Summary
O presente protocolo descreve o desenvolvimento de uma plataforma de teste reprodutível para pescoços femorais murinos em uma configuração de dobra cantilever. Guias impressos 3D personalizados foram usados para fixar de forma consistente e rígida os fêmures no alinhamento ideal.
Abstract
Fraturas no pescoço femoral são uma ocorrência comum em indivíduos com osteoporose. Muitos modelos de camundongos foram desenvolvidos para avaliar estados e terapias da doença, com testes biomecânicos como medida de desfecho primário. No entanto, os testes biomecânicos tradicionais se concentram em testes de torção ou dobra aplicados no eixo médio dos ossos longos. Este não é tipicamente o local de fraturas de alto risco em indivíduos osteoporóticos. Assim, foi desenvolvido um protocolo de teste biomecânico que testa os pescoços femorais dos fêmures murinas no carregamento de dobra cantilever para replicar melhor os tipos de fraturas experimentadas pelos pacientes com osteoporose. Uma vez que os desfechos biomecânicos são altamente dependentes da direção de carga flexural em relação ao pescoço femoral, foram criadas guias impressas em 3D para manter um eixo femoral em um ângulo de 20° em relação à direção de carga. O novo protocolo agilizou os testes reduzindo a variabilidade no alinhamento (21,6° ± 1,5°, COV = 7,1%, n = 20) e melhor reprodutibilidade nos desfechos biomecânicos medidos (COV médio = 26,7%). A nova abordagem utilizando as guias impressas em 3D para um alinhamento confiável da amostra melhora o rigor e a reprodutibilidade, reduzindo os erros de medição devido ao desalinhamento da amostra, o que deve minimizar o tamanho da amostra em estudos de camundongos de osteoporose.
Introduction
O risco de fratura é uma preocupação médica séria associada à osteoporose. Mais de 1,5 milhão de fraturas por fragilidade são relatadas a cada ano apenas nos Estados Unidos, com fraturas ocorrendo no quadril, especificamente no pescoço do fêmur, como a fratura principal tipo1. Estima-se que 18% das mulheres e 6% dos homens sofrerão uma fratura no pescoço femoral durante a vida2, e a taxa de mortalidade em 1 ano após a fratura é superior a 20%1. Portanto, modelos de camundongos que permitem testes biomecânicos do pescoço femoral podem ser adequados para o estudo de fraturas de fragilidade. Modelos de camundongos também oferecem ferramentas poderosas para elucidar eventos celulares e moleculares traduzíveis envolvidos na osteoporose potencialmente. Isso se deve à disponibilidade de repórteres genéticos, ao ganho e perda de modelos de função e à extensa biblioteca de técnicas moleculares e reagentes. Testes mecânicos de ossos de camundongos podem fornecer medidas de desfecho necessárias para determinar a saúde óssea, variações genotípicas e fenotípicas que poderiam explicar a etiologia da doença, e avaliar terapias baseadas em medidas de desfecho da qualidade do osso e do risco de fratura3.
A anatomia do pescoço femoral cria cenários de carregamento mecânico únicos, que normalmente levam a fraturas flexis (dobras). A cabeça femoral é carregada no soquete acetabular na extremidade proximal do fêmur. Isso cria um cenário de dobra cantilever no pescoço femoral, que é rigidamente ligado ao eixo femoral distally4. Isso difere dos testes tradicionais de dobra de 3 ou 4 pontos na diafísica média femoral. Embora esses testes sejam úteis, eles não replicam o carregamento que normalmente leva a fraturas de fragilidade em indivíduos osteopenicos e osteoporóticos em termos de localização da fratura ou do cenário de carregamento.
