Summary
يصف هذا البروتوكول تطوير منصة اختبار قابلة للتكرار لأعناق الفخذ الفئرانية في إعداد الانحناء الكابولي. تم استخدام أدلة مطبوعة 3D مخصصة لإصلاح عظم الفخذ باستمرار وصرامة في المحاذاة المثلى.
Abstract
الكسور في عنق الفخذ هي أمر شائع الحدوث في الأفراد الذين يعانون من هشاشة العظام. تم تطوير العديد من نماذج الفئران لتقييم حالات المرض والعلاجات ، مع الاختبار الميكانيكي الحيوي كمقياس أساسي للنتائج. ومع ذلك ، تركز الاختبارات الميكانيكية الحيوية التقليدية على اختبارات الالتواء أو الانحناء المطبقة على العمود الأوسط للعظام الطويلة. هذا ليس عادة موقع الكسور عالية الخطورة في الأفراد المصابين بهشاشة العظام. لذلك ، تم تطوير بروتوكول اختبار ميكانيكي حيوي يختبر أعناق الفخذ الفخذية لعظم الفخذ في تحميل ثني الكابولي لتكرار أنواع الكسور التي يعاني منها مرضى هشاشة العظام بشكل أفضل. نظرا لأن النتائج الميكانيكية الحيوية تعتمد اعتمادا كبيرا على اتجاه التحميل الانحنائي بالنسبة إلى عنق الفخذ ، فقد تم إنشاء أدلة مطبوعة ثلاثية الأبعاد للحفاظ على عمود الفخذ بزاوية 20 درجة بالنسبة لاتجاه التحميل. قام البروتوكول الجديد بتبسيط الاختبار عن طريق تقليل التباين في المحاذاة (21.6 درجة ± 1.5 درجة ، COV = 7.1٪ ، n = 20) وتحسين قابلية التكرار في النتائج الميكانيكية الحيوية المقاسة (متوسط COV = 26.7٪). النهج الجديد باستخدام أدلة مطبوعة 3D لمحاذاة العينات الموثوقة يحسن الصرامة والتكرار عن طريق تقليل أخطاء القياس بسبب اختلال محاذاة العينات ، والتي يجب أن تقلل من أحجام العينات في دراسات الفئران لهشاشة العظام.
Introduction
خطر الكسر هو مصدر قلق طبي خطير مرتبط بهشاشة العظام. يتم الإبلاغ عن أكثر من 1.5 مليون كسر هشاشة كل عام في الولايات المتحدة وحدها ، مع حدوث كسور في الورك ، وتحديدا عنق الفخذ ، باعتباره نوع الكسر الرئيسي 1. تشير التقديرات إلى أن 18٪ من النساء و 6٪ من الرجال سيعانون من كسر عنق الفخذ في حياتهم2 ، ومعدل الوفيات في سنة واحدة بعد الكسر أكبر من 20٪ 1. لذلك ، يمكن أن تكون نماذج الفئران التي تسمح بالاختبار الميكانيكي الحيوي لعنق الفخذ مناسبة لدراسة كسور الهشاشة. توفر نماذج الفئران أيضا أدوات قوية لتوضيح الأحداث الخلوية والجزيئية القابلة للترجمة التي تنطوي عليها هشاشة العظام المحتملة. ويرجع ذلك إلى توافر المراسلين الوراثيين ، وكسب وفقدان نماذج الوظائف ، والمكتبة الواسعة للتقنيات الجزيئية والكواشف. يمكن أن يوفر الاختبار الميكانيكي لعظام الفئران تدابير النتائج اللازمة لتحديد صحة العظام والاختلافات الجينية والمظهرية التي يمكن أن تفسر مسببات المرض، وتقييم العلاجات بناء على مقاييس النتائج لجودة العظام وخطر الكسر3.
يخلق تشريح عنق الفخذ سيناريوهات تحميل ميكانيكية فريدة من نوعها ، والتي تؤدي عادة إلى كسور الانحناء (الانحناء). يتم تحميل رأس الفخذ في المقبس الحقي في الطرف القريب من عظم الفخذ. وهذا يخلق سيناريو الانحناء الكابولي على عنق الفخذ، والذي يرتبط بشكل صارم بالعمود الفخذي بشكل بعيد4. هذا يختلف عن اختبارات الانحناء التقليدية المكونة من 3 أو 4 نقاط على الحجاب الحاجز المتوسط الفخذي. في حين أن هذه الاختبارات مفيدة ، إلا أنها لا تكرر التحميل الذي يؤدي عادة إلى كسور هشاشة في الأفراد الذين يعانون من هشاشة العظام وهشاشة العظام من حيث موقع الكسر أو سيناريو التحميل.
