Summary
Il presente protocollo descrive lo sviluppo di una piattaforma di prova riproducibile per colli femorali murini in un set-up di flessione a sbalzo. Sono state utilizzate guide personalizzate stampate in 3D per fissare in modo coerente e rigido i femori in un allineamento ottimale.
Abstract
Le fratture nel collo del femore sono un evento comune negli individui con osteoporosi. Molti modelli murini sono stati sviluppati per valutare gli stati patologici e le terapie, con test biomeccanici come misura di esito primario. Tuttavia, i test biomeccanici tradizionali si concentrano su test di torsione o flessione applicati all'albero medio delle ossa lunghe. Questo non è in genere il sito di fratture ad alto rischio in individui osteoporotici. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo di test biomeccanico che testa i colli femorali dei femori murini nel carico di flessione a sbalzo per replicare meglio i tipi di fratture sperimentate dai pazienti con osteoporosi. Poiché i risultati biomeccanici dipendono fortemente dalla direzione di carico flessionale rispetto al collo del femore, sono state create guide stampate in 3D per mantenere un albero femorale con un angolo di 20 ° rispetto alla direzione di carico. Il nuovo protocollo ha semplificato i test riducendo la variabilità nell'allineamento (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) e migliorando la riproducibilità nei risultati biomeccanici misurati (COV medio = 26,7%). Il nuovo approccio che utilizza le guide stampate in 3D per un allineamento affidabile dei campioni migliora il rigore e la riproducibilità riducendo gli errori di misurazione dovuti al disallineamento del campione, che dovrebbe ridurre al minimo le dimensioni del campione negli studi sui topi sull'osteoporosi.
Introduction
Il rischio di fratture è una seria preoccupazione medica associata all'osteoporosi. Oltre 1,5 milioni di fratture da fragilità sono segnalate ogni anno solo negli Stati Uniti, con fratture che si verificano nell'anca, in particolare nel collo del femore, come il tipo di frattura principale1. Si stima che il 18% delle donne e il 6% degli uomini sperimenteranno una frattura del collo del femore nel corso della loro vita2 e il tasso di mortalità a 1 anno dopo la frattura è superiore al 20%1. Pertanto, i modelli murini che consentono test biomeccanici del collo femorale possono essere adatti per studiare le fratture da fragilità. I modelli murini offrono anche potenti strumenti per chiarire gli eventi cellulari e molecolari traducibili coinvolti potenzialmente nell'osteoporosi. Ciò è dovuto alla disponibilità di reporter genetici, ai modelli di guadagno e perdita di funzione e all'ampia libreria di tecniche molecolari e reagenti. I test meccanici delle ossa di topo possono fornire le misure di esito necessarie per determinare la salute delle ossa, le variazioni genotipiche e fenotipiche che potrebbero spiegare l'eziologia della malattia e valutare le terapie in base alle misure di esito della qualità dell'osso e del rischio di frattura3.
L'anatomia del collo femorale crea scenari di carico meccanico unici, che in genere portano a fratture flessionali (flessione). La testa del femore è caricata nella presa acetabolare all'estremità prossimale del femore. Ciò crea uno scenario di flessione a sbalzo sul collo del femore, che è rigidamente attaccato all'albero femorale distalmente4. Questo differisce dai tradizionali test di flessione a 3 o 4 punti sulla diafisi media femorale. Sebbene questi test siano utili, non replicano il carico che in genere porta a fratture da fragilità in individui osteopenici e osteoporotici in termini di posizione della frattura o dello scenario di carico.