Para avaliar melhor o risco de fratura de fragilidade em camundongos, buscou-se melhorar a reprodutibilidade dos testes de dobra cantilever dos pescoços femorais murinos. Como teoricamente previsto, o ângulo de carga na cabeça femoral em relação ao eixo femoral tem sido mostrado para afetar significativamente as medidas de desfecho5, criando assim um desafio para a confiabilidade e reprodutibilidade dos desfechos relatados. Para garantir o alinhamento adequado e consistente dos fêmures durante a preparação da amostra, foram projetadas guias e impressas em 3D com base em medições anatômicas feitas em escaneamentos μCT de fêmures de camundongos C57BL/6. Os guias foram projetados para ajudar a envasar consistentemente as amostras de modo que o eixo femoral seja mantido a ~20° da direção de carga vertical. Este ângulo foi escolhido porque maximiza a rigidez ao minimizar o momento de dobra máxima ao longo do eixo femoral, o que aumenta a probabilidade de fraturas no pescoço femoral e leva a testes mais consistentes e reprodutíveis5. Os guias foram impressos em 3D em vários tamanhos para acomodar diferenças anatômicas entre as amostras e usados para segurar amostras em posição estável enquanto enloucotado em cimento ósseo acrílico. A rigidez, força máxima, força de rendimento e energia máxima foram calculadas a partir dos gráficos de deslocamento de força. Este método de teste mostrou resultados consistentes para o resultado biomecânico acima mencionado. Com a prática e o auxílio do guia impresso em 3D, erros de medição devido ao desalinhamento podem ser minimizados, resultando em medidas de resultado confiáveis.
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Protocol
Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos utilizados neste estudo foram C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 24 e 29 semanas de idade. Os ratos estavam alojados em condições padrão com comida e água ad libitum. Após a eutanásia por inalação de dióxido de carbono, seguida de luxação cervical, 20 fêmures direito (10 machos e 10 fêmeas) foram colhidos e congelados a -20 °C até serem testados.
1. Criação de guias de montagem impressos 3D personalizados
NOTA: Este passo pode ser necessário porque diferentes cepas e fenótipos genéticos podem ter geometrias anatômicas diferentes.
- Obtenha varreduras μCT das amostras representativas.
- Escanear amostras representativas em um scanner μCT com as seguintes configurações: 55 kV, 145 μA para tempos de integração de 300 ms e resolução de voxels de 10,5 μm.
- Certifique-se de que a região capturada cobre a extremidade proximal do fêmur e continua até o meio do poço.
NOTA: Se um scanner μCT não estiver disponível, podem ser utilizados raios-X 2D planar das amostras representativas.
- Analise as varreduras μCT.
- Utilizando o conjunto representativo de varreduras μCT, obtenha uma renderização 2D da visão anterior do fêmur proximal.
- Obtenha imagens μCT com uma resolução de 10,5 μm voxels do eixo médio até a extremidade proximal do fêmur. Compile essas fatias usando software (ver Tabela de Materiais) em uma renderização 3D da amostra.
- Determine um limiar para distinguir o osso do tecido circundante e aplique um filtro gaussiano para redução de ruído.
- Oriente as renderizações 3D para eliminar a inclinação fora do eixo e garantir que a superfície anterior do fêmur seja vista.
- Exporte esta visualização 2D da renderização 3D como um arquivo de imagem, como .jpg ou .png.
- Utilizando um software de análise de imagem (ver Tabela de Materiais), meça o ângulo do eixo femoral desenhando uma linha perpendicular ao eixo femoral 7 mm distally e uma segunda linha através do pico do maior trochanter até o ponto médio da referida linha perpendicular (Figura 1).
- Ao longo da linha perpendicular distal de 7 mm, meça o diâmetro do eixo femoral abaixo do terceiro trochanter.
- Utilizando o conjunto representativo de varreduras μCT, obtenha uma renderização 2D da visão anterior do fêmur proximal.
Figura 1: análise μCT. imagens μCT de fêmures de camundongos C57Bl/6 são usadas para calcular o ângulo médio do eixo, medido a partir do topo do trochanter maior através do centro do eixo médio, ~7 mm distally. O diâmetro médio também foi medido nesta posição. As renderizações 3D do fêmur proximal foram orientadas em uma visão anterior para exibir o perfil do terceiro trochanter. O ângulo médio do eixo foi de 93,13° (SD = 1,19°), e o diâmetro médio foi de 1,53 mm (SD = 0,14 mm) (n = 20). Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Crie os guias de montagem usando um programa de software de modelagem 3D (ver Tabela de Materiais) (Figura 2, Arquivo Suplementar 1).
