופן השבר (איור 6).
איור 6: תמונת רנטגן של דגימות לאחר הבדיקה. כל הדגימות נשברו בקו דו-צדדי דרך צוואר הירך ולאורך חיבור פיר הירך הירך (מודגש על ידי העיגול הכתום). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
6. ניתוח נתונים
- לאחר איסוף נתונים, ייצוא נתוני כוח ועקירה לתוכנה (ראה טבלת חומרים) המאפשרת גרפים וחישובים מתמטיים.
- התווה את העומס לעומת. תזוזה לכל דגימה (איור 7A). התאם קירוב ליניארי למקטע הליניארי של עקומת תזוזת העומס. השיפוע של התאמה ליניארית זו יגדיר את הנוקשות, מידה של גמישות המדגם.
- חשב את התוצאות הנוספות כגון עומס מרבי, תזוזה מרבית, עומס תשואה, תזוזה בנקודת התשואה, אנרגיה לעומס מרבי ואנרגיה לנקודת תשואה.
הערה: ניתן לקבוע את נקודת התשואה על-ידי ביטול ההגדרה של הקירוב הליניארי שנקבע בשלב 6.2 על-ידי 0.2%6. הנקודה שבה הקו הלא מוגדר והעומס לעומת. עקומת ההעתקה מצטלבת תקבע את נקודת התשואה. במקרה של דגימות שבירות מאוד המציגות תשואה מועטה, נקודת התשואה עשויה להיות זהה לנקודה המרבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר עציצים בעזרת המדריך, פירי הירך היו מיושרים ב 21.6 ° ± 1.5 °. בעוד שזה מייצג סטייה של <10% מהזווית המיועדת של 20°, מקדמי הווריאציה (COV) של זווית החיתוך על פני כל הדגימות שנבדקו היו 7.6% ו-6.5% לעכברים זכרים ונקבות, בהתאמה (n = 10 לכל קבוצה) כפי שאומתו על ידי צילומי רנטגן מישוריים טרום בדיקה (איור 5). בנוסף, יש להשתמש בצילומי הרנטגן שלאחר הבדיקה כדי להעריך את המצב שבו הדגימות נכשלו. הכישלון נצפה בעקביות בצווארי הירך, כמתוכנן, באופן דו-צדדי, עם קו שבר אחד במקביל לפיר הירך והקו השני מאונך לצוואר הירך (איור 6). אם שינויים משמעותיים היו מתרחשים בתבנית השבירה בין דגימות, אז איכות העצם של דגימות ניתן להעריך עוד יותר באמצעות μCT על ידי מדידת תוצאות כגון צפיפות מינרל העצם נפחית, עובי trabecular ו קליפת המוח, ריווח, מינרליזציה. אם הכישלון אינו מושרה באופן עקבי בצוואר הירך, קווי היישור המודפסים בתלת-ממד עשויים להיות מותאמים.
מדדי התוצאה הביומכנית המדווחים במסמך זה עולים בקנה אחד עם ערכים שדווחו בכיפוף צירי דומה של תצורות צוואר הירך7,8,9,10,11,11,12,13,14. עם זאת, היישור העקבי שהושג באמצעות קווי היישור המודפסים בתלת-ממד שיפר בדרך כלל את ה- COV של העומס המרבי בפרט (טבלה 1).
| המחקר הנוכחי | מין | זווית אמצע-רגל | עומס מרבי | נוקשות | עבודה עד לכישלון |
| זכר | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| נקבה | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | זכר | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | זכר | NR | 19% | NR | NR |
| כמאל ואח' 9 | נקבה | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| מידלטון ואח' 7 | נקבה | NR | 24%-27% | NR | NR |
| ברנט ואח' 11 | נקבה - חולדות | NR | 18%-24% | NR | NR |
| ברומר ואח' al12* | נקבה | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | נקבה | NR | 16%-32% | NR | NR |
| לודברג14* | נקבה | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: לא דווח | |||||
| *: נתונים המשוערים מנתונים שפורסמו | |||||
טבלה 1: מקדמי וריאציה למאפיינים גמישים מדודים של צוואר הירך של העכבר. מקדמי הווריאציה מייצגים יחס של סטיית התקן והממוצע של ערכת נתונים. כאשר COV יורד, הדבר מצביע על קיבוץ הדוק יותר של נקודות הנתונים הבודדות סביב הממוצע. פרוטוקול זה הפחית COV לעומס מרבי בהשוואה לפרסומים אחרים המבצעים בדיקות דומות.