لتقييم خطر كسر الهشاشة في الفئران بشكل أفضل ، تم السعي إلى تحسين قابلية تكرار اختبارات ثني الكابولي لأعناق الفخذ الفئران. وكما هو متوقع نظريا، فقد تبين أن زاوية التحميل على رأس الفخذ بالنسبة إلى العمود الفخذي تؤثر تأثيرا كبيرا على مقاييس النتائج5، مما يخلق تحديا لموثوقية النتائج المبلغ عنها وإمكانية تكرارها. لضمان المحاذاة المناسبة والمتسقة لعظم الفخذ أثناء إعداد العينة، تم تصميم الأدلة، وطبعت 3D على أساس القياسات التشريحية التي أجريت على مسح μCT لعظم الفخذ C57BL/6 الماوس. تم تصميم الأدلة للمساعدة في وضع العينات باستمرار بحيث يتم الحفاظ على العمود الفخذي عند ~ 20 درجة من اتجاه التحميل الرأسي. تم اختيار هذه الزاوية لأنها تزيد من الصلابة مع تقليل لحظة الانحناء القصوى على طول العمود الفخذي ، مما يزيد من احتمال حدوث كسور في عنق الفخذ ويؤدي إلى اختبار أكثر اتساقا وقابلية للتكرار5. كانت الأدلة مطبوعة 3D بأحجام مختلفة لاستيعاب الاختلافات التشريحية بين العينات وتستخدم لعقد العينات في وضع مستقر أثناء وضع الأواني في الأسمنت العظمي الأكريليك. تم حساب الصلابة والقوة القصوى وقوة الخضوع والطاقة القصوى من الرسوم البيانية لإزاحة القوة. أظهرت طريقة الاختبار هذه نتائج متسقة للنتائج الميكانيكية الحيوية المذكورة أعلاه. مع الممارسة ومساعدة الدليل المطبوع 3D ، يمكن تقليل أخطاء القياس بسبب عدم المحاذاة ، مما يؤدي إلى مقاييس نتائج موثوقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة الموارد الحيوانية بجامعة روتشستر. كانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة C57BL/6 من الذكور والإناث تتراوح أعمارهم بين 24-29 أسبوعا من العمر. تم إيواء الفئران في ظروف قياسية مع الطعام والماء ad. عند القتل الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون ، يليه خلع عنق الرحم ، تم حصاد 20 عظم الفخذ الأيمن (10 ذكور و 10 إناث) وتجميده عند -20 درجة مئوية حتى اختباره.
1. إنشاء أدلة تركيب مطبوعة 3D مخصصة
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى هذه الخطوة لأن السلالات المختلفة والأنماط الظاهرية الجينية قد يكون لها هندسة تشريحية مختلفة.
- الحصول على مسح μCT للعينات التمثيلية.
- امسح العينات التمثيلية ضوئيا على ماسح ميكروسي تي باستخدام الإعدادات التالية: 55 كيلو فولت و 145 ميكروأمبير لأوقات تكامل 300 مللي ثانية ودقة 10.5 ميكرومتر فوكسل.
- تأكد من أن المنطقة التي تم التقاطها تغطي الطرف القريب من عظم الفخذ وتستمر لأسفل من خلال العمود الأوسط.
ملاحظة: في حالة عدم توفر ماسح ميكروسي تي (μCT)، يمكن استخدام الأشعة السينية المستوية 2D للعينات التمثيلية.
- تحليل الأشعة المقطعية μCT.
- باستخدام المجموعة التمثيلية من فحوصات μCT ، احصل على عرض 2D للمنظر الأمامي لعظم الفخذ القريب.
- احصل على صور μCT بدقة 10.5 ميكرومتر فوكسل من العمود الأوسط إلى الطرف القريب من عظم الفخذ. قم بتجميع هذه الشرائح باستخدام برنامج (انظر جدول المواد) في عرض 3D للعينة.
- حدد عتبة لتمييز العظام عن الأنسجة المحيطة بها وتطبيق مرشح غاوسي للحد من الضوضاء.
- قم بتوجيه عروض 3D للقضاء على الإمالة خارج المحور والتأكد من عرض السطح الأمامي لعظم الفخذ.
- تصدير طريقة العرض 2D هذه للعرض ثلاثي الأبعاد كملف صورة، مثل .jpg أو .png.
- باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد)، قم بقياس زاوية العمود الفخذي عن طريق رسم خط عمودي على العمود الفخذي 7 مم بشكل بعيد وخط ثان عبر ذروة المبتور الأكبر إلى نقطة منتصف الخط العمودي المذكور أعلاه (الشكل 1).
- على طول الخط العمودي البعيد 7 مم ، قم بقياس قطر العمود الفخذي أسفل المدور الثالث.
- باستخدام المجموعة التمثيلية من فحوصات μCT ، احصل على عرض 2D للمنظر الأمامي لعظم الفخذ القريب.