NOTA: As guias são cuboides retangulares medindo 6,25 mm x 3,25 mm x 7mm com ranhura angular, ligeiramente maior que o diâmetro médio do eixo determinado na etapa 1.1.2. O ângulo do slot criará um ângulo consistente de 20° a partir da vertical. As guias devem ser consistentes em comprimento, altura e largura, mas podem ser feitas com vários diâmetros de ranhura para acomodar diferenças anatômicas entre as amostras ósseas.
Figura 2: Projetando os guias. (A) esboço 3D e (B) visualização de luminária de angling midshaft antes da impressão 3D. Com base na literatura anterior, um ângulo médio entre 20° maximiza a rigidez. Minimiza o momento máximo de dobra no eixo femoral para garantir que ocorram fraturas no pescoço e variabilidade nos resultados mecânicos5. Para compensar o desvio de 3,13° do perpendicular nos ângulos médios, o ângulo de fixação foi definido em 73,13° para produzir um ângulo de 20°. As luminárias de alinhamento foram impressas com diâmetros que variam de 1,9-2,2 mm para garantir um ajuste adequado para diferentes diâmetros médios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Usando uma impressora 3D, imprima os guias. Os guias podem permanecer durante o processo de teste, portanto, imprimir várias réplicas das guias pode ser benéfico para o preparo de várias amostras ao mesmo tempo.
2. Preparação da amostra
- Colher os fêmures do rato fazendo uma incisão transversal inteiramente ao redor do abdômen do rato e removendo o tecido da incisão para os tornozelos. Na sequência, localize a tomada do quadril e use cuidadosamente a ponta de um par de fórceps finos para deslocar o quadril. Corte o tecido mole adicional para remover a perna do mouse.
- Uma vez que a perna é colhida, use um bisturi para deslocar e cortar a articulação do joelho. Limpe manualmente os fêmures de todos os tecidos moles usando fórceps, bisturis e toalhas de papel.
- Teste as amostras colhidas imediatamente ou armazene-as a -20 °C por até 6 meses. Se as amostras estiverem congeladas, deixe-as chegar à temperatura ambiente e hidrate-se em PBS por 2h antes de se preparar.
- Usando tubos de alumínio quadrado de 1/4" x 1/4" (ver Tabela de Materiais), corte as seções de tubulação de 1/2" a 1" de comprimento. Utilizando uma ferramenta de gravação, rotule cada segmento de alumínio com os IDs de amostra.
- Encha metade dos segmentos de tubulação com massa. Coloque esses segmentos de tubulação em um aparelho para segurá-los eretos.
- Coloque os fêmures limpos nas guias impressas em 3D. Para isso, coloque as amostras planas no banco para que a superfície anterior esteja voltada para cima. Coloque o guia diretamente abaixo do terceiro trochanter, onde o diâmetro do eixo se torna mais consistente.
NOTA: Isso deixará ~7mm do fêmur proximal acima do guia. - Para evitar que o fêmur gire para o lado lateral ou medial ao colocar no guia, segure as extremidades proximal e distal com uma mão ao aplicar as guias, pressione firmemente o fêmur na bancada e, usando a outra mão, coloque a guia impressa em 3D no eixo médio do fêmur. Certifique-se de aplicar o guia de diâmetro apropriado suavemente, pois o eixo médio do fêmur pode estalar se for forçado a um guia muito pequeno.
- Uma vez que as guias estejam nos fêmures, coloque-os em frente aos segmentos correspondentes de alumínio. Usando cimento ósseo ou outros agentes de endurecimento, encha os segmentos de alumínio até ficar apenas cheio, deixando um pouco de espaço para deslocamento.
- Coloque os fêmures com guias no segmento correto de alumínio.
NOTA: As guias não serão centradas nos segmentos de alumínio, sentados ligeiramente para um lado para permitir que a extremidade distal do fêmur fique no centro da panela de alumínio. - Permita que o agente de endurecimento sefina. Uma vez configurada, coloque as amostras em uma placa de Petri com soro fisiológico tamponado de fosfato de temperatura ambiente (PBS) e deixe reidratar por 2h (Figura 3).
