Summary
Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een reproduceerbaar testplatform voor muriene femurhalzen in een sledebuigopstelling. Aangepaste 3D-geprinte geleiders werden gebruikt om de dijbenen consistent en stijf in optimale uitlijning te fixeren.
Abstract
Fracturen in de femurhals komen vaak voor bij personen met osteoporose. Veel muismodellen zijn ontwikkeld om ziektetoestanden en therapieën te beoordelen, met biomechanische testen als primaire uitkomstmaat. Traditionele biomechanische tests richten zich echter op torsie- of buigtests die worden toegepast op de middenas van de lange botten. Dit is meestal niet de plaats van hoogrisicofracturen bij osteoporotische personen. Daarom werd een biomechanisch testprotocol ontwikkeld dat de femurhalzen van muizendijbenen in cantileverbuigingsbelasting test om de soorten fracturen die osteoporosepatiënten ervaren beter te repliceren. Omdat de biomechanische uitkomsten sterk afhankelijk zijn van de buigrichting ten opzichte van de femurhals, zijn 3D-geprinte geleiders gemaakt om een femurschacht onder een hoek van 20° ten opzichte van de belastingsrichting te houden. Het nieuwe protocol stroomlijnde het testen door de variabiliteit in uitlijning te verminderen (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) en verbeterde reproduceerbaarheid in de gemeten biomechanische uitkomsten (gemiddelde COV = 26,7%). De nieuwe aanpak met behulp van de 3D-geprinte gidsen voor betrouwbare uitlijning van monsters verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid door de meetfouten als gevolg van een verkeerde uitlijning van het monster te verminderen, wat de steekproefgroottes in muisstudies van osteoporose zou moeten minimaliseren.
Introduction
Fractuurrisico is een ernstige medische zorg in verband met osteoporose. Meer dan 1,5 miljoen fragiliteitsfracturen worden elk jaar alleen al in de Verenigde Staten gemeld, met fracturen in de heup, met name de femurhals, als de leidende fractuur type1. Geschat wordt dat 18% van de vrouwen en 6% van de mannen in hun leven een femurhalsfractuur zullen ervaren2, en het sterftecijfer na 1 jaar na de fractuur is groter dan 20%1. Daarom kunnen muismodellen die biomechanische testen van de femurhals mogelijk maken, geschikt zijn voor het bestuderen van fragiliteitsfracturen. Muismodellen bieden ook krachtige hulpmiddelen om vertaalbare cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die mogelijk betrokken zijn bij osteoporose op te helderen. Dit komt door de beschikbaarheid van genetische verslaggevers, winst en verlies van functiemodellen en de uitgebreide bibliotheek van moleculaire technieken en reagentia. Mechanisch testen van muizenbotten kan de nodige uitkomstmaten bieden om de gezondheid van de botten, genotypische en fenotypische variaties te bepalen die de etiologie van de ziekte kunnen verklaren, en therapieën beoordelen op basis van uitkomstmaten van de kwaliteit van het bot en het risico op fracturen3.
De anatomie van de femurhals creëert unieke mechanische belastingsscenario's, die meestal leiden tot buigfracturen (buigen). De heupkop wordt geladen in de acetabulaire kom aan het proximale uiteinde van het dijbeen. Hierdoor ontstaat een uitkragende buigingsscenario op de femurhals, die distaal stevig aan de heupschacht is bevestigd4. Dit verschilt van traditionele 3- of 4-punts buigtests op de femuraire mid-diafyse. Hoewel deze tests nuttig zijn, repliceren ze niet de belasting die meestal leidt tot fragiliteitsfracturen bij osteopenische en osteoporotische personen in termen van fractuurlocatie of het belastingsscenario.