الشكل 1: تحليل μCT. تستخدم صور μCT لعظم الفخذ لفئران C57Bl / 6 لحساب متوسط زاوية العمود ، التي تم قياسها من أعلى المدور الأكبر عبر مركز العمود الأوسط ، ~ 7 مم بشكل منفصل. تم قياس قطر العمود الأوسط أيضا في هذا الموضع. تم توجيه عروض 3D لعظم الفخذ القريب في منظر أمامي لعرض ملف تعريف المدور الثالث. كان متوسط زاوية العمود 93.13 درجة (SD = 1.19 درجة) ، وكان متوسط قطر العمود الأوسط 1.53 مم (SD = 0.14 مم) (n = 20). شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قم بإنشاء أدلة التركيب باستخدام برنامج نمذجة ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد) (الشكل 2 ، الملف التكميلي 1).
ملاحظة: الأدلة عبارة عن مكعبات مستطيلة الشكل بقياس 6.25 مم × 3.25 مم × 7 مم مع فتحة زاوية، أكبر قليلا من متوسط قطر العمود المحدد في الخطوة 1.1.2. ستخلق زاوية الفتحة زاوية ثابتة تبلغ 20 درجة من الرأسي. يجب أن تكون الأدلة متسقة في الطول والارتفاع والعرض ، ولكن يمكن صنعها بأقطار فتحات مختلفة لاستيعاب الاختلافات التشريحية بين عينات العظام.
الشكل 2: تصميم الأدلة . (أ) رسم ثلاثي الأبعاد و (ب) تصور تركيبات الصيد في منتصف العمود قبل الطباعة ثلاثية الأبعاد. استنادا إلى الأدبيات السابقة ، فإن زاوية العمود الأوسط بين 20 درجة تزيد من الصلابة. فهو يقلل من لحظة الانحناء القصوى في العمود الفخذي لضمان حدوث كسور في الرقبة والتباين في النتائج الميكانيكية5. للتعويض عن انحراف 3.13 درجة عن العمودي في زوايا متوسط العمود الأوسط ، تم تعيين زاوية التركيبات إلى 73.13 درجة لإنتاج زاوية 20 درجة. تمت طباعة تركيبات المحاذاة بأقطار تتراوح بين 1.9-2.2 مم لضمان ملاءمة مناسبة لأقطار العمود الأوسط المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- باستخدام طابعة 3D ، اطبع الأدلة. يمكن أن تظل الأدلة قيد التشغيل أثناء عملية الاختبار ، لذا فإن طباعة نسخ متماثلة متعددة من الأدلة يمكن أن تكون مفيدة لإعداد عينات متعددة في وقت واحد.
2. إعداد العينات
- حصاد عظم الفخذ الفأر عن طريق إجراء شق عرضي بالكامل حول بطن الفأر وإزالة الأنسجة من الشق إلى الكاحلين. بعد ذلك ، حدد موقع تجويف الورك واستخدم بعناية طرف زوج من الملقط الناعم لخلع الورك. قطع الأنسجة الرخوة الإضافية لإزالة الساق من الماوس.
- بمجرد حصاد الساق ، استخدم مشرطا لخلع مفصل الركبة وقطعه. نظف عظم الفخذ يدويا لجميع الأنسجة الرخوة باستخدام الملقط والمشارط والمناشف الورقية.
- اختبر العينات التي تم حصادها على الفور أو قم بتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا تم تجميد العينات ، فاسمح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة وترطيبها في PBS لمدة 2 ساعة قبل التحضير.
- باستخدام أنابيب ألومنيوم مربعة مقاس 1/4 بوصة × 1/4 بوصة (انظر جدول المواد) ، قم بقطع أقسام الأنابيب بطول 1/2 بوصة إلى 1 بوصة. باستخدام أداة حفر ، قم بتسمية كل جزء من الألومنيوم باستخدام معرفات العينة.
- املأ نصف شرائح الأنابيب بالمعجون. ضع أجزاء الأنابيب هذه في تركيبات لتثبيتها في وضع مستقيم.
- ضع عظم الفخذ الذي تم تنظيفه في الأدلة المطبوعة 3D. للقيام بذلك ، ضع العينات مسطحة على سطح الطاولة بحيث يكون السطح الأمامي متجها لأعلى. ضع الدليل مباشرة أسفل المدور الثالث ، حيث يصبح قطر العمود أكثر اتساقا.
ملاحظة: سيترك هذا ~ 7 مم من عظم الفخذ القريب فوق الدليل. - لمنع عظم الفخذ من الدوران إلى الجانب الجانبي أو الإنسي أثناء وضعه على الدليل ، أمسك بالأطراف القريبة والبعيدة بيد واحدة عند تطبيق الأدلة ، واضغط بقوة على عظم الفخذ على طاولة العمل وباستخدام يدك الأخرى ، ضع الدليل المطبوع 3D على العمود الأوسط لعظم الفخذ. تأكد من تطبيق دليل القطر المناسب بلطف ، حيث يمكن أن ينجذب العمود الأوسط لعظم الفخذ إذا أجبر على الدخول في دليل صغير جدا.