Figura 3: Preparação da amostra usando gabaritos personalizados e luminárias de angling. (A) As amostras em potes de alumínio com o alinhamento adequado são mantidas usando as guias impressas em 3D enquanto o cimento ósseo está secando. (B) O raio-X antes do teste mostra a sombra das luminárias de pesca e a cobertura completa do cimento ósseo em torno da extremidade distal dos fêmures. A área branca saturada na parte inferior dos potes de alumínio é massa, usada para manter cimento ósseo em vasos ao endurecer. Barra de escala (Painel B) = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Configuração de hardware
- Utilizando um sistema de teste mecânico (MTS), conecte e calibra uma célula de carga com resolução <1 N (ver Tabela de Materiais) (Figura 4A).
NOTA: A célula de carga pode ser montada no palco ou, preferencialmente, o atuador quando possível. - Conecte uma luminária com um entalhe quadrado que segure firmemente os segmentos de alumínio com as amostras. Conecte os parafusos definidos aos dois lados da luminária para segurar firmemente as amostras no lugar. (Figura 4B).
NOTA: Este aparelho pode ser impresso em 3D ou usinado e, em seguida, tocado com orifícios de parafuso roscados para montar no quadro de teste. - Coloque uma placa de carregamento no atuador. Este pode ser simplesmente um parafuso afilado com uma ponta achatada (Figura 4C).
- Coloque um estereómico em uma mesa ou superfície diretamente em frente ao MTS. Se for necessária uma iluminação adicional para ver a configuração através do microscópio, coloque-as ao redor do sistema.
Figura 4: Configuração de hardware. (A) Configuração dos testes em sistema de teste mecânico, com célula de carga de 1 kN (resolução < 1 N) e estágio biaxial preto para garantir o posicionamento adequado da amostra. (B) Feche a luminária impressa em 3D anexada à célula de carga com uma haste roscada M10 e dois parafusos M4 usados para segurar a panela de alumínio no lugar. (C) Ver a amostra através de um microscópio estéreo com uma luminária de carregamento afilado. Barra de escala (Painel C) = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Configuração do software
- No software MTS, inicie a criação de um novo protocolo flexural (dobra). Certifique-se de que o protocolo funcionará no controle de deslocamento.
- Defina a taxa de carregamento do protocolo para 0,5 mm/s.
- Se o software tiver uma configuração para teclas macias, adicione as teclas macias "Balance" e "Zero Extension" ao protocolo.
NOTA: Isso definirá rapidamente a posição de carga e atuador para 0 antes de testar cada amostra. - Certifique-se de que o programa de software registrará o tempo em segundos, a carga em Newtons e a extensão ou deslocamento em milímetros a uma taxa mínima de amostragem de 100 Hz.
- Salve o novo protocolo e retorne à tela principal do programa de software para começar a testar um novo conjunto de amostras.
5. Configuração de teste
- Antes de montar os espécimes no MTS, obtenha uma imagem de raio-X das amostras nos potes de alumínio. Várias amostras podem ser imagens ao mesmo tempo. Certifique-se de que a visão anterior das amostras seja capturada para permitir medições de verificação do ângulo de vaso (Figura 5).
Figura 5. Avaliação do alinhamento amostral. (A) O ângulo do eixo da vertical é medido a partir de raios-x digitais planar. (B) Os ângulos representativos do eixo femoral em vasos variaram de 18,11° a 23,99°, com coeficiente de variação (COV) de 7,1% (n = 20). As diferenças sexuais decorrentes de variações anatômicas não foram estatisticamente significativas, conforme determinado por meio de um teste t não feito de uma cauda (p < 0,05). Barra de escala (Painel A) = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque o segmento de alumínio com amostra na luminária e aperte os parafusos do conjunto.
- Acionador/placa de carregamento inferior até que esteja dentro de alguns milímetros da cabeça femoral.
NOTA: Não pré-carregar a amostra com qualquer força e tenha cuidado para não baixar o atuador muito rapidamente, pois é muito fácil danificar amostras. - Usando o estereómico, ajuste o estágio biaxial para alinhar a posição da cabeça femoral diretamente sob a placa de carregamento. Bloqueie o estágio biaxial no lugar.