Per valutare meglio il rischio di frattura da fragilità nei topi, è stato cercato di migliorare la riproducibilità dei test di flessione a sbalzo dei colli femorali murini. Come teoricamente previsto, l'angolo di carico sulla testa del femore rispetto all'albero femorale ha dimostrato di influenzare in modo significativo le misure di esito5, creando così una sfida per l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati riportati. Per garantire un allineamento corretto e coerente dei femori durante la preparazione del campione, sono state progettate guide e stampate in 3D sulla base di misurazioni anatomiche effettuate su scansioni μCT di femori di topo C57BL / 6. Le guide sono state progettate per aiutare a invasare costantemente i campioni in modo tale che l'albero femorale sia mantenuto a ~ 20 ° dalla direzione di carico verticale. Questo angolo è stato scelto perché massimizza la rigidità riducendo al minimo il momento di flessione massima lungo l'albero femorale, che aumenta la probabilità di fratture del collo del femore e porta a test più coerenti e riproducibili5. Le guide sono state stampate in 3D in varie dimensioni per adattarsi alle differenze anatomiche tra i campioni e utilizzate per tenere i campioni in una posizione stabile durante l'invasatura in cemento osseo acrilico. La rigidità, la forza massima, la forza di snervamento e l'energia massima sono state calcolate dai grafici forza-spostamento. Questo metodo di test ha mostrato risultati coerenti per il suddetto risultato biomeccanico. Con la pratica e l'aiuto della guida stampata in 3D, gli errori di misurazione dovuti al disallineamento possono essere ridotti al minimo, con conseguenti misure di risultato affidabili.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi utilizzati in questo studio erano C57BL / 6 maschi e femmine di età compresa tra 24 e 29 settimane di età. I topi erano alloggiati in condizioni standard con cibo e acqua ad libitum. Dopo l'eutanasia per inalazione di anidride carbonica, seguita da lussazione cervicale, 20 femori destri (10 maschi e 10 femmine) sono stati raccolti e congelati a -20 ° C fino al test.
1. Creazione di guide di montaggio personalizzate stampate in 3D
NOTA: questo passaggio potrebbe essere necessario perché diversi ceppi e fenotipi genetici potrebbero avere geometrie anatomiche diverse.
- Ottenere scansioni μCT dei campioni rappresentativi.
- Scansione di campioni rappresentativi su uno scanner μCT con le seguenti impostazioni: 55 kV, 145 μA per tempi di integrazione di 300 ms e risoluzione di voxel da 10,5 μm.
- Assicurarsi che la regione catturata copra l'estremità prossimale del femore e continui verso il basso attraverso l'albero centrale.
NOTA: se uno scanner μCT non è disponibile, è possibile utilizzare i raggi X planari 2D dei campioni rappresentativi.
- Analizzare le scansioni μCT.
- Utilizzando il set rappresentativo di scansioni μCT, ottenere un rendering 2D della vista anteriore del femore prossimale.
- Ottenere immagini μCT con una risoluzione di 10,5 μm voxel dal midshaft all'estremità prossimale del femore. Compilare queste sezioni utilizzando il software (vedere Tabella dei materiali) in un rendering 3D dell'esempio.
- Determinare una soglia per distinguere l'osso dal tessuto circostante e applicare un filtro gaussiano per la riduzione del rumore.
- Orientate i rendering 3D per eliminare l'inclinazione fuori asse e assicurarvi che la superficie anteriore del femore venga visualizzata.
- Esportate questa vista 2D del rendering 3D come file di immagine, ad esempio .jpg o .png.
- Utilizzando un software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali), misurare l'angolo dell'albero femorale disegnando una linea perpendicolare all'albero femorale di 7 mm distalmente e una seconda linea attraverso il picco del trocantere maggiore fino al punto medio della suddetta linea perpendicolare (Figura 1).
- Lungo la linea perpendicolare distale di 7 mm, misurare il diametro dell'albero femorale al di sotto del terzo trocantere.
- Utilizzando il set rappresentativo di scansioni μCT, ottenere un rendering 2D della vista anteriore del femore prossimale.
Figura 1: analisi μCT. Le immagini μCT dei femori dei topi C57Bl/6 vengono utilizzate per calcolare l'angolo medio dell'albero, misurato dalla parte superiore del trocantere maggiore attraverso il centro dell'albero medio, ~ 7 mm distalmente. Anche il diametro dell'albero centrale è stato misurato in questa posizione. I rendering 3D del femore prossimale sono stati orientati in una vista anteriore per visualizzare il profilo del terzo trocantere. L'angolo medio dell'albero era di 93,13° (SD = 1,19°) e il diametro medio dell'albero centrale era di 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Creare le guide di montaggio utilizzando un programma software di modellazione 3D (vedere Tabella dei materiali) (Figura 2, File supplementare 1).