כצפוי, הבדלי מין נצפו בתכונות המכניות הנמדדות. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן t חד-זנבי לא מזווג. צווארי הירך מעכברים זכרים היו חזקים ונוקשים משמעותית מדגימות מעכברים נקבות (p = 0.009 ו- p = 0.0006, בהתאמה). בנוסף, צוואר הירך הנשי חווה עיוותים משמעותיים יותר (p = 0.014) ועבד לכישלון (p = 0.024) בהשוואה לדגימות מעכברים זכרים (איור 7). זה עולה בקנה אחד עם צפיפות מינרלים עצם נמוכה יותר אצל נקבות ומדגיש את הרגישות של הבדיקה כדי לזהות הבדלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. בקבוצת העכברים הזכרים והנקבות ששימשו במחקר זה, צפיפות המינרלים של עצם העכברים הנשיים הייתה נמוכה משמעותית מעמיתיהם הזכרים, כפי שנקבע על ידי סריקת ספיגת קרני רנטגן בעלת אנרגיה כפולה (DEXA) ובדיקת t חד-זנבית לא מזווגת (p = 0.036).
איור 7: תוצאות ביומכניות. (א) עקומת תזוזת כוח מייצגת, המציגה התאמה ליניארית מקוזזת של 0.2%, משמשת להפקת הנוקשות ונקודת התשואה. מדדי התוצאה שנבחרו הם פיזור המותווה המציג ממוצע וסטיית תקן, כולל (B) עומס מרבי (בכשל), (ג) קשיחות, (D) תזוזה מרבית (בכשל) ו- (ה) עבודה לכשל (שטח מתחת לעקומה עד לנקודת הכשל). כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים שנקבעו באמצעות מבחן t חד-זנבי לא מזווג (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n = 10 לכל קבוצת סקס). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כדי לוודא שהשינויים הקלים בזווית ההטבעה לא תרמו לשונות הניסיונית, כל מדד תוצאה ביומכנית שורטם כנגד זווית הסירים וביצע רגרסיה ליניארית פשוטה עבור קבוצת הגברים, קבוצת הנקבות וכל הדגימות המקובצות יחד (איור 8). לאחר מכן נבדקה ההשערה כי שיפוע הרגרסיה הליניארי אינו אפס. ניתוח הרגרסיה הראה כי למעט הנוקשות, הווריאציות הקלות בזווית הסירים (טווח של 18° עד 24°) לא השפיעו על מדדי התוצאה הביומכנית. עבור קשיחות, היה מתאם ליניארי משמעותי עם זווית הסיר (R2 = 0.29, p < 0.05).
איור 8: השפעת זווית העציצים על התוצאות הביומכניות. מדדי תוצאה ביומכניים, כולל (A) עומס מרבי, (B) נוקשות, (C) תזוזה מקסימלית ו-(D) עבודה לכישלון שורטטו כנגד זווית העציצים והתאמו באמצעות רגרסיה ליניארית פשוטה עבור הקבוצה הגברית, קבוצת הנשים וכל הדגימות המקובצות יחד. קווים שחורים מלאים מציגים רגרסיה ליניארית של דגימות מקובצות, עם קווים מנוקדים המציינים מרווחי ביטחון. השונות בזווית העציצים לא השפיעה באופן משמעותי על העומס המרבי, ההעתקה המרבית או עבודת הכישלון. עם זאת, ככל שזווית העציץ גדלה, הנוקשות גדלה, כפי שנקבע על ידי מבחן פירסון (p = 0.0126, n = 20). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: שפת משולש סטנדרטית (. STL) קובץ של קווי העזר. ניתן להשתמש בקובץ זה כדי להדפיס את קווי העזר המתוארים בפרוטוקול. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מבחן כיפוף cantilever אמין עבור צוואר הירך מורין. תרחיש כיפוף הקניבל הטבעי המתרחש בצוואר הירך בדרך כלל אינו מיוצג במבחני כיפוף סטנדרטיים של 3 ו -4 נקודות5. שיטת בדיקה זו טובה יותר ואמינה יותר משכפלת את סוג השברים בצוואר הירך שחווים חולי שבריריות עצם. המוקד העיקרי בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא ביטול השונות עקב עציצים לא עקביים של פיר הירך. באופן קריטי, ביצוע הדוק של השלבים המתוארים בסעיפים הראשונים והרביעיים של הפרוטוקול יבטיח כי יצירת קווי העזר ופרוטוקול הטעינה ישכפלו את מה שדווח בפרסום זה. כפי שניתן לחזות באופן תיאורטי ולהראות באופן ניסיוני, זווית האמצע ביחס לציר הטעינה יכולה להשפיע על הלחצים שחווה צוואר הירך ועל ההסתברות שהשבר מתרחש בצוואר הירך. קבוצות קודמות הוכיחו כי זווית midshaft משפיעה באופן משמעותי על נוקשות דחיסה של עצם הירך וכוח כאשר נטען דרך ראש הירך. ניתוח פרמטרי של ההשפעות של זוויות נטייה midshaft הראה כי רגעי הכיפוף המקסימליים בפירי הירך חווים מינימום בזוויות midshaft בין 15° ל 25 °, אשר גם ממקסם את נוקשות פיר5. זווית זו, אם כן, ממזערת את הסבירות לשברים דחיסה בפיר ומגבירה את ההסתברות לשברים גמישים בצוואר הירך.
מספר פרמטרים יכולים להשפיע על התוצאות של כל בדיקה ביומכנית ולבלבל את היכולת לזהות הבדלים משמעותיים בשל משתנים ניסיוניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. שונות זו מורכבת על ידי גודל קטן של עצמות עכבר ארוכות. בין הפרמטרים הדורשים תשומת לב במבחן זה, בפרט, הם מספר מחזורי ההפשרה הקפאה ומצב הידרציה של העצם, קצב הטעינה, ואת היישור של פיר הירך ביחס לציר הטעינה. הפרוטוקול קובע כי כל הדגימות לעבור את אותו מספר של מחזורי הפשרה הקפאה וחלון 2 שעות הידרציה ב- PBS בטמפרטורת החדר. קצב הטעינה מוגדר גם לערך אחיד של 0.5 מ"מ / s3,4. יתר על כן, מדריכים מודפסים 3D תוכננו למקם באופן עקבי את עצם הירך בזווית בינונית של ~ 20 ° במהלך שלב העציצים. התוצאה הייתה זוויות בינוניות עקביות בטווח של 18° עד 24°, ללא השפעות מיניות משמעותיות בשל הבדלים אנטומיים ומקדמים של וריאציה של 7.6% ו -6.5% עבור עכברים זכריים ונקביים, בהתאמה. מדריכים אלה נגישים, משתנים בקלות באמצעות תוכנת מידול מוצק סטנדרטית, ומשוחזרים לפי דרישה באמצעות מדפסת תלת-ממד שולחנית זולה.
התוצאות הייצוגיות הראו כי פרוטוקול הבדיקה רגיש להבדלים פיזיולוגיים עדינים, כגון מין, עם גודל מדגם סביר של n = 10. ניתוח כוח רטרוספקטיבי החשבונאות עבור השפעות גודל שנקבעו באופן ניסיוני (δ = Δmean / SD) ב n = 10 הציע כי הכוח הוערך להיות 57% עבור העומס המרבי בכישלון (δ = 0.8), >95% עבור נוקשות (δ = 1.77) ואת ההעתקה המרבית (δ = 1.9), ו 83% עבור העבודה להיכשל (δ = 1.77), בהתאמה. יחד עם מקדמי הווריאציה הקטנים (טבלה 1), ניתוח כוח זה מאשר כי השונות בזווית העציצים השפיעה לרעה על הרגישות והאמינות של הפרוטוקול.