- No software MTS, zero a posição do atuador e equilibre a célula de carga usando as teclas macias adicionadas na etapa 4.3.
- Comece o protocolo de carregamento. Dependendo de quanto espaço ficou entre a placa de carregamento e a amostra, os testes só levarão 10-30 s.
- Após o teste, capture outro raio-X anterior da amostra. Este será usado para discernir e documentar o modo de fratura (Figura 6).
Figura 6: Imagem de raio-X das amostras após o teste. Todas as amostras fraturadas em uma linha bifurcada através do pescoço femoral e ao longo do acessório femoral pescoço-shaft (destacado pelo círculo laranja). Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Análise de dados
- Após a coleta de dados, a força de exportação e os dados de deslocamento em software (ver Tabela de Materiais) que permite gráficos e cálculos matemáticos.
- Plote a carga vs. deslocamento para cada amostra (Figura 7A). Encaixe uma aproximação linear ao segmento linear da curva de deslocamento de carga. A inclinação deste ajuste linear definirá a rigidez, uma medida da elasticidade da amostra.
- Calcule os resultados adicionais, como carga máxima, deslocamento máximo, carga de rendimento, deslocamento no ponto de rendimento, energia para carga máxima e energia para ponto de rendimento.
NOTA: O ponto de rendimento pode ser determinado desligando a aproximação linear determinada na etapa 6.2 por 0,2%6. O ponto em que a linha off-set e a carga vs. a intersecção da curva de deslocamento determinará o ponto de rendimento. No caso de amostras muito frágeis que mostram pouco rendimento, o ponto de rendimento pode ser o mesmo que o ponto máximo.
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Representative Results
Quando em vasos com o auxílio do guia, os eixos femorais foram alinhados em 21,6° ± 1,5°. Embora isso represente < 10% de desvio do ângulo pretendido de 20°, os coeficientes de variação (COV) do ângulo de vaso em todas as amostras testadas foram de 7,6% e 6,5% para camundongos machos e fêmeas, respectivamente (n = 10 por grupo) conforme verificado por raios-x planar pré-teste (Figura 5). Além disso, os raios-X pós-teste devem ser usados para avaliar o modo em que as amostras falharam. A falha foi consistentemente observada nos pescoços do fêmur, como pretendido, de forma bifurcada, com uma linha de fratura paralela ao eixo femoral e a outra linha perpendicular ao pescoço femoral (Figura 6). Se ocorrerem variações significativas no padrão de quebra entre as amostras, então a qualidade óssea das amostras poderia ser avaliada via μCT medindo desfechos como densidade mineral óssea volumostrica, espessura trabecular e cortical, espaçamento e mineralização. Se a falha não for consistentemente induzida no pescoço femoral, as guias impressas em 3D podem ser ajustadas.
As medidas de desfecho biomecânico aqui relatadas são consistentes com valores relatados em dobra axial semelhante das configurações do pescoço femoral7,8,9,10,11,12,13,14. No entanto, o alinhamento consistente alcançado utilizando as guias impressas em 3D geralmente melhorou o COV da carga máxima em particular (Tabela 1).
| Estudo atual | Sexo | Ângulo de eixo médio | Carga Máxima | Rigidez | Trabalhar para o fracasso |
| Macho | 8% | 10% | 20% | 24% | |
| Fêmea | 7% | 9% | 35% | 38% | |
| Jämsä et al10 | Macho | NR | 22% | NR | NR |
| Jämsä et al8 | Macho | NR | 19% | NR | NR |
| Kamal et al9 | Fêmea | NR | 16%-25% | 11%-28% | NR |
| Middleton et al7 | Fêmea | NR | 24%-27% | NR | NR |
| Brent et al11 | Fêmea - ratos | NR | 18%-24% | NR | NR |
| Bromer et al12* | Fêmea | NR | 11%-27% | NR | NR |
| Vegger et al13* | Fêmea | NR | 16%-32% | NR | NR |
| Lodberg14* | Fêmea | NR | 11%-45% | NR | NR |
| NR: Não relatado | |||||
| *: Dados extrapolados de números publicados | |||||
Tabela 1: Coeficientes de variação para propriedades flexural medidas dos pescoços femorais do rato. Os coeficientes de variação representam uma razão do desvio padrão e da média de um conjunto de dados. À medida que o COV diminui, isso indica um agrupamento mais apertado dos pontos de dados individuais em torno da média. Este protocolo diminuiu o COV para carga máxima em comparação com outras publicações que realizam testes semelhantes.