NOTA: Le guide sono cuboidi rettangolari che misurano 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm con una fessura angolata, leggermente più grande del diametro medio dell'albero determinato nel passaggio 1.1.2. L'angolo della fessura creerà un angolo coerente di 20° dalla verticale. Le guide devono essere coerenti in lunghezza, altezza e larghezza, ma possono essere realizzate con vari diametri di fessure per adattarsi alle differenze anatomiche tra i campioni ossei.
Figura 2: Progettazione delle guide. (A) Schizzo 3D e (B) visualizzazione del dispositivo di pesca dell'albero centrale prima della stampa 3D. Sulla base della letteratura precedente, un angolo dell'albero medio compreso tra 20 ° massimizza la rigidità. Riduce al minimo il momento flettente massimo nell'albero del femore per garantire che si verifichino fratture al collo e variabilità nei risultati meccanici5. Per compensare la deviazione di 3,13° dagli angoli medi perpendicolari nell'albero medio, l'angolo di fissaggio è stato impostato su 73,13° per produrre un angolo di 20°. I dispositivi di allineamento sono stati stampati con diametri che vanno da 1,9 a 2,2 mm per garantire una vestibilità adeguata ai diametri dell'albero centrale variabili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Utilizzando una stampante 3D, stampare le guide. Le guide possono rimanere accese durante il processo di test, quindi la stampa di più repliche delle guide può essere utile per preparare più campioni contemporaneamente.
2. Preparazione del campione
- Raccogli i femori del topo facendo un'incisione trasversale interamente intorno all'addome del topo e rimuovendo il tessuto dall'incisione alle caviglie. Successivamente, individuare la presa dell'anca e utilizzare attentamente la punta di un paio di pinze sottili per dislocare l'anca. Tagliare i tessuti molli aggiuntivi per rimuovere la gamba dal mouse.
- Una volta che la gamba è stata raccolta, utilizzare un bisturi per dislocare e tagliare l'articolazione del ginocchio. Pulire manualmente i femori di tutti i tessuti molli usando pinze, bisturi e asciugamani di carta.
- Testare immediatamente i campioni raccolti o conservarli a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Se i campioni sono congelati, lasciarli arrivare a temperatura ambiente e idratarsi in PBS per 2 ore prima della preparazione.
- Utilizzando tubi quadrati in alluminio da 1/4 "x 1/4" (vedi Tabella dei materiali), tagliare sezioni di tubi da 1/2 "a 1" di lunghezza. Utilizzando uno strumento di incisione, etichettare ogni segmento di alluminio con gli ID campione.
- Riempire metà dei segmenti di tubo con stucco. Posizionare questi segmenti di tubo in un dispositivo per tenerli in posizione verticale.
- Posiziona i femori puliti nelle guide stampate in 3D. Per fare ciò, posizionare i campioni in piano sul banco in modo che la superficie anteriore sia rivolta verso l'alto. Posizionare la guida direttamente sotto il terzo trocantere, dove il diametro dell'albero diventa più consistente.
NOTA: Questo lascerà ~ 7 mm del femore prossimale sopra la guida. - Per evitare che il femore ruoti sul lato laterale o mediale durante il posizionamento sulla guida, tenere le estremità prossimale e distale con una mano quando si applicano le guide, premere saldamente il femore sul banco da lavoro e, usando l'altra mano, posizionare la guida stampata in 3D sul mesoalbero del femore. Assicurarsi di applicare delicatamente la guida del diametro appropriato, poiché l'albero centrale del femore può scattare se forzato in una guida troppo piccola.
- Una volta che le guide sono sui femori, posizionale davanti ai segmenti di alluminio corrispondenti. Utilizzando cemento osseo o altri agenti indurenti, riempire i segmenti di alluminio fino a quando non sono pieni, lasciando un po 'di spazio per lo spostamento.
- Posizionare i femori con le guide nel segmento di alluminio corretto.