- بمجرد أن تكون الأدلة على عظم الفخذ ، ضعها أمام شرائح الألومنيوم المقابلة. باستخدام الأسمنت العظمي أو عوامل التصلب الأخرى ، املأ شرائح الألومنيوم حتى تمتلئ تماما ، تاركا مساحة صغيرة للإزاحة.
- ضع عظم الفخذ مع أدلة في قطاع الألومنيوم الصحيح.
ملاحظة: لن تتمحور الأدلة حول شرائح الألمنيوم ، حيث تجلس قليلا إلى جانب واحد للسماح للطرف البعيد من عظم الفخذ بالجلوس في وسط وعاء الألومنيوم. - اسمح لعامل التصلب بضبطه. بمجرد الضبط ، ضع العينات في طبق بتري مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة (PBS) واتركه لإعادة الترطيب لمدة 2 ساعة (الشكل 3).
الشكل 3: إعداد العينات باستخدام رقصات مخصصة وتركيبات الصيد. (أ) يتم الحفاظ على العينات في أواني الألومنيوم مع المحاذاة المناسبة باستخدام الأدلة المطبوعة 3D أثناء تجفيف الأسمنت العظمي. (ب) تظهر الأشعة السينية قبل الاختبار ظل تركيبات الصيد والتغطية الكاملة للأسمنت العظمي المحيط بالطرف البعيد من عظم الفخذ. المنطقة البيضاء المشبعة في الجزء السفلي من أواني الألومنيوم هي المعجون ، وتستخدم للحفاظ على الأسمنت العظمي في الأواني عند التصلب. شريط المقياس (اللوحة B) = 5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. إعداد الأجهزة
- باستخدام نظام اختبار ميكانيكي (MTS) ، قم بتوصيل ومعايرة خلية تحميل بدقة <1 N (انظر جدول المواد) (الشكل 4A).
ملاحظة: يمكن تركيب خلية التحميل على المسرح أو ، على نحو مفضل ، المحرك عندما يكون ذلك ممكنا. - قم بإرفاق تركيبات بفتحة مربعة من شأنها أن تمسك بحزم شرائح الألومنيوم مع العينات. قم بتوصيل مجموعة مسامير على جانبي التركيبات القابضة لتثبيت العينات بإحكام في مكانها. (الشكل 4 ب).
ملاحظة: يمكن طباعة هذه التركيبات 3D أو تشكيلها ثم النقر عليها باستخدام ثقوب لولبية مترابطة لتركيبها على إطار الاختبار. - قم بتوصيل لوحة تحميل بالمشغل. يمكن أن يكون هذا ببساطة برغيا مدببا مع طرف مسطح (الشكل 4C).
- ضع مجهرا ستيريويا على طاولة أو سطح أمام MTS مباشرة. إذا كانت هناك حاجة إلى إضاءة إضافية لرؤية الإعداد من خلال المجهر ، فضعها حول النظام.
الشكل 4: إعداد الأجهزة . (أ) إعداد الاختبار على نظام الاختبار الميكانيكي ، مع خلية تحميل 1 كيلو نيوتن (الدقة < 1 N) ومرحلة سوداء ثنائية المحور لضمان تحديد موضع العينة بشكل صحيح. (B) صورة مقربة لتركيبات التركيب المطبوعة ثلاثية الأبعاد المرفقة بخلية التحميل مع قضيب مترابط M10 واثنين من مسامير M4 المستخدمة لتثبيت وعاء الألومنيوم في مكانه. (ج) عرض العينة من خلال مجهر ستيريو مع تركيب تحميل مدبب. شريط المقياس (اللوحة C) = 5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
4. إعداد البرنامج
- في برنامج MTS ، ابدأ في إنشاء بروتوكول جديد للثني (الانحناء). تأكد من أن البروتوكول سيعمل في مجال التحكم في الإزاحة.
- اضبط معدل تحميل البروتوكول على 0.5 مم/ثانية.
- إذا كان البرنامج يحتوي على إعداد للمفاتيح اللينة ، فأضف المفاتيح اللينة "التوازن" و "Zero Extension" إلى البروتوكول.
ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى ضبط موضع الحمل والمحرك بسرعة على 0 قبل اختبار كل عينة. - تأكد من أن البرنامج سيقوم بتسجيل الوقت بالثواني ، والحمل بالنيوتن ، والتمديد أو الإزاحة بالملليمترات بمعدل أخذ عينات لا يقل عن 100 هرتز.
- احفظ البروتوكول الجديد والعودة إلى الشاشة الرئيسية للبرنامج لبدء اختبار مجموعة عينات جديدة.
5. إعداد الاختبار
- قبل تركيب العينات على MTS ، احصل على صورة بالأشعة السينية للعينات الموجودة في أواني الألومنيوم. يمكن تصوير عينات متعددة في وقت واحد. تأكد من التقاط المنظر الأمامي للعينات للسماح بقياسات التحقق من زاوية الأصيص (الشكل 5).