Om het risico op fragiliteitsfracturen bij muizen beter te beoordelen, werd geprobeerd de reproduceerbaarheid van cantileverbuigingstests van muriene femurhalzen te verbeteren. Zoals theoretisch voorspeld, is aangetoond dat de belastingshoek op de heupkop ten opzichte van de femurschacht de uitkomstmaten aanzienlijk beïnvloedt5, waardoor een uitdaging ontstaat voor de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van gerapporteerde uitkomsten. Om een goede en consistente uitlijning van de dijbenen tijdens de monstervoorbereiding te garanderen, werden gidsen ontworpen en 3D-geprint op basis van anatomische metingen op μCT-scans van C57BL / 6 muisdijbenen. De geleiders zijn ontworpen om te helpen bij het consequent oppotten van de monsters, zodat de femurschacht op ~ 20 ° van de verticale belastingsrichting wordt gehouden. Deze hoek is gekozen omdat het de stijfheid maximaliseert en tegelijkertijd het maximale buigmoment langs de heupschacht minimaliseert, wat de kans op femurhalsfracturen verhoogt en leidt tot meer consistente en reproduceerbare tests5. Geleiders werden 3D-geprint in verschillende formaten om anatomische verschillen tussen monsters op te vangen en gebruikt om monsters in een stabiele positie te houden tijdens het oppotten in acrylbotcement. De stijfheid, maximale kracht, vloeikracht en maximale energie werden berekend uit de krachtverplaatsingsgrafieken. Deze testmethode toonde consistente resultaten voor de bovengenoemde biomechanische uitkomst. Met oefening en de hulp van de 3D-geprinte gids kunnen meetfouten als gevolg van een verkeerde uitlijning worden geminimaliseerd, wat resulteert in betrouwbare uitkomstmaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden goedgekeurd door het University of Rochester Committee of Animal Resources. De muizen die in deze studie werden gebruikt, waren C57BL / 6-mannetjes en -vrouwen, variërend van de leeftijd van 24-29 weken oud. Muizen werden gehuisvest in standaardomstandigheden met voedsel en water ad libitum. Bij euthanasie via kooldioxide-inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie, werden 20 rechterdijbenen (10 mannelijke en 10 vrouwelijke) geoogst en ingevroren bij -20 °C totdat ze werden getest.
1. Creatie van aangepaste 3D-geprinte montagehandleidingen
OPMERKING: Deze stap kan nodig zijn omdat verschillende stammen en genetische fenotypen verschillende anatomische geometrieën kunnen hebben.
- Verkrijg μCT-scans van de representatieve monsters.
- Scan representatieve monsters op een μCT-scanner met de volgende instellingen: 55 kV, 145 μA voor integratietijden van 300 ms en een resolutie van 10,5 μm voxels.
- Zorg ervoor dat het gevangen gebied het proximale uiteinde van het dijbeen bedekt en door de middenas naar beneden loopt.
OPMERKING: Als een μCT-scanner niet beschikbaar is, kunnen 2D-vlakke röntgenfoto's van de representatieve monsters worden gebruikt.
- Analyseer de μCT-scans.
- Gebruik de representatieve set μCT-scans om een 2D-weergave van het voorste beeld van het proximale dijbeen te verkrijgen.
- Verkrijg μCT-beelden met een resolutie van 10,5 μm voxels van de middenas tot het proximale uiteinde van het dijbeen. Compileer deze segmenten met behulp van software (zie Tabel met materialen) in een 3D-weergave van het monster.
- Bepaal een drempel om bot van het omliggende weefsel te onderscheiden en pas een Gaussisch filter toe voor ruisonderdrukking.
- Oriënteer de 3D-renderings om kantelen buiten de as te elimineren en ervoor te zorgen dat het voorste oppervlak van het dijbeen wordt bekeken.
- Exporteer deze 2D-weergave van de 3D-rendering als een afbeeldingsbestand, zoals .jpg of .png.
- Meet met behulp van een beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen) de femurschachthoek door een lijn loodrecht op de femurschacht 7 mm distaal te tekenen en een tweede lijn door de top van de grotere trochanter naar het middelpunt van de bovengenoemde loodrechte lijn (figuur 1).
- Meet langs de distale loodrechte lijn van 7 mm de diameter van de femurschacht onder de derde trochanter.
- Gebruik de representatieve set μCT-scans om een 2D-weergave van het voorste beeld van het proximale dijbeen te verkrijgen.
Figuur 1: μCT-analyse. μCT-beelden van dijbenen van C57Bl/6-muizen worden gebruikt om de gemiddelde ashoek te berekenen, gemeten vanaf de bovenkant van de grotere trochanter door het midden van de middenas, ~ 7 mm distaal. Op deze positie werd ook de diameter van de middelste aas gemeten. De 3D-weergaven van het proximale dijbeen werden in een voorste weergave georiënteerd om het profiel van de derde trochanter weer te geven. De gemiddelde ashoek was 93,13° (SD = 1,19°) en de gemiddelde middenasdiameter was 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Maak de montagehandleidingen met behulp van een 3D-modelleringssoftwareprogramma (zie Tabel met materialen) (Figuur 2, Aanvullend bestand 1).
OPMERKING: De geleiders zijn rechthoekige kubussen van 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm met een schuine sleuf, iets groter dan de gemiddelde asdiameter bepaald in stap 1.1.2. De hoek van de sleuf creëert een consistente hoek van 20° ten opzichte van verticaal. De geleiders moeten consistent zijn in lengte, hoogte en breedte, maar kunnen worden gemaakt met verschillende sleufdiameters om anatomische verschillen tussen de botmonsters op te vangen.