NOTA: Le guide non saranno centrate sui segmenti di alluminio, sedute leggermente su un lato per consentire all'estremità distale del femore di sedersi al centro della pentola di alluminio. - Lasciare impostare l'agente indurente. Una volta impostato, posizionare i campioni in una capsula di Petri con soluzione salina tamponata con fosfato a temperatura ambiente (PBS) e lasciare reidratare per 2 ore (Figura 3).
Figura 3: Preparazione del campione utilizzando maschere personalizzate e dispositivi di pesca. (A) I campioni in vasi di alluminio con il corretto allineamento vengono mantenuti utilizzando le guide stampate in 3D mentre il cemento osseo si asciuga. (B) La radiografia prima del test mostra l'ombra dei dispositivi di pesca e la copertura completa del cemento osseo che circonda l'estremità distale dei femori. L'area bianca satura sul fondo dei vasi di alluminio è stucco, usato per mantenere il cemento osseo nei vasi durante l'indurimento. Barra della scala (pannello B) = 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Configurazione hardware
- Utilizzando un sistema di prova meccanico (MTS), collegare e calibrare una cella di carico con risoluzione <1 N (vedere Tabella dei materiali) (Figura 4A).
NOTA: La cella di carico può essere montata sul palco o, preferibilmente, sull'attuatore quando possibile. - Attaccare un dispositivo con una fessura quadrata che terrà saldamente i segmenti di alluminio con i campioni. Fissare le viti impostate ai due lati del dispositivo di fissaggio per tenere saldamente i campioni in posizione. (Figura 4B).
NOTA: questo dispositivo può essere stampato o lavorato in 3D e quindi maschiato con fori per viti filettati da montare sul telaio di prova. - Fissare una piastra di carico all'attuatore. Questa può essere semplicemente una vite affusolata con una punta appiattita (Figura 4C).
- Posizionare uno stereomicroscopio su un tavolo o una superficie direttamente di fronte all'MTS. Se è necessaria un'illuminazione aggiuntiva per vedere il set-up attraverso il microscopio, posizionarli attorno al sistema.
Figura 4: Configurazione hardware. (A) Impostazione delle prove su sistema di prova meccanico, con cella di carico da 1 kN (risoluzione < 1 N) e stadio biassiale nero per garantire il corretto posizionamento del campione. (B) Primo piano del dispositivo di montaggio stampato in 3D collegato alla cella di carico con un'asta filettata M10 e due bulloni M4 utilizzati per tenere in posizione la pentola in alluminio. (C) Visualizzazione del campione attraverso uno stereomicroscopio con un dispositivo di carico conico. Barra della scala (pannello C) = 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Configurazione del software
- Nel software MTS, iniziare la creazione di un nuovo protocollo di flessione (piegatura). Assicurarsi che il protocollo funzioni nel controllo degli spostamenti.
- Impostare la velocità di caricamento del protocollo su 0,5 mm/s.
- Se il software ha un'impostazione per i tasti soft, aggiungi i soft key "Balance" e "Zero Extension" al protocollo.
NOTA: questo imposterà rapidamente il carico e la posizione dell'attuatore su 0 prima di testare ogni campione. - Assicurarsi che il programma software registri il tempo in secondi, il carico in Newton e l'estensione o lo spostamento in millimetri a una frequenza di campionamento minima di 100 Hz.
- Salvare il nuovo protocollo e tornare alla schermata principale del programma software per iniziare a testare un nuovo set di campioni.
5. Configurazione dei test
- Prima di montare i campioni sull'MTS, ottenere un'immagine a raggi X dei campioni nei vasi di alluminio. È possibile creare immagini di più campioni contemporaneamente. Assicurarsi che la vista anteriore dei campioni venga acquisita per consentire misurazioni di verifica dell'angolo di invasatura (Figura 5).