Como esperado, as diferenças sexuais foram observadas nas propriedades mecânicas medidas. As análises estatísticas foram realizadas por meio de um teste t não feito de uma cauda. Os pescoços femorais de camundongos machos foram significativamente mais fortes e mais rígidos do que os espécimes de camundongos fêmeas (p = 0,009 e p = 0,0006, respectivamente). Além disso, os pescoços femorais femininos experimentaram deformações mais significativas (p = 0,014) e trabalharam até a falha (p = 0,024) em comparação com espécimes de camundongos machos (Figura 7). Isso é consistente com a menor densidade mineral óssea em fêmeas e ressalta a sensibilidade do teste para detectar diferenças fisiologicamente relevantes. Nas coortes de camundongos machos e fêmeas utilizadas neste estudo, a densidade mineral óssea de camundongos fêmeas foi significativamente menor do que seus homólogos masculinos, conforme determinado por uma absorptiometria de raios-X de dupla energia (DEXA) e um teste t-não-feito de uma cauda (p = 0,036).
Figura 7: Resultados biomecânicos. (A) Uma curva representativa de deslocamento de força, exibindo um ajuste linear de deslocamento de 0,2%, é usada para derivar a rigidez e o ponto de rendimento. As medidas de desfecho selecionadas são a demonstração traçada de exibição média e desvio padrão, incluindo (B) carga máxima (em falha), (C) rigidez, (D) deslocamento máximo (em falha) e (E) trabalho para falha (área sob a curva até o ponto de falha). Asteriscos indicam diferenças significativas determinadas usando um teste t não feito de uma cauda (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 por coorte sexual). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para confirmar que as pequenas variações no ângulo de vaso não contribuíram para a variabilidade experimental, cada medida de desfecho biomecânico foi traçada contra o ângulo de vaso e realizou uma simples regressão linear para a coorte masculina, coorte feminina e todas as amostras agrupadas (Figura 8). A hipótese foi então testada de que a inclinação de regressão linear não é zero. A análise de regressão demonstrou que, com exceção da rigidez, as pequenas variações no ângulo de vaso (faixa de 18° a 24°) não afetaram as medidas de desfecho biomecânico. Para rigidez, houve correlação linear significativa com o ângulo de vaso (R2 = 0,29, p < 0,05).
Figura 8: Efeito do ângulo de envasamento sobre os resultados biomecânicos. As medidas de desfecho biomecânico, incluindo (A) carga máxima, (B) rigidez, (C) deslocamento máximo e (D) trabalho à falha foram traçadas contra o ângulo de envasamento e correlacionadas usando uma simples regressão linear para a coorte masculina, coorte feminina e todas as amostras agrupadas. Linhas pretas sólidas mostram regressão linear de amostras agrupadas, com linhas pontilhadas indicando intervalos de confiança. A variabilidade no ângulo de vaso não afetou significativamente o trabalho máximo de carga, deslocamento máximo ou falha. No entanto, à medida que o ângulo de vasos aumentava, a rigidez aumentou, conforme determinado pelo teste de Pearson (p = 0,0126, n = 20). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Linguagem de triângulo padrão (. STL) arquivo das guias. Este arquivo pode ser usado para imprimir os guias descritos no protocolo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este protocolo descreve um teste de dobra cantilever confiável para pescoços femorais murinos. O cenário natural de flexão cantilever que ocorre no pescoço femoral normalmente não é representado nos testes de dobra padrão de 3 e 4 pontos5. Este método de teste é melhor e mais confiável replica o tipo de fraturas do pescoço femoral experimentadas por pacientes com fragilidade óssea. O foco principal ao executar este protocolo é eliminar a variabilidade devido ao vaso inconsistente do eixo femoral. Criticamente, acompanhar de perto as etapas descritas na primeira e quarta seções do protocolo garantirá que a criação dos guias e do protocolo de carregamento replique o que é relatado nesta publicação. Como pode ser teoricamente previsto e mostrado experimentalmente, o ângulo médio em relação ao eixo de carga pode afetar as tensões experimentadas pelo pescoço femoral e a probabilidade de que a fratura ocorra no pescoço femoral. Grupos anteriores demonstraram que o ângulo do eixo médio influencia significativamente a rigidez e força compressivas do fêmur quando carregado através da cabeça femoral. A análise paramétrica dos efeitos dos ângulos de inclinação do eixo médio mostrou que os momentos de dobra máxima nos eixos femorais experimentam um mínimo em ângulos de eixo médio entre 15° e 25°, o que também maximiza a rigidez do eixo5. Este ângulo, portanto, minimiza a probabilidade de fraturas por compressão no eixo e aumenta a probabilidade de fraturas flexis no pescoço femoral.