الشكل 5. تقييم محاذاة العينة. (أ) يتم قياس زاوية العمود من العمودي من الأشعة السينية الرقمية المستوية. (ب) تراوحت زوايا العمود الفخذي التمثيلي المحفوظ بوعاء من 18.11 درجة إلى 23.99 درجة، مع معامل تباين (COV) بنسبة 7.1٪ (n = 20). لم تكن الاختلافات بين الجنسين بسبب الاختلافات التشريحية ذات دلالة إحصائية ، كما تم تحديدها باستخدام اختبار t أحادي الذيل غير مقترن (p < 0.05). شريط المقياس (اللوحة A) = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- ضع قطعة الألومنيوم مع عينة في التركيبات القابضة وشد البراغي المحددة.
- قم بخفض السطح الزجاجي للمحرك/التحميل حتى يصبح على بعد بضعة ملليمترات من رأس الفخذ.
ملاحظة: لا تقم بتحميل العينة مسبقا بأي قوة واحرص على عدم خفض المحرك بسرعة كبيرة ، لأنه من السهل جدا إتلاف العينات. - باستخدام المجهر المجسم، اضبط المرحلة ثنائية المحور لمحاذاة موضع رأس الفخذ مباشرة أسفل السطح الزجاجي للتحميل. قفل المرحلة ثنائية المحور في مكانها.
- في برنامج MTS ، قم بتصفية موضع المحرك وقم بموازنة خلية التحميل باستخدام المفاتيح اللينة المضافة في الخطوة 4.3.
- ابدأ بروتوكول التحميل. اعتمادا على مقدار المساحة المتبقية بين السطح الزجاجي للتحميل والعينة ، سيستغرق الاختبار 10-30 ثانية فقط.
- بعد الاختبار، التقط أشعة سينية أمامية أخرى للعينة. سيتم استخدام هذا لتمييز وتوثيق طريقة الكسر (الشكل 6).
الشكل 6: صورة الأشعة السينية للعينات بعد الاختبار. جميع العينات مكسورة في خط متشعب من خلال عنق الفخذ وعلى طول ملحق عمود الرقبة الفخذي (أبرزته الدائرة البرتقالية). شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. تحليل البيانات
- بعد جمع البيانات، قم بتصدير بيانات القوة والإزاحة إلى برامج (انظر جدول المواد) تسمح بالرسوم البيانية والحسابات الرياضية.
- ارسم الحمل مقابل الإزاحة لكل عينة (الشكل 7 أ). تناسب تقريب خطي للجزء الخطي من منحنى إزاحة الحمل. سيحدد ميل هذا التناسب الخطي الصلابة ، وهو مقياس لمرونة العينة.
- احسب النتائج الإضافية مثل الحمل الأقصى والإزاحة القصوى وحمل العائد والإزاحة عند نقطة الخضوع والطاقة إلى أقصى حمل والطاقة إلى نقطة الإنتاج.
ملاحظة: يمكن تحديد نقطة العائد عن طريق تعويض التقريب الخطي المحدد في الخطوة 6.2 بنسبة 0.2٪ 6. النقطة التي يكون فيها خط الإزاحة والحمل مقابل. تقاطع منحنى الإزاحة سيحدد نقطة العائد. في حالة العينات الهشة جدا التي تظهر عائدا ضئيلا ، قد تكون نقطة العائد هي نفسها النقطة القصوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند وضعها في وعاء بمساعدة الدليل ، تمت محاذاة أعمدة الفخذ عند 21.6 درجة ± 1.5 درجة. في حين أن هذا يمثل انحرافا بنسبة <10٪ عن الزاوية المقصودة البالغة 20 درجة، فإن معاملات التباين (COV) لزاوية الأصيص عبر جميع العينات التي تم اختبارها كانت 7.6٪ و 6.5٪ للفئران الذكور والإناث، على التوالي (n = 10 لكل مجموعة) كما تم التحقق منها بواسطة الأشعة السينية المستوية قبل الاختبار (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام الأشعة السينية بعد الاختبار لتقييم الوضع الذي فشلت فيه العينات. لوحظ الفشل باستمرار في أعناق الفخذ ، كما هو مقصود ، بطريقة متشعبة ، مع خط كسر واحد مواز لعمود الفخذ والخط الآخر عمودي على عنق الفخذ (الشكل 6). إذا حدثت اختلافات كبيرة في نمط الكسر بين العينات ، فيمكن تقييم جودة العظام للعينات بشكل أكبر عن طريق μCT عن طريق قياس النتائج مثل كثافة المعادن في العظام الحجمية ، والسمك التربيقي والقشري ، والتباعد ، والتمعدن. إذا لم يتم تحفيز الفشل باستمرار في عنق الفخذ ، فقد يتم ضبط الأدلة المطبوعة 3D.