Figura 5. Valutazione dell'allineamento del campione. (A) L'angolo dell'albero dalla verticale viene misurato dai raggi X digitali planari. (B) Gli angoli rappresentativi dell'albero femorale in vaso variavano da 18,11° a 23,99°, con un coefficiente di variazione (COV) del 7,1% (n = 20). Le differenze di sesso dovute a variazioni anatomiche non erano statisticamente significative, come determinato utilizzando un t-test spaiato a una coda (p < 0,05). Barra della scala (pannello A) = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Posizionare il segmento di alluminio con il campione nel dispositivo di fissaggio e stringere le viti del set.
- Attuatore inferiore/piastra di carico fino a quando non si trova a pochi millimetri dalla testa del femore.
NOTA: Non precaricare il campione con alcuna forza e fare attenzione a non abbassare l'attuatore troppo rapidamente, poiché è molto facile danneggiare i campioni. - Utilizzando lo stereomicroscopio, regolare lo stadio biassiale per allineare la posizione della testa del femore direttamente sotto la piastra di carico. Blocca lo stadio biassiale in posizione.
- Nel software MTS, azzerare la posizione dell'attuatore e bilanciare la cella di carico utilizzando i tasti soft aggiunti nel passaggio 4.3.
- Iniziare il protocollo di caricamento. A seconda di quanto spazio è rimasto tra la piastra di carico e il campione, il test richiederà solo 10-30 s.
- Dopo il test, acquisire un'altra radiografia anteriore del campione. Questo sarà usato per discernere e documentare la modalità di frattura (Figura 6).
Figura 6: Immagine a raggi X dei campioni dopo il test. Tutti i campioni si sono fratturati in una linea biforcata attraverso il collo del femore e lungo l'attacco collo-albero del femore (evidenziato dal cerchio arancione). Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Analisi dei dati
- Dopo la raccolta dei dati, esporta i dati di forza e spostamento in un software (vedi Tabella dei materiali) che consente calcoli grafici e matematici.
- Traccia il carico rispetto a. spostamento per ciascun campione (Figura 7A). Adattare un'approssimazione lineare al segmento lineare della curva carico-spostamento. La pendenza di questa calzata lineare definirà la rigidità, una misura dell'elasticità del campione.
- Calcola i risultati aggiuntivi come carico massimo, spostamento massimo, carico di resa, spostamento al punto di snervamento, energia al carico massimo ed energia al punto di resa.
NOTA: il punto di snervamento può essere determinato disattivando l'approssimazione lineare determinata nel punto 6.2 dello 0,2%6. Punto in cui la linea di off-set e il carico vs. l'intersezione della curva di spostamento determinerà il punto di snervamento. Nel caso di campioni molto fragili che mostrano poca resa, il punto di snervamento può essere lo stesso del punto massimo.
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Representative Results
Quando invasati con l'aiuto della guida, gli alberi femorali sono stati allineati a 21,6 ° ± 1,5 °. Mentre questo rappresenta una deviazione del <10% dall'angolo previsto di 20°, i coefficienti di variazione (COV) dell'angolo di invasatura su tutti i campioni testati erano rispettivamente del 7,6% e del 6,5% per topi maschi e femmine (n = 10 per gruppo) come verificato dai raggi X planari pre-test (Figura 5). Inoltre, i raggi X post-test dovrebbero essere utilizzati per valutare la modalità in cui i campioni hanno fallito. Il fallimento è stato costantemente osservato nei colli femorali, come previsto, in modo biforcato, con una linea di frattura parallela all'albero femorale e l'altra linea perpendicolare al collo del femore (Figura 6). Se dovessero verificarsi variazioni significative nel modello di rottura tra i campioni, la qualità ossea dei campioni potrebbe essere ulteriormente valutata tramite μCT misurando risultati come densità minerale ossea volumetrica, spessore trabecolare e corticale, spaziatura e mineralizzazione. Se il fallimento non è costantemente indotto nel collo del femore, le guide stampate in 3D possono essere regolate.