Figuur 2: Het ontwerpen van de hulplijnen. (A) 3D-schets en (B) visualisatie van middenas hengelarmatuur vóór 3D-printen. Op basis van eerdere literatuur maximaliseert een middenashoek tussen 20° de stijfheid. Het minimaliseert het maximale buigmoment in de heupschacht om ervoor te zorgen dat er breuken in de nek optreden en variabiliteit in mechanische uitkomsten5. Om de afwijking van 3,13° loodrecht in de gemiddelde hoeken van de middenas te compenseren, werd de bevestigingshoek ingesteld op 73,13° om een hoek van 20° te produceren. Uitlijningsarmaturen werden geprint met diameters variërend van 1,9-2,2 mm om een goede pasvorm te garanderen voor verschillende middenasdiameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Druk de hulplijnen af met een 3D-printer. De hulplijnen kunnen ingeschakeld blijven tijdens het testproces, dus het afdrukken van meerdere replicaties van de hulplijnen kan nuttig zijn voor het voorbereiden van meerdere monsters tegelijk.
2. Monstervoorbereiding
- Oogst de muisdijbenen door een dwarse incisie volledig rond de buik van de muis te maken en het weefsel van de incisie naar de enkels te verwijderen. Zoek hierna de heupkom en gebruik voorzichtig de punt van een fijne tang om de heup te ontwrichten. Snijd het extra zachte weefsel om het been van de muis te verwijderen.
- Zodra het been is geoogst, gebruikt u een scalpel om het kniegewricht te ontwrichten en door te snijden. Reinig handmatig de dijbenen van alle zachte tissue met een tang, scalpels en papieren handdoeken.
- Test de geoogste monsters onmiddellijk of bewaar ze bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Als monsters bevroren zijn, laat ze dan op kamertemperatuur komen en hydrateer ze gedurende 2 uur in PBS voordat je ze voorbereidt.
- Gebruik 1/4 "x 1/4" vierkante aluminium buizen (zie tabel met materialen), snijd buizensecties van 1/2 "tot 1" in lengte. Label met behulp van een etsgereedschap elk aluminiumsegment met de voorbeeld-ID's.
- Vul de helft van de buissegmenten met stopverf. Plaats deze buissegmenten in een armatuur om ze rechtop te houden.
- Plaats de gereinigde dijbenen in de 3D-geprinte geleiders. Om dit te doen, plaatst u de monsters plat op het tafelblad, zodat het voorste oppervlak naar boven is gericht. Plaats de geleider direct onder de derde trochanter, waar de asdiameter consistenter wordt.
OPMERKING: Hierdoor blijft ~ 7 mm van het proximale dijbeen boven de geleider. - Om te voorkomen dat het dijbeen naar de laterale of mediale zijde draait tijdens het plaatsen op de geleider, houdt u de proximale en distale uiteinden met één hand vast bij het aanbrengen van de geleiders, drukt u het dijbeen stevig op de werkbank en plaatst u met uw andere hand de 3D-geprinte geleider op de middenas van het dijbeen. Zorg ervoor dat u de juiste diametergeleider voorzichtig aanbrengt, omdat de middenas van het dijbeen kan knappen als deze te klein in een geleider wordt geduwd.
- Zodra de geleiders op de dijbenen zitten, plaatst u ze voor de overeenkomstige aluminium segmenten. Gebruik botcement of andere verhardingsmiddelen om de aluminium segmenten tot ze net vol zijn, waardoor er een beetje ruimte overblijft voor verplaatsing.
- Plaats de dijbenen met geleiders in het juiste aluminium segment.
OPMERKING: De geleiders zijn niet gecentreerd op de aluminium segmenten, iets naar één kant geplaatst om het distale uiteinde van het dijbeen in het midden van de aluminium pot te laten zitten. - Laat het verhardingsmiddel uitharden. Plaats de monsters eenmaal ingesteld in een petrischaaltje met fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur en laat gedurende 2 uur rehydrateren (figuur 3).
Figuur 3: Monstervoorbereiding met behulp van aangepaste mallen en hengelarmaturen. (A) Monsters in aluminium potten met de juiste uitlijning worden onderhouden met behulp van de 3D-geprinte geleiders terwijl het botcement droogt. (B) Röntgenfoto's vóór de test tonen de schaduw van hengelarmaturen en volledige dekking van botcement rond het distale uiteinde van dijbenen. Het verzadigde witte gebied aan de onderkant van de aluminium potten is stopverf, gebruikt om botcement in potten te houden bij het uitharden. Schaalbalk (Paneel B) = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Hardware set-up
- Bevestig en kalibreer met behulp van een mechanisch testsysteem (MTS) een loadcel met een resolutie <1 N (zie Materiaaltabel) (Figuur 4A).