تتوافق مقاييس النتائج الميكانيكية الحيوية الواردة هنا مع القيم المبلغ عنها في الانحناء المحوري المماثل لتكوينات عنق الفخذ7،8،9،10،11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن المحاذاة المتسقة التي تم تحقيقها باستخدام الأدلة المطبوعة ثلاثية الأبعاد حسنت بشكل عام COV من الحمل الأقصى على وجه الخصوص (الجدول 1).
| الدراسة الحالية | جنس | زاوية العمود الأوسط | الحمولة القصوى | صلابه | العمل على الفشل |
| ذكر | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| أنثى | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | ذكر | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | ذكر | NR | 19% | NR | NR |
| كمال وآخرون9 | أنثى | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| ميدلتون وآخرون7 | أنثى | NR | 24%-27% | NR | NR |
| برنت وآخرون11 | أنثى - الفئران | NR | 18%-24% | NR | NR |
| برومر وآخرون12* | أنثى | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | أنثى | NR | 16%-32% | NR | NR |
| لودبرغ14* | أنثى | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: لم يتم الإبلاغ عنها | |||||
| *: بيانات مستنبطة من الأرقام المنشورة | |||||
الجدول 1: معاملات التباين لخصائص الانثناء المقاسة لأعناق الفخذ الفأرية. تمثل معاملات التباين نسبة الانحراف المعياري والمتوسط لمجموعة البيانات. مع انخفاض COV ، يشير هذا إلى تجميع أكثر إحكاما لنقاط البيانات الفردية حول المتوسط. أدى هذا البروتوكول إلى تقليل تكلفة الاشتباك بالنسبة للحمل الأقصى مقارنة بالمنشورات الأخرى التي تجري اختبارات مماثلة.
كما هو متوقع ، لوحظت اختلافات بين الجنسين في الخواص الميكانيكية المقاسة. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t أحادي الذيل غير مقترن. كانت أعناق الفخذ من الفئران الذكور أقوى بكثير وأكثر صلابة من العينات من الفئران الإناث (p = 0.009 و p = 0.0006 ، على التوالي). بالإضافة إلى ذلك ، شهدت رقاب الفخذ الإناث تشوهات أكثر أهمية (p = 0.014) وعملت على الفشل (p = 0.024) مقارنة بعينات من ذكور الفئران (الشكل 7). وهذا يتفق مع انخفاض كثافة المعادن في العظام لدى الإناث ويؤكد حساسية الاختبار للكشف عن الاختلافات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. في مجموعات الفئران من الذكور والإناث المستخدمة في هذه الدراسة ، كانت كثافة المعادن في عظام الفئران الإناث أقل بكثير من نظرائهم الذكور ، كما هو محدد من خلال فحص قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة (DEXA) واختبار t غير المقترن أحادي الذيل (p = 0.036).
الشكل 7: النتائج البيوميكانيكية. (أ) يستخدم منحنى إزاحة القوة التمثيلي ، الذي يعرض ملاءمة خطية إزاحة بنسبة 0.2٪ ، لاشتقاق نقطة الصلابة والإنتاج. مقاييس النتائج المختارة هي مبعثرة مرسومة تعرض المتوسط والانحراف المعياري ، بما في ذلك (B) الحمل الأقصى (عند الفشل) ، (C) الصلابة ، (D) الحد الأقصى للإزاحة (عند الفشل) ، و (E) العمل على الفشل (المنطقة تحت المنحنى حتى نقطة الفشل). تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة يتم تحديدها باستخدام اختبار t أحادي الذيل غير المقترن (* p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، n = 10 لكل مجموعة جنسية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
للتأكد من أن الاختلافات الطفيفة في زاوية الأصيص لم تسهم في التباين التجريبي ، تم رسم كل مقياس نتائج ميكانيكي حيوي مقابل زاوية الأصيص وأجرى انحدارا خطيا بسيطا للمجموعة الذكور ، والأتراب الأنثوي ، وجميع العينات مجمعة معا (الشكل 8). ثم تم اختبار الفرضية القائلة بأن ميل الانحدار الخطي ليس صفرا. أظهر تحليل الانحدار أنه باستثناء الصلابة ، فإن الاختلافات الطفيفة في زاوية الأصيص (النطاق من 18 درجة إلى 24 درجة) لم تؤثر على مقاييس النتائج الميكانيكية الحيوية. بالنسبة للصلابة ، كان هناك ارتباط خطي كبير مع زاوية الأصيص (R2 = 0.29 ، p < 0.05).