Vários parâmetros podem afetar os resultados de qualquer teste biomecânico e confundir a capacidade de detectar diferenças significativas devido a variáveis experimentais fisiologicamente relevantes. Esta variabilidade é agravada pelo pequeno tamanho de ossos longos do rato. Entre os parâmetros que requerem atenção neste teste, em particular, estão o número de ciclos de congelamento e estado de hidratação do osso, a taxa de carregamento e o alinhamento do eixo femoral em relação ao eixo de carga. O protocolo estipula que todas as amostras passam pelo mesmo número de ciclos de congelamento e uma janela de 2h para hidratação em PBS à temperatura ambiente. A taxa de carregamento também é definida para um valor uniforme de 0,5 mm/s3,4. Além disso, as guias impressas em 3D foram projetadas para posicionar consistentemente o fêmur em um ângulo médio de ~20° durante o passo de vaso. Isso resultou em ângulos consistentes de midshafts na faixa de 18° a 24°, sem efeitos sexuais significativos devido a diferenças anatômicas e coeficientes de variação de 7,6% e 6,5% para camundongos machos e fêmeas, respectivamente. Esses guias são acessíveis, facilmente modificados usando software de modelagem sólido padrão e reproduzidos sob demanda usando uma impressora 3D de desktop barata.
Os resultados representativos demonstraram que o protocolo de teste é sensível a diferenças fisiológicas sutis, como o sexo, com um tamanho amostral razoável de n = 10. Uma análise retrospectiva de energia contabilizando os efeitos de tamanho experimentalmente determinados (δ = Δmean/SD) em n = 10 sugeriu que a potência foi estimada em 57% para a carga máxima em falha (δ = 0,8), δ >95% para a rigidez (δ = 1,77) e o deslocamento máximo (δ = 1,9), e 83% para o trabalho de falha (δ = 1,77), respectivamente. Juntamente com os pequenos coeficientes de variação (Tabela 1), esta análise de potência confirma que a variação no ângulo do vaso afetou negativamente a sensibilidade e a confiabilidade do protocolo.
A análise subjetiva do modo de falha também demonstrou que 100% das amostras testadas falharam no pescoço femoral, pois todas apresentaram fratura bifurcada, com uma linha de fratura correndo paralelamente ao eixo no local encontra o pescoço e outra linha de fratura perpendicular ao pescoço femoral no ápice da bifurcação. Isso engloba características de dois modos clinicamente relevantes de fraturas no pescoço femoral; as fraturas intertrocânicas e transcerúricas do pescoço15. Os testes de dobra do pescoço femoral não são tão comumente utilizados e descritos na literatura como testes padrão de torção ou flexão de eixos médios femorais e tibiais em modelos de roedores de osteoporose. Apenas um punhado de estudos foram identificados para descrever tais protocolos usando modelos de ratos e ratos5,7,8,9,16,17. O ângulo em que os fêmures foram posicionados durante os testes nem sempre é relatado. Alguns com descrições detalhadas usam uma quantidade excessiva de luminárias e software personalizados para alinhar suas amostras5, mas ainda recorrem ao potting à mão, introduzindo o mesmo erro humano em outros protocolos.