OPMERKING: De loadcel kan indien mogelijk op het podium of, bij voorkeur, de actuator worden gemonteerd. - Bevestig een armatuur met een vierkante sleuf die de aluminium segmenten stevig vasthoudt met de monsters. Bevestig stelschroeven aan de twee zijden van de houder om monsters stevig op hun plaats te houden. (Figuur 4B).
OPMERKING: Dit armatuur kan 3D-geprint of bewerkt worden en vervolgens worden getapt met schroefgaten met schroefdraad om op het testframe te worden gemonteerd. - Bevestig een laadplaat aan de actuator. Dit kan gewoon een taps toelopende schroef zijn met een afgeplatte punt (figuur 4C).
- Plaats een stereomicroscoop op een tafel of oppervlak direct voor het MTS. Als er extra verlichting nodig is om de opstelling door de microscoop te zien, plaats deze dan rond het systeem.
Figuur 4: Hardware-opstelling. (A) Opstelling van het testen op een mechanisch testsysteem, met 1 kN loadcel (resolutie < 1 N) en zwarte biaxiale fase om een goede monsterpositionering te garanderen. (B) Close-up van de 3D-geprinte montagebevestiging bevestigd aan de loadcel met een M10-draadstang en twee M4-bouten die worden gebruikt om de aluminium pot op zijn plaats te houden. (C) Weergave van het monster door een stereomicroscoop met een taps toelopende laadarmatuur. Schaalbalk (Paneel C) = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Software set-up
- Begin in de MTS-software met het maken van een nieuw buigprotocol (buigen). Zorg ervoor dat het protocol werkt in verplaatsingscontrole.
- Stel de laadsnelheid van het protocol in op 0,5 mm/s.
- Als de software een instelling voor zachte toetsen heeft, voegt u de zachte toetsen "Balance" en "Zero Extension" toe aan het protocol.
OPMERKING: Hiermee worden de belasting en actuatorpositie snel ingesteld op 0 voordat elk monster wordt getest. - Zorg ervoor dat het softwareprogramma de tijd in seconden registreert, de belasting in Newton en de uitbreiding of verplaatsing in millimeters bij een minimale bemonsteringsfrequentie van 100 Hz.
- Sla het nieuwe protocol op en keer terug naar het hoofdscherm van het softwareprogramma om te beginnen met het testen van een nieuwe voorbeeldset.
5. Testopstelling
- Voordat u de monsters op de MTS monteert, moet u een röntgenfoto maken van de monsters in de aluminium potten. Meerdere monsters kunnen tegelijk worden afgebeeld. Zorg ervoor dat de voorste weergave van monsters wordt vastgelegd om verificatiemetingen van de pothoek mogelijk te maken (figuur 5).
Figuur 5. Beoordeling van de afstemming van de monsters. (A) De ashoek van verticaal wordt gemeten aan de hand van vlakke digitale röntgenstralen. (B) Representatieve dijbeenschachthoeken varieerden van 18,11° tot 23,99°, met een variatiecoëfficiënt (COV) van 7,1% (n = 20). Geslachtsverschillen als gevolg van anatomische variaties waren niet statistisch significant, zoals bepaald met behulp van een eenzijdige ongepaarde t-test (p < 0,05). Schaalbalk (Paneel A) = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Plaats het aluminium segment met monster in de houder en draai de stelschroeven vast.
- Laat de actuator-/laadplaat zakken totdat deze zich binnen enkele millimeters van de heupkop bevindt.
OPMERKING: Laad het monster niet voor met enige kracht en pas op dat u de actuator niet te snel laat zakken, omdat het zeer gemakkelijk is om monsters te beschadigen. - Pas met behulp van de stereomicroscoop de biaxiale trap aan om de positie van de heupkop direct onder de laadplaat uit te lijnen. Vergrendel de biaxiale fase op zijn plaats.
- In de MTS-software wordt de positie van de actuator op nul gezet en wordt de loadcel gebalanceerd met behulp van de zachte toetsen die in stap 4.3 zijn toegevoegd.
- Begin met het laadprotocol. Afhankelijk van hoeveel ruimte er nog over was tussen de laadplaat en het monster, duurt het testen slechts 10-30 s.
- Leg na het testen nog een anterieure röntgenfoto van het monster vast. Dit zal worden gebruikt om de fractuurwijze te onderscheiden en te documenteren (figuur 6).
Figuur 6: Röntgenbeeld van monsters na het testen. Alle monsters braken in een gespleten lijn door de femurhals en langs de femorale nek-schachtaanhechting (gemarkeerd door de oranje cirkel). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Data-analyse
- Exporteer na het verzamelen van gegevens kracht- en verplaatsingsgegevens naar software (zie Tabel met materialen) die grafieken en wiskundige berekeningen mogelijk maakt.
