Flexión en voladizo de cuellos femorales murinos

Summary

El presente protocolo describe el desarrollo de una plataforma de prueba reproducible para cuellos femorales murinos en una configuración de flexión en voladizo. Se utilizaron guías personalizadas impresas en 3D para fijar de manera consistente y rígida los fémures en una alineación óptima.

Abstract

Las fracturas en el cuello femoral son una ocurrencia común en individuos con osteoporosis. Se han desarrollado muchos modelos de ratón para evaluar los estados de la enfermedad y las terapias, con pruebas biomecánicas como medida de resultado primaria. Sin embargo, las pruebas biomecánicas tradicionales se centran en las pruebas de torsión o flexión aplicadas al eje medio de los huesos largos. Este no suele ser el sitio de fracturas de alto riesgo en individuos osteoporóticos. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo de pruebas biomecánicas que prueba los cuellos femorales de los fémures murinos en la carga de flexión en voladizo para replicar mejor los tipos de fracturas experimentadas por los pacientes con osteoporosis. Dado que los resultados biomecánicos dependen en gran medida de la dirección de carga de flexión en relación con el cuello femoral, se crearon guías impresas en 3D para mantener un eje femoral en un ángulo de 20 ° en relación con la dirección de carga. El nuevo protocolo simplificó las pruebas al reducir la variabilidad en la alineación (21.6 ° ± 1.5 °, COV = 7.1%, n = 20) y mejoró la reproducibilidad en los resultados biomecánicos medidos (COV promedio = 26.7%). El nuevo enfoque que utiliza las guías impresas en 3D para una alineación confiable de las muestras mejora el rigor y la reproducibilidad al reducir los errores de medición debido a la desalineación de las muestras, lo que debería minimizar los tamaños de las muestras en estudios de osteoporosis en ratones.

Introduction

El riesgo de fractura es una preocupación médica grave asociada con la osteoporosis. Más de 1.5 millones de fracturas por fragilidad se reportan cada año solo en los Estados Unidos, con fracturas que ocurren en la cadera, específicamente en el cuello femoral, como el tipo de fractura ^principal1. Se estima que el 18% de las mujeres y el 6% de los hombres experimentarán una fractura de cuello femoral en su ^vida2, y la tasa de mortalidad a 1 año después de la fractura es superior al 20%¹. Por lo tanto, los modelos de ratón que permiten realizar pruebas biomecánicas del cuello femoral pueden ser adecuados para estudiar fracturas por fragilidad. Los modelos de ratón también ofrecen herramientas poderosas para dilucidar potencialmente eventos celulares y moleculares traducibles involucrados en la osteoporosis. Esto se debe a la disponibilidad de reporteros genéticos, la ganancia y pérdida de modelos de función y la amplia biblioteca de técnicas moleculares y reactivos. Las pruebas mecánicas de huesos de ratón pueden proporcionar las medidas de resultado necesarias para determinar la salud ósea, las variaciones genotípicas y fenotípicas que podrían explicar la etiología de la enfermedad, y evaluar las terapias basadas en medidas de resultado de la calidad del hueso y el riesgo de ^fractura3.

La anatomía del cuello femoral crea escenarios de carga mecánica únicos, que generalmente conducen a fracturas de flexión (flexión). La cabeza femoral se carga en la cavidad acetabular en el extremo proximal del fémur. Esto crea un escenario de flexión en voladizo en el cuello femoral, que está rígidamente unido al eje femoral ^distalmente4. Esto difiere de las pruebas tradicionales de flexión de 3 o 4 puntos en la diáfisis media femoral. Si bien estas pruebas son útiles, no replican la carga que generalmente conduce a fracturas por fragilidad en individuos osteopénicos y osteoporóticos en términos de ubicación de la fractura o el escenario de carga.

Para evaluar mejor el riesgo de fractura por fragilidad en ratones, se buscó mejorar la reproducibilidad de las pruebas de flexión en voladizo de cuellos femorales murinos. Como se predijo teóricamente, se ha demostrado que el ángulo de carga en la cabeza femoral en relación con el eje femoral afecta significativamente las medidas de ^resultado5, creando así un desafío para la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados informados. Para garantizar una alineación adecuada y consistente de los fémures durante la preparación de la muestra, se diseñaron guías y se imprimieron en 3D en función de las mediciones anatómicas realizadas en exploraciones μCT de fémures de ratón C57BL / 6. Las guías fueron diseñadas para ayudar a colocar consistentemente las muestras de tal manera que el eje femoral se mantenga a ~ 20 ° de la dirección de carga vertical. Este ángulo fue elegido porque maximiza la rigidez al tiempo que minimiza el momento máximo de flexión a lo largo del eje femoral, lo que aumenta la probabilidad de fracturas de cuello femoral y conduce a pruebas más consistentes y reproducibles5. Las guías se imprimieron en 3D en varios tamaños para acomodar las diferencias anatómicas entre las muestras y se utilizaron para mantener las muestras en una posición estable mientras se colocaban en macetas de cemento óseo acrílico. La rigidez, la fuerza máxima, la fuerza de rendimiento y la energía máxima se calcularon a partir de los gráficos de fuerza-desplazamiento. Este método de prueba mostró resultados consistentes para el resultado biomecánico antes mencionado. Con la práctica y la ayuda de la guía impresa en 3D, los errores de medición debidos a la desalineación se pueden minimizar, lo que resulta en medidas de resultado confiables.

Protocol

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones utilizados en este estudio fueron machos y hembras C57BL/6 con edades comprendidas