Este protocolo é projetado para amostras de murine e é especificado para ratos C57Bl/6, mas poderia facilmente ser adaptado a grandes modelos animais ou outras cepas de murina com geometria femoral diferente. Os futuros investigadores que usam este protocolo podem precisar modificar a quantidade de osso exposto, já que o terceiro trochanter pode não estar precisamente a 7 mm da cabeça femoral. Modificações adicionais no protocolo incluem o uso de um agente de endurecimento que pode ser suavizado após o teste para liberar a amostra se forem desejados novos testes. Isso poderia ser feito com uma alusão de bismuto que poderia ser derretida em um banho de água quente após testes para liberar a amostra7. A modificação final que os usuários podem fazer neste protocolo é iludida na etapa 3.1, sendo o tipo e posicionamento da célula de carga. Uma célula de carga axial deve ser usada com resolução sub 1 N. Uma célula de carga de 50 N seria apropriada com base nas cargas máximas observadas. Além disso, uma célula de carga que só mede tensão ou compressão deve ser usada para evitar qualquer momento de dobra de composição que a célula de carga possa experimentar a partir de carregamento excêntrico em relação à célula de carga. Outra maneira de evitar a compostagem de medidas de força seria fixar a célula de carga ao atuador para garantir que a força de carregamento esteja alinhada com a célula de carga.
Este protocolo simplifica a necessidade de luminárias personalizadas, descreve como os guias podem ser impressos em qualquer impressora 3D disponível comercialmente e utiliza equipamentos de laboratório comuns para testar amostras de forma completa e reprodutivelmente, como demonstrado pelos coeficientes mais baixos de variação relatados no presente estudo (Tabela 1). No entanto, este protocolo não é restrito pela necessidade de uma impressora 3D. Existem soluções disponíveis comercialmente, onde os arquivos de renderização 3D podem ser enviados para as empresas de impressão, e as peças podem ser enviadas de volta. Além disso, este modo de dobrar o carregamento no pescoço femoral simula a localização e os tipos de fraturas clinicamente encontradas. Com o número de pessoas em alto risco de fraturas por fragilidade, prevê-se que haverá mais de 21,3 milhões de fraturas de quadril por ano até 205018. A imensa carga social, financeira e médica que isso representa, testes confiáveis em modelos de roedores podem melhorar o rigor e a reprodutibilidade de pesquisas voltadas para a compreensão da etiologia da osteoporose e terapêutica para tratá-la efetivamente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pelo NIH P30AR069655 e R01AR070613 (H. A. A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ¼” x ¼” square aluminum tubing | Grainger | 48KU67 | Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths |
| 1 kN load cell | Instron | 2527-130 | Any load cell with sub 1 N resolution can be used. |
| 3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope | Omano | OM2300S-GX4 | Microscope used to precisely line up samples with loading platen. |
| 3D printed guides | Custom made | Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm | |
| 3D printed mount | Custom made | Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place. | |
| Acrylic Base Plate Material Kit | Keystone Industries | 921392 | Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly. |
| Amira | ThermoFisher Scientific | Used to compile µCT scans | |
| Biaxial stage | Custom made | Used to center femoral head of sample under the loading platen. | |
| BioMed Amber Resin | formlabs | RS-F2-BMAM-01 | Any resin from formlabs could be used for this project. |
| Bluehill 3 | Instron | V3.66 | Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data. |
| ElectroPuls 10000 | Instron | E10000 | Mechanical testing system |
| Faxitron UltraFocus | Faxitron BioOptics | 2327A40311 | X-ray imaging system |
| Form 2 | formlabs | F2 | Used to print the mount and guides |
| Form 2 Resin Tank LT | formlabs | RT-F2-02 | LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ | Used to assess µCT and X-ray images |
| Laxco iLED Series LED Light Source | ThermoFisher Scientific | AMPSILED30W | Light source used in conjugtion with microscope. |
| Loading platen | Custom made | This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe. | |
| Mount attachment | Custom made | To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set. |
| Plumber's putty | Oatey | 31174 | Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used. |
| PreForm | formlabs | Preform 3.15.2 | Formlabs software |
| Tissue Culture Dish | Corning | 353003 | Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate. |
| vivaCT 40 | Scanco | µCT 40 | Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter. |
References
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