- Plot de lading versus. verplaatsing voor elk monster (figuur 7A). Plaats een lineaire benadering van het lineaire segment van de lastverplaatsingscurve. De helling van deze lineaire pasvorm bepaalt de stijfheid, een maat voor de elasticiteit van het monster.
- Bereken de aanvullende uitkomsten zoals maximale belasting, maximale verplaatsing, vloeigrens, verplaatsing op vloeipunt, energie tot maximale belasting en energie tot vloeipunt.
OPMERKING: Het vloeipunt kan worden bepaald door de in stap 6.2 bepaalde lineaire benadering uit te schakelen met 0,2%6. Het punt waarop de off-set lijn en de belasting vs. de kruising van de verplaatsingscurve bepaalt het vloeipunt. Bij zeer broze monsters die weinig opbrengst laten zien, kan het vloeipunt gelijk zijn aan het maximumpunt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij potten met behulp van de geleider werden de femurschachten uitgelijnd op 21,6° ± 1,5°. Hoewel dit <10% afwijking van de beoogde hoek van 20° vertegenwoordigt, waren de variatiecoëfficiënten (COV) van de pothoek over alle geteste monsters respectievelijk 7,6% en 6,5% voor mannelijke en vrouwelijke muizen (n = 10 per groep) zoals geverifieerd door planaire röntgenfoto's vóór de test (figuur 5). Bovendien moeten de röntgenfoto's na het testen worden gebruikt om de modus te beoordelen waarin de monsters faalden. Falen werd consequent waargenomen in de femurhalzen, zoals bedoeld, op een gespleten manier, met één breuklijn parallel aan de femurschacht en de andere lijn loodrecht op de femurhals (figuur 6). Als er significante variaties zouden optreden in het breukpatroon tussen monsters, dan zou de botkwaliteit van monsters verder kunnen worden beoordeeld via μCT door uitkomsten te meten zoals volumetrische botmineraaldichtheid, trabeculaire en corticale dikte, afstand en mineralisatie. Als falen niet consequent wordt geïnduceerd in de femurhals, kunnen de 3D-geprinte geleiders worden aangepast.
De hierin gerapporteerde biomechanische uitkomstmaten komen overeen met waarden die worden gerapporteerd in vergelijkbare axiale buiging van femurhalsconfiguraties7,8,9,10,11,12,13,14. De consistente uitlijning die met behulp van de 3D-geprinte geleiders werd bereikt, verbeterde echter over het algemeen de COV van de maximale belasting in het bijzonder (tabel 1).
| Huidige studie | Geslacht | Middenashoek | Maximale belasting | Stijfheid | Werk tot mislukking |
| Mannelijk | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Vrouwelijk | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Mannelijk | Nr | 22% | Nr | Nr |
| Jämsä et al8 | Mannelijk | Nr | 19% | Nr | Nr |
| Kamal et al9 | Vrouwelijk | Nr | 16%-25% | 11%-28% | Nr |
| Middleton et al7 | Vrouwelijk | Nr | 24%-27% | Nr | Nr |
| Brent et al11 | Vrouwtje - ratten | Nr | 18%-24% | Nr | Nr |
| Bromer et al12* | Vrouwelijk | Nr | 11%-27% | Nr | Nr |
| Vegger et al13* | Vrouwelijk | Nr | 16%-32% | Nr | Nr |
| Lodberg14 | Vrouwelijk | Nr | 11%-45% | Nr | Nr |
| NR: Niet gemeld | |||||
| *: Gegevens geëxtrapoleerd uit gepubliceerde cijfers | |||||
Tabel 1: Variatiecoëfficiënten voor gemeten buigeigenschappen van femurhalzen van muizen. De variatiecoëfficiënten vertegenwoordigen een verhouding tussen de standaarddeviatie en het gemiddelde van een gegevensverzameling. Naarmate de COV afneemt, duidt dit op een nauwere groepering van de afzonderlijke gegevenspunten rond het gemiddelde. Dit protocol verlaagde de COV voor maximale belasting in vergelijking met andere publicaties die vergelijkbare tests uitvoerden.
Zoals verwacht werden sekseverschillen waargenomen in de gemeten mechanische eigenschappen. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een eenzijdige ongepaarde t-test. Femurhalzen van mannelijke muizen waren significant sterker en stijver dan exemplaren van vrouwelijke muizen (respectievelijk p = 0,009 en p = 0,0006). Bovendien ondergingen de vrouwelijke femurhalzen meer significante vervormingen (p = 0,014) en werkten ze tot mislukking (p = 0,024) in vergelijking met exemplaren van mannelijke muizen (figuur 7). Dit komt overeen met de lagere botmineraaldichtheid bij vrouwen en onderstreept de gevoeligheid van de test om fysiologisch relevante verschillen te detecteren. In de mannelijke en vrouwelijke muizencohorten die in deze studie werden gebruikt, was de botmineraaldichtheid van de vrouwelijke muizen significant lager dan hun mannelijke tegenhangers, zoals bepaald door een dual-energy X-ray absorptiometry scan (DEXA) en een eenzijdige ongepaarde t-test (p = 0,036).