Le misure di esito biomeccanico qui riportate sono coerenti con i valori riportati in simili flessioni assiali delle configurazioni del collo femorale7,8,9,10,11,12,13,14. Tuttavia, l'allineamento coerente ottenuto utilizzando le guide stampate in 3D ha generalmente migliorato il COV del carico massimo in particolare (Tabella 1).
| Studio attuale | Sesso | Angolo dell'albero centrale | Carico massimo | Rigidità | Lavoro fino al fallimento |
| Maschio | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Femmina | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Maschio | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | Maschio | NR | 19% | NR | NR |
| Kamal et al9 | Femmina | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| Middleton et al7 | Femmina | NR | 24%-27% | NR | NR |
| Brent et al11 | Femmina - ratti | NR | 18%-24% | NR | NR |
| Bromer et al12* | Femmina | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | Femmina | NR | 16%-32% | NR | NR |
| Lodberg14* | Femmina | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: Non segnalato | |||||
| *: Dati estrapolati dai dati pubblicati | |||||
Tabella 1: Coefficienti di variazione per le proprietà di flessione misurate dei colli femorali di topo. I coefficienti di variazione rappresentano un rapporto tra la deviazione standard e la media di un set di dati. Man mano che il COV diminuisce, ciò indica un raggruppamento più stretto dei singoli punti dati attorno alla media. Questo protocollo ha ridotto il COV per il carico massimo rispetto ad altre pubblicazioni che eseguono test simili.
Come previsto, sono state osservate differenze di sesso nelle proprietà meccaniche misurate. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando un t-test spaiato a una coda. I colli femorali di topi maschi erano significativamente più forti e più rigidi rispetto ai campioni di topi femmina (p = 0,009 e p = 0,0006, rispettivamente). Inoltre, i colli femorali femminili hanno sperimentato deformazioni più significative (p = 0,014) e hanno lavorato fino al fallimento (p = 0,024) rispetto ai campioni di topi maschi (Figura 7). Ciò è coerente con la minore densità minerale ossea nelle femmine e sottolinea la sensibilità del test per rilevare differenze fisiologicamente rilevanti. Nelle coorti di topi maschi e femmine utilizzate in questo studio, la densità minerale ossea dei topi femmina era significativamente inferiore rispetto alle loro controparti maschili, come determinato da una scansione assorbimetrica a raggi X a doppia energia (DEXA) e da un t-test spaiato a una coda (p = 0,036).
Figura 7: Risultati biomeccanici. (A) Una curva di forza-spostamento rappresentativa, che mostra un adattamento lineare offset dello 0,2%, viene utilizzata per derivare la rigidità e il punto di snervamento. Le misure di risultato selezionate sono tracciate a dispersione che mostrano la media e la deviazione standard, tra cui (B) carico massimo (al guasto), (C) rigidità, (D) spostamento massimo (al guasto) e (E) lavoro al fallimento (area sotto la curva fino al punto di guasto). Gli asterischi indicano differenze significative determinate utilizzando un t-test accoppiato a una coda (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 per coorte sessuale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per confermare che le lievi variazioni nell'angolo di invasatura non hanno contribuito alla variabilità sperimentale, ogni misura di esito biomeccanico è stata tracciata rispetto all'angolo di invasatura ed eseguita una semplice regressione lineare per la coorte maschile, la coorte femminile e tutti i campioni raggruppati insieme (Figura 8). È stata quindi testata l'ipotesi che la pendenza di regressione lineare non sia zero. L'analisi di regressione ha dimostrato che, ad eccezione della rigidità, le lievi variazioni dell'angolo di invasatura (intervallo da 18° a 24°) non hanno influenzato le misure di esito biomeccanico. Per la rigidità, c'era una significativa correlazione lineare con l'angolo di invasatura (R2 = 0,29, p < 0,05).