الشكل 8: تأثير زاوية الأصيص على النتائج الميكانيكية الحيوية. تم رسم مقاييس النتائج الميكانيكية الحيوية بما في ذلك (أ) الحمل الأقصى ، (ب) الصلابة ، (ج) الإزاحة القصوى ، و (د) العمل على الفشل مقابل زاوية الأصيص وربطها باستخدام انحدار خطي بسيط للمجموعة الذكور ، والأتراب الأنثوي ، وجميع العينات مجمعة معا. تظهر الخطوط السوداء الصلبة انحدارا خطيا للعينات المجمعة، مع خطوط منقطة تشير إلى فترات ثقة. لم يؤثر التباين في زاوية الأصيص بشكل كبير على الحمل الأقصى أو الإزاحة القصوى أو عمل الفشل. ومع ذلك ، مع زيادة زاوية الأصيص ، زادت الصلابة ، كما هو محدد في اختبار بيرسون (p = 0.0126 ، n = 20). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: لغة المثلث القياسية (. STL) ملف الأدلة. يمكن استخدام هذا الملف لطباعة الأدلة الموضحة في البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد هذا البروتوكول اختبار ثني ناتئ موثوق به لأعناق الفخذ الفئران. عادة ما لا يتم تمثيل سيناريو الانثناء الكابولي الطبيعي الذي يحدث في عنق الفخذ في اختبارات الانحناء القياسية المكونة من 3 و 4 نقاط5. طريقة الاختبار هذه أفضل وأكثر موثوقية تكرر نوع كسور عنق الفخذ التي يعاني منها مرضى هشاشة العظام. التركيز الرئيسي عند تنفيذ هذا البروتوكول هو القضاء على التباين بسبب عدم اتساق وعاء العمود الفخذي. ومن الأهمية بمكان أن اتباع الخطوات المبينة في القسمين الأول والرابع من البروتوكول عن كثب سيضمن أن يؤدي إنشاء الأدلة وبروتوكول التحميل إلى تكرار ما ورد في هذا المنشور. كما يمكن التنبؤ نظريا وإظهاره تجريبيا ، يمكن أن تؤثر زاوية العمود الأوسط بالنسبة لمحور التحميل على الضغوط التي تعاني منها عنق الفخذ واحتمال حدوث الكسر في عنق الفخذ. وقد أثبتت المجموعات السابقة أن زاوية العمود الأوسط تؤثر بشكل كبير على صلابة وقوة ضغط عظم الفخذ عند تحميلها من خلال رأس الفخذ. أظهر التحليل البارامتري لتأثيرات زوايا ميل العمود الأوسط أن لحظات الانحناء القصوى في أعمدة الفخذ تشهد حدا أدنى عند زوايا العمود الأوسط بين 15 درجة و 25 درجة ، مما يزيد أيضا من صلابة العمود 5. وبالتالي ، فإن هذه الزاوية تقلل من احتمال حدوث كسور ضغط في العمود وتزيد من احتمال حدوث كسور انثناء في عنق الفخذ.
يمكن أن تؤثر العديد من المعلمات على نتائج أي اختبار ميكانيكي حيوي وتشوش القدرة على اكتشاف الاختلافات الكبيرة بسبب المتغيرات التجريبية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ويتفاقم هذا التباين بسبب صغر حجم عظام الفئران الطويلة. من بين المعلمات التي تتطلب الاهتمام في هذا الاختبار ، على وجه الخصوص ، عدد دورات التجميد والذوبان وحالة ترطيب العظام ، ومعدل التحميل ، ومحاذاة العمود الفخذي بالنسبة لمحور التحميل. ينص البروتوكول على أن جميع العينات تمر بنفس العدد من دورات التجميد والذوبان ونافذة 2 ساعة للترطيب في PBS في درجة حرارة الغرفة. يتم تعيين معدل التحميل أيضا على قيمة موحدة تبلغ 0.5 مم / ثانية 3,4. علاوة على ذلك ، تم تصميم أدلة مطبوعة 3D لوضع عظم الفخذ باستمرار بزاوية منتصف العمود ~ 20 درجة أثناء خطوة الأصيص. نتج عن ذلك زوايا متناسقة للأعمدة الوسطى في حدود 18 درجة إلى 24 درجة ، مع عدم وجود تأثيرات جنسية كبيرة بسبب الاختلافات التشريحية ومعاملات التباين بنسبة 7.6٪ و 6.5٪ للفئران الذكور والإناث ، على التوالي. يمكن الوصول إلى هذه الأدلة ، وتعديلها بسهولة باستخدام برنامج النمذجة الصلبة القياسية ، وإعادة إنتاجها عند الطلب باستخدام طابعة 3D مكتبية غير مكلفة.
أظهرت النتائج التمثيلية أن بروتوكول الاختبار حساس للاختلافات الفسيولوجية الدقيقة ، مثل الجنس ، مع حجم عينة معقول من n = 10. اقترح تحليل الطاقة بأثر رجعي الذي يمثل تأثيرات الحجم المحددة تجريبيا (δ = Δmean / SD) عند n = 10 أن الطاقة قدرت بنسبة 57٪ للحمل الأقصى عند الفشل (δ = 0.8) ، >95٪ للصلابة (δ = 1.77) والحد الأقصى للإزاحة (δ = 1.9) ، و 83٪ للعمل حتى الفشل (δ = 1.77) ، على التوالي. جنبا إلى جنب مع المعاملات الصغيرة للتباين (الجدول 1) ، يؤكد تحليل الطاقة هذا أن التباين في زاوية الأصيص قد أثر سلبا على حساسية البروتوكول وموثوقيته.