Figuur 7: Biomechanische uitkomsten. (A) Een representatieve krachtverplaatsingscurve, met een offset lineaire pasvorm van 0,2%, wordt gebruikt om de stijfheid en het vloeipunt af te leiden. Geselecteerde uitkomstmaten zijn spreidingsgeplodeerd met gemiddelde en standaarddeviatie, waaronder (B) maximale belasting (bij uitval), (C) stijfheid, (D) maximale verplaatsing (bij storing) en (E) werk tot uitval (gebied onder de curve tot aan het faalpunt). Asterisken geven significante verschillen aan die zijn bepaald met behulp van een eenzijdige ongepaarde t-test (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 per geslachtscohort). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om te bevestigen dat de kleine variaties in de pothoek niet bijdroegen aan de experimentele variabiliteit, werd elke biomechanische uitkomstmaat uitgezet tegen de pothoek en voerde een eenvoudige lineaire regressie uit voor het mannelijke cohort, het vrouwelijke cohort en alle monsters gegroepeerd (figuur 8). Vervolgens werd de hypothese getest dat de lineaire regressiehelling niet nul is. De regressieanalyse toonde aan dat, afgezien van de stijfheid, de kleine variaties in de pothoek (bereik 18° tot 24°) geen invloed hadden op de biomechanische uitkomstmaten. Voor stijfheid was er een significante lineaire correlatie met de pothoek (R2 = 0,29, p < 0,05).
Figuur 8: Effect van de pothoek op biomechanische uitkomsten. Biomechanische uitkomstmaten, waaronder (A) maximale belasting, (B) stijfheid, (C) maximale verplaatsing en (D) werk tot falen, werden uitgezet tegen de pothoek en gecorreleerd met behulp van een eenvoudige lineaire regressie voor het mannelijke cohort, het vrouwelijke cohort en alle monsters gegroepeerd. Effen zwarte lijnen tonen lineaire regressie van gegroepeerde monsters, met stippellijnen die betrouwbaarheidsintervallen aangeven. Variabiliteit in de pothoek had geen significante invloed op de maximale belasting, maximale verplaatsing of faalwerk. Naarmate de pothoek toenam, nam de stijfheid echter toe, zoals bepaald door een Pearson-test (p = 0,0126, n = 20). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Standaard driehoekstaal (. STL) bestand van de gidsen. Dit bestand kan worden gebruikt om de handleidingen af te drukken die in het protocol worden beschreven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol schetst een betrouwbare cantilever buigtest voor murine femurhalzen. Het natuurlijke cantileverflexuurscenario dat optreedt bij de femurhals wordt meestal niet weergegeven in standaard 3- en 4-punts buigtests5. Deze testmethode is beter en betrouwbaarder repliceert het type femurhalsfracturen dat wordt ervaren door botfragiliteitspatiënten. De belangrijkste focus bij het uitvoeren van dit protocol is het elimineren van de variabiliteit als gevolg van inconsistente oppotting van de femurschacht. Het is van cruciaal belang dat het nauwgezet volgen van de stappen die in de eerste en vierde sectie van het protocol worden beschreven, ervoor zorgt dat het maken van de handleidingen en het laadprotocol zal repliceren wat in deze publicatie wordt gerapporteerd. Zoals theoretisch kan worden voorspeld en experimenteel kan worden aangetoond, kan de middenashoek ten opzichte van de belastingsas van invloed zijn op de spanningen die de femurhals ervaart en de kans dat de breuk optreedt bij de femurhals. Eerdere groepen hebben aangetoond dat de hoek van de middenas de drukstijfheid en sterkte van het dijbeen aanzienlijk beïnvloedt wanneer het door de heupkop wordt geladen. Parametrische analyse van de effecten van hellingshoeken van de middenas toonde aan dat de maximale buigmomenten in de femurassen een minimum ervaren bij middenashoeken tussen 15° en 25°, wat ook de asstijfheid maximaliseert5. Deze hoek minimaliseert daarom de kans op compressiefracturen in de schacht en verhoogt de kans op buigfracturen in de femurhals.