Figura 8: Effetto dell'angolo di invasatura sui risultati biomeccanici. Le misure di esito biomeccanico, tra cui (A) carico massimo, (B) rigidità, (C) spostamento massimo e (D) lavoro al fallimento sono state tracciate rispetto all'angolo di invasatura e correlate utilizzando una semplice regressione lineare per la coorte maschile, la coorte femminile e tutti i campioni raggruppati insieme. Le linee nere solide mostrano la regressione lineare dei campioni raggruppati, con linee tratteggiate che indicano intervalli di confidenza. La variabilità dell'angolo di invasatura non ha influenzato in modo significativo il carico massimo, lo spostamento massimo o il lavoro di guasto. Tuttavia, all'aumentare dell'angolo di invasatura, la rigidità aumentava, come determinato da un test di Pearson (p = 0,0126, n = 20). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Lingua triangolare standard (. STL) delle guide. Questo file può essere utilizzato per stampare le guide descritte nel protocollo. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo protocollo delinea un test di flessione a sbalzo affidabile per i colli femorali murini. Lo scenario naturale di flessione a sbalzo che si verifica al collo del femore non è in genere rappresentato nei test di flessione standard a 3 e 4 punti5. Questo metodo di test è migliore e replica in modo più affidabile il tipo di fratture del collo del femore sperimentate dai pazienti con fragilità ossea. L'obiettivo principale quando si esegue questo protocollo è eliminare la variabilità dovuta all'invasatura incoerente dell'albero femorale. Criticamente, seguendo da vicino i passaggi delineati nella prima e nella quarta sezione del protocollo si assicurerà che la creazione delle guide e del protocollo di caricamento replichi quanto riportato in questa pubblicazione. Come si può teoricamente prevedere e dimostrare sperimentalmente, l'angolo dell'albero medio rispetto all'asse di carico può influenzare le sollecitazioni sperimentate dal collo femorale e la probabilità che la frattura si verifichi al collo del femore. Gruppi precedenti hanno dimostrato che l'angolo dell'albero medio influenza in modo significativo la rigidità e la resistenza compressiva del femore quando viene caricato attraverso la testa del femore. L'analisi parametrica degli effetti degli angoli di inclinazione dell'albero centrale ha mostrato che i momenti di flessione massima negli alberi femorali sperimentano un minimo agli angoli dell'albero centrale compresi tra 15 ° e 25 °, il che massimizza anche la rigidità dell'albero5. Questo angolo, quindi, riduce al minimo la probabilità di fratture da compressione nell'albero e aumenta la probabilità di fratture flessionali nel collo del femore.
Diversi parametri potrebbero influenzare i risultati di qualsiasi test biomeccanico e confondere la capacità di rilevare differenze significative dovute a variabili sperimentali fisiologicamente rilevanti. Questa variabilità è aggravata dalle piccole dimensioni delle lunghe ossa di topo. Tra i parametri che richiedono attenzione in questo test, in particolare, ci sono il numero di cicli di congelamento-disgelo e lo stato di idratazione dell'osso, la velocità di carico e l'allineamento dell'albero femorale rispetto all'asse di carico. Il protocollo prevede che tutti i campioni passino attraverso lo stesso numero di cicli di congelamento-disgelo e una finestra di 2 ore per l'idratazione in PBS a temperatura ambiente. Anche la velocità di carico è impostata su un valore uniforme di 0,5 mm/s3,4. Inoltre, le guide stampate in 3D sono state progettate per posizionare costantemente il femore con un angolo dell'albero centrale di ~ 20 ° durante la fase di invasatura. Ciò ha portato ad angoli costanti dell'albero medio nell'intervallo da 18 ° a 24 °, senza effetti sessuali significativi a causa di differenze anatomiche e coefficienti di variazione del 7,6% e del 6,5% rispettivamente per topi maschi e femmine. Queste guide sono accessibili, facilmente modificabili utilizzando il software di modellazione solida standard e riprodotte su richiesta utilizzando una stampante 3D desktop economica.
I risultati rappresentativi hanno dimostrato che il protocollo di test è sensibile a sottili differenze fisiologiche, come il sesso, con una dimensione ragionevole del campione di n = 10. Un'analisi retrospettiva della potenza che tiene conto degli effetti dimensionali determinati sperimentalmente (δ = Δmean/SD) a n = 10 ha suggerito che la potenza è stata stimata rispettivamente al 57% per il carico massimo al guasto (δ = 0,8), >95% per la rigidità (δ = 1,77) e lo spostamento massimo (δ = 1,9) e all'83% per il lavoro a guasto (δ = 1,77). Insieme ai piccoli coefficienti di variazione (Tabella 1), questa analisi di potenza conferma che la variazione dell'angolo di invasatura ha influenzato negativamente la sensibilità e l'affidabilità del protocollo.