أظهر التحليل الذاتي لطريقة الفشل أيضا أن 100٪ من العينات التي تم اختبارها فشلت في عنق الفخذ ، حيث أظهرت جميعها كسرا متشعبا ، مع خط كسر واحد يسير بالتوازي مع العمود في الموقع الذي يلتقي فيه بالرقبة وخط كسر آخر عمودي على عنق الفخذ في قمة التشعب. وهذا يشمل ميزات من وضعين ذوي صلة سريريا من كسور عنق الفخذ. كسور الرقبة بين المتروشانتريك وعبر عنق الرحم15. اختبارات ثني ناتئ عنق الفخذ ليست شائعة الاستخدام وموصوفة في الأدبيات مثل اختبار الالتواء أو الانثناء القياسي للأعمدة الوسطى الفخذية والظنبوبية في نماذج القوارض لهشاشة العظام. تم تحديد عدد قليل فقط من الدراسات لوصف مثل هذه البروتوكولات باستخدام نماذج الفئران والجرذان5،7،8،9،16،17. لا يتم الإبلاغ دائما عن الزاوية التي تم فيها وضع عظم الفخذ أثناء الاختبار. يستخدم البعض الذين لديهم أوصاف مفصلة كمية مفرطة من التركيبات والبرامج المخصصة لمحاذاة عيناتهم5 لكنهم ما زالوا يلجأون إلى الأواني باليد ، مما يؤدي إلى نفس الخطأ البشري في البروتوكولات الأخرى.
تم تصميم هذا البروتوكول لعينات الفئران وهو محدد للفئران C57Bl / 6 ولكن يمكن تكييفه بسهولة مع النماذج الحيوانية الكبيرة أو سلالات الفئران الأخرى ذات الهندسة الفخذية المختلفة. قد يحتاج المحققون المستقبليون الذين يستخدمون هذا البروتوكول إلى تعديل كمية العظام المكشوفة ، حيث قد لا يكون المدور الثالث على بعد 7 مم بالضبط من رأس الفخذ. وتشمل التعديلات الإضافية على البروتوكول استخدام عامل تصلب يمكن تخفيفه بعد الاختبار لإطلاق العينة إذا رغبت في إجراء مزيد من الاختبارات. ويمكن القيام بذلك باستخدام سبيكة البزموت التي يمكن صهرها في حمام ماء ساخن بعد اختبارها لإطلاق العينة7. التعديل النهائي الذي يمكن للمستخدمين إجراؤه على هذا البروتوكول بعيد المنال في الخطوة 3.1 ، كونه نوع خلية التحميل وموقعها. يجب استخدام خلية تحميل محورية بدقة فرعية 1 N. ستكون خلية التحميل 50 N مناسبة بناء على الأحمال القصوى التي لوحظت. علاوة على ذلك ، يجب استخدام خلية تحميل تقيس فقط التوتر أو الضغط لتجنب أي لحظة انحناء مركبة قد تواجهها خلية الحمل من التحميل غريب الأطوار بالنسبة لخلية التحميل. هناك طريقة أخرى لتجنب قياسات القوة المركبة وهي تثبيت خلية التحميل على المحرك لضمان توافق قوة التحميل مع خلية التحميل.
يبسط هذا البروتوكول الحاجة إلى تركيبات مخصصة ، ويصف كيف يمكن طباعة الأدلة على أي طابعة ثلاثية الأبعاد متاحة تجاريا ، ويستخدم معدات مختبرية مشتركة لاختبار العينات بدقة وتكرار ، كما يتضح من معاملات التباين المنخفضة المبلغ عنها في الدراسة الحالية (الجدول 1). ومع ذلك ، لا يتم تقييد هذا البروتوكول بالحاجة إلى طابعة 3D. توجد حلول متاحة تجاريا ، حيث يمكن إرسال ملفات تقديم 3D إلى شركات الطباعة ، ويمكن شحن الأجزاء مرة أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا النمط من تحميل الانحناء على عنق الفخذ يحاكي موقع وأنواع الكسور التي تواجهها سريريا. مع وجود عدد الأشخاص المعرضين لخطر كبير للإصابة بكسور الهشاشة ، من المتوقع أن يكون هناك ما يزيد عن 21.3 مليون كسر في الورك كل عام بحلول عام 205018. إن العبء الاجتماعي والمالي والطبي الهائل الذي يفرضه هذا الاختبار الموثوق به في نماذج القوارض يمكن أن يحسن من صرامة وقابلية تكرار الأبحاث الموجهة نحو فهم مسببات هشاشة العظام والعلاجات لعلاجها بفعالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم الدراسة من قبل NIH P30AR069655 و R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