Verschillende parameters kunnen de uitkomsten van een biomechanische test beïnvloeden en het vermogen om significante verschillen te detecteren als gevolg van fysiologisch relevante experimentele variabelen verstoren. Deze variabiliteit wordt verergerd door de kleine omvang van lange muizenbotten. Onder de parameters die aandacht vereisen in deze test, zijn met name het aantal vries-dooicycli en de hydratatietoestand van het bot, de belastingssnelheid en de uitlijning van de femurschacht ten opzichte van de belastingsas. Het protocol bepaalt dat alle monsters hetzelfde aantal vries-dooicycli doorlopen en een venster van 2 uur voor hydratatie in PBS bij kamertemperatuur. De laadsnelheid is ook ingesteld op een uniforme waarde van 0,5 mm/s3,4. Bovendien zijn 3D-geprinte geleiders ontworpen om het dijbeen tijdens de potstap consequent in een middenashoek van ~ 20 ° te plaatsen. Dit resulteerde in consistente middenashoeken in het bereik van 18° tot 24°, zonder significante geslachtseffecten als gevolg van anatomische verschillen en variatiecoëfficiënten van respectievelijk 7,6% en 6,5% voor mannelijke en vrouwelijke muizen. Deze handleidingen zijn toegankelijk, eenvoudig aan te passen met behulp van standaard solide modelleringssoftware en op aanvraag gereproduceerd met behulp van een goedkope desktop 3D-printer.
De representatieve resultaten toonden aan dat het testprotocol gevoelig is voor subtiele fysiologische verschillen, zoals geslacht, met een redelijke steekproefgrootte van n = 10. Een retrospectieve vermogensanalyse die rekening houdt met experimenteel bepaalde grootte-effecten (δ = Δmean/SD) bij n = 10 suggereerde dat het vermogen werd geschat op respectievelijk 57% voor de maximale belasting bij uitval (δ = 0,8), >95% voor de stijfheid (δ = 1,77) en de maximale verplaatsing (δ = 1,9) en 83% voor het werk tot falen (δ = 1,77). Samen met de kleine variatiecoëfficiënten (tabel 1) bevestigt deze vermogensanalyse dat de variatie in de pothoek de gevoeligheid en betrouwbaarheid van het protocol nadelig heeft beïnvloed.
De subjectieve analyse van de wijze van falen toonde ook aan dat 100% van de geteste monsters faalden in de femurhals, omdat ze allemaal een gespleten fractuur vertoonden, waarbij één breuklijn parallel liep aan de schacht op de plaats waar deze de nek ontmoet en een andere breuklijn loodrecht op de femurhals aan de top van de bifurcatie. Dit omvat kenmerken van twee klinisch relevante vormen van femurhalsfracturen; de intertrochantere en transcervicale nekfracturen15. Femorale nek cantilever bending tests worden niet zo vaak gebruikt en beschreven in de literatuur als standaard torsie of flexure testen van femorale en tibiale midshafts in knaagdier modellen van osteoporose. Slechts een handvol studies werden geïdentificeerd om dergelijke protocollen te beschrijven met behulp van muis- en rattenmodellen5,7,8,9,16,17. De hoek waaronder de dijbenen tijdens het testen werden geplaatst, wordt niet altijd gemeld. Sommigen met gedetailleerde beschrijvingen gebruiken een overmatige hoeveelheid aangepaste armaturen en software om hun monsters uit te lijnen5, maar nemen nog steeds hun toevlucht tot oppotten met de hand, waardoor dezelfde menselijke fout in andere protocollen wordt geïntroduceerd.
Dit protocol is ontworpen voor muizenmonsters en is gespecificeerd voor C57Bl/6-muizen, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan grote diermodellen of andere muizenstammen met verschillende femorale geometrie. Toekomstige onderzoekers die dit protocol gebruiken, moeten mogelijk de hoeveelheid blootgesteld bot wijzigen, omdat de derde trochanter mogelijk niet precies 7 mm distaal van de heupkop verwijderd is. Aanvullende wijzigingen in het protocol omvatten het gebruik van een verhardingsmiddel dat na het testen kan worden verzacht om het monster vrij te geven als verdere tests gewenst zijn. Dit kan worden gedaan met een bismutlegering die na het testen in een warmwaterbad kan worden gesmolten om het monster vrij te geven7. De uiteindelijke wijziging die gebruikers aan dit protocol konden aanbrengen, wordt ontweken in stap 3.1, namelijk het type en de positionering van de loadcel. Een axiale loadcel moet worden gebruikt met een resolutie van minder dan 1 N. Een loadcel van 50 N zou geschikt zijn op basis van de maximaal waargenomen belastingen. Bovendien moet een loadcel worden gebruikt die alleen spanning of compressie meet om te voorkomen dat de loadcel een samengesteld buigmoment ervaart als gevolg van excentrische belasting ten opzichte van de loadcel. Een andere manier om compoundingkrachtmetingen te voorkomen, is door de loadcel aan de actuator te bevestigen om ervoor te zorgen dat de belastingskracht in lijn is met de loadcel.