L'analisi soggettiva della modalità di fallimento ha anche dimostrato che il 100% dei campioni testati ha fallito nel collo del femore, poiché tutti hanno mostrato una frattura biforcata, con una linea di frattura che corre parallela all'albero nel sito in cui incontra il collo e un'altra linea di frattura perpendicolare al collo del femore all'apice della biforcazione. Ciò comprende le caratteristiche di due modalità clinicamente rilevanti di fratture del collo del femore; le fratture intertrocanteriche e transcervicali del collo15. I test di flessione a sbalzo del collo femorale non sono così comunemente usati e descritti in letteratura come i test standard di torsione o flessione degli alberi medi femorali e tibiali nei modelli di osteoporosi dei roditori. Solo una manciata di studi sono stati identificati per descrivere tali protocolli utilizzando modelli di topi e ratti5,7,8,9,16,17. L'angolo in cui i femori sono stati posizionati durante il test non è sempre riportato. Alcuni con descrizioni dettagliate utilizzano una quantità eccessiva di dispositivi e software personalizzati per allineare i loro campioni5 ma ricorrono comunque all'invasatura manuale, introducendo lo stesso errore umano in altri protocolli.
Questo protocollo è progettato per campioni murini ed è specificato per topi C57Bl/6, ma potrebbe essere facilmente adattato a modelli animali di grandi dimensioni o altri ceppi murini con geometria femorale diversa. I futuri sperimentatori che utilizzano questo protocollo potrebbero dover modificare la quantità di osso esposto, poiché il terzo trocantere potrebbe non essere esattamente di 7 mm distalmente dalla testa del femore. Ulteriori modifiche al protocollo includono l'utilizzo di un agente di protezione avanzato che può essere ammorbidito dopo il test per rilasciare il campione se si desidera ulteriori test. Questo potrebbe essere fatto con una lega di bismuto che potrebbe essere sciolta in un bagno di acqua calda dopo il test per rilasciare il campione7. La modifica finale che gli utenti potrebbero apportare a questo protocollo è elusa nel passaggio 3.1, essendo il tipo e il posizionamento della cella di carico. Una cella di carico assiale deve essere utilizzata con risoluzione inferiore a 1 N. Una cella di carico da 50 N sarebbe appropriata in base ai carichi massimi osservati. Inoltre, una cella di carico che misura solo la tensione o la compressione dovrebbe essere utilizzata per evitare qualsiasi momento di flessione composto che la cella di carico può sperimentare dal carico eccentrico rispetto alla cella di carico. Un altro modo per evitare misurazioni della forza di compounding sarebbe quello di fissare la cella di carico all'attuatore per garantire che la forza di carico sia in linea con la cella di carico.
Questo protocollo semplifica la necessità di dispositivi personalizzati, descrive come le guide possono essere stampate su qualsiasi stampante 3D disponibile in commercio e utilizza le comuni apparecchiature di laboratorio per testare accuratamente e riproducibilmente i campioni, come dimostrato dai coefficienti di variazione più bassi riportati nello studio corrente (Tabella 1). Tuttavia, questo protocollo non è limitato dalla necessità di una stampante 3D. Esistono soluzioni disponibili in commercio, in cui i file di rendering 3D possono essere inviati alle società di stampa e le parti possono essere rispedite. Inoltre, questa modalità di carico di flessione sul collo del femore simula la posizione e i tipi di fratture clinicamente riscontrate. Con il numero di persone ad alto rischio di fratture da fragilità, si prevede che ci saranno oltre 21,3 milioni di fratture dell'anca ogni anno entro il 205018. L'immenso onere sociale, finanziario e medico che ciò comporta, test affidabili nei modelli di roditori possono migliorare il rigore e la riproducibilità della ricerca orientata alla comprensione dell'eziologia dell'osteoporosi e delle terapie per trattarla efficacemente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato supportato dal NIH P30AR069655 e R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
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