הניתוח הסובייקטיבי של אופן הכישלון הראה גם כי 100% מהדגימות שנבדקו נכשלו בצוואר הירך, שכן כולן הראו שבר דו-צדדי, כאשר קו שבר אחד פועל במקביל לפיר באתר הוא פוגש את הצוואר וקו שבר נוסף בניצב לצוואר הירך בשיאו של הקרע. זה מקיף תכונות משני מצבים רלוונטיים קלינית של שברים בצוואר הירך; שברי הצוואר הבין-תכליתיים והטרנסצ'נדרים15. בדיקות כיפוף צוואר הירך לא נעשה שימוש נפוץ ומתואר בספרות כמו פיתול סטנדרטי או בדיקות flexure של שריר הירך ו tibial midshafts במודלים מכרסמים של אוסטאופורוזיס. רק קומץ מחקרים זוהו כדי לתאר פרוטוקולים כאלה באמצעות מודלים של עכברים וחולדות5,7,8,9,16,17. הזווית שבה הוצבו עצמות הירך במהלך הבדיקה לא תמיד מדווחת. חלקם עם תיאורים מפורטים להשתמש בכמות מופרזת של אביזרים מותאמים אישית ותוכנה כדי ליישר את הדגימות שלהם5 אבל עדיין לפנות עציצים ביד, הצגת אותה טעות אנוש בפרוטוקולים אחרים.
פרוטוקול זה מיועד עבור דגימות מורין והוא מצוין עבור עכברי C57Bl/6 אבל יכול בקלות להיות מותאם מודלים בעלי חיים גדולים או זני מורין אחרים עם גיאומטריה הירך שונה. חוקרים עתידיים המשתמשים בפרוטוקול זה ייתכן שיהיה צורך לשנות את כמות העצם החשופה, כמו trochanter השלישי לא יכול להיות בדיוק 7 מ"מ distally מהראש הירך. שינויים נוספים בפרוטוקול כוללים שימוש בחומר התקשות שניתן לרכך לאחר הבדיקה כדי לשחרר את המדגם אם יש צורך בבדיקות נוספות. זה יכול להיעשות עם סגסוגת ביסמוט שניתן להמיס באמבט מים חמים לאחר בדיקה כדי לשחרר את המדגם7. השינוי הסופי שמשתמשים יכולים לבצע בפרוטוקול זה הוא חמק בשלב 3.1, להיות הסוג והמיצוב של תא העומס. יש להשתמש בתא עומס צירי עם רזולוציית תת 1 N. תא עומס של 50 N יהיה מתאים בהתבסס על העומסים המרביים שנצפו. יתר על כן, תא עומס המודד רק מתח או דחיסה צריך לשמש כדי למנוע כל רגע כיפוף הרכבה כי תא העומס עלול להיתקל טעינה אקסצנטרית ביחס לתא העומס. דרך נוספת להימנע מהרכבת מדידות כוח תהיה לתקן את תא העומס למפעיל כדי להבטיח שכוח הטעינה עולה בקנה אחד עם תא העומס.
פרוטוקול זה מפשט את הצורך בגופים מותאמים אישית, מתאר כיצד ניתן להדפיס מדריכים בכל מדפסת תלת-ממד הזמינה מסחרית, ומשתמש בציוד מעבדה נפוץ כדי לבדוק דגימות ביסודיות ובשחזור, כפי שהוכח על ידי מקדמי הווריאציה הנמוכים יותר שדווחו במחקר הנוכחי (טבלה 1). עם זאת, פרוטוקול זה אינו מוגבל על-ידי הצורך במדפסת תלת-ממד. קיימים פתרונות זמינים מסחרית, שבהם ניתן לשלוח את קבצי העיבוד התלת-ממדיים לחברות הדפסה, וניתן לשלוח את החלקים בחזרה. בנוסף, מצב זה של כיפוף טעינה על צוואר הירך מדמה את המיקום ואת סוגי השברים שנתקלו קלינית. עם מספר האנשים בסיכון גבוה לשברים שבריריים, צפוי כי יהיו למעלה מ -21.3 מיליון שברים בירך בכל שנה עד 205018. הנטל החברתי, הפיננסי והרפואי העצום זה מציב, בדיקות אמינות במודלים מכרסמים יכול לשפר את ההקפדה ואת הרבייה של מחקר המיועד להבנת האטיולוגיה של אוסטאופורוזיס וטיפולים לטיפול יעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי NIH P30AR069655 ו R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