Dit protocol vereenvoudigt de behoefte aan aangepaste armaturen, beschrijft hoe gidsen kunnen worden afgedrukt op elke in de handel verkrijgbare 3D-printer en maakt gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur om monsters grondig en reproduceerbaar te testen, zoals blijkt uit de lagere variatiecoëfficiënten die in de huidige studie zijn gerapporteerd (tabel 1). Dit protocol wordt echter niet beperkt door de noodzaak van een 3D-printer. Er bestaan commercieel beschikbare oplossingen, waarbij de 3D-renderingbestanden naar drukkerijen kunnen worden verzonden en de onderdelen kunnen worden teruggestuurd. Bovendien simuleert deze manier van buigende belasting op de femurhals de locatie en soorten fracturen die klinisch worden aangetroffen. Met het aantal mensen met een hoog risico op fragiliteitsfracturen, wordt voorspeld dat er in 205018 elk jaar meer dan 21,3 miljoen heupfracturen zullen zijn. De immense maatschappelijke, financiële en medische last die dit met zich meebrengt, betrouwbare tests in knaagdiermodellen kunnen de striktheid en reproduceerbaarheid verbeteren van onderzoek gericht op het begrijpen van de etiologie van osteoporose en therapeutica om het effectief te behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door de NIH P30AR069655 en R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
- Reports of the Surgeon General. Health and Osteoporosis: A Report of the Surgeon General. Reports of the Surgeon General. , (2004).
- Veronese, N., Maggi, S. Epidemiology and social costs of hip fracture. Injury. 49 (8), 1458-1460 (2018).
- Gurumurthy, C. B., Lloyd, K. C. K. Generating mouse models for biomedical research: Technological advances. Disease Models and Mechanisms. 12 (1), 029462 (2019).
- Boymans, T. A. E. J., Veldman, H. D., Noble, P. C., Heyligers, I. C., Grimm, B. The femoral head center shifts in a mediocaudal direction during aging. Journal of Arthroplasty. 2 (32), 581-586 (2017).
- Voide, R., van Lenthe, G. H., Muller, R. Femoral stiffness and strength critically depend on loading angle: A parametric study in a mouse-inbred strain. Biomedical Engineering. 53 (3), 122-129 (2008).
- CRC Press. Bone Mechanics Handbook. Second end. , CRC Press. (2001).
- Middleton, K. M., et al. The relative importance of genetics and phenotypic plasticity in dictating bone morphology and mechanics in aged mice: evidence from an artificial selection experiment. Zoology (Jena). 111 (2), 135-147 (2008).
- Jamsa, T., Koivukangas, A., Ryhanen, J., Jalovaara, P., Tuukkanen, J. Femoral neck is a sensitive indicator of bone loss in immobilized hind limb of mouse. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1708-1713 (1999).
- Kamal, B., et al. Biomechanical properties of bone in a mouse model of Rett syndrome. Bone. 71, 106-114 (2015).
- Jamsa, T., Tuukkanen, J., Jalovaara, P. Femoral neck strength of mouse in two loading configurations: Methods evaluation and fracture characteristics. Journal of Biomechanics. 31 (8), 723-729 (1998).
- Brent, M. B., Bruel, A., Thomsen, J. S. PTH (1-34) and growth hormone in prevention of disuse osteopenia andsarcopenia in rats. Bone. 110, 244-253 (2018).
- Bromer, F. D., Brent, M. B., Pedersen, M., Thomsen, J. S., Bruel, A., Foldager, C. B. The effect of normobaric intermittent hypoxia therapy on bone in normal and disuse osteopenic mice. High Altitude Medicine and Biology. 22 (2), 225-234 (2021).
- Vegger, J. B., Bruel, A., Brent, M. B., Thomsen, J. S. Disuse osteopenia induced by botulinum toxin is similar in skeletally mature young and aged female C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36, 170-179 (2018).
- Lodberg, A., Vegger, J. B., Jensen, M. V., Larsen, C. M., Thomsen, J. S., Bruel, A. Immobilization induced osteopenia is strain specific in mice. Bone Reports. 2, 59-67 (2015).
- Varacallo, M. A., Fox, E. J.
- Melhus, G., et al. Experimental osteoporosis induced by ovariectomy and vitamin D deficiency does not markedly affect fracture healing in rats. Acta Orthopaedica. 78 (3), 393-403 (2007).
- Runge, W. O., et al. Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).
- Neustadt, J. Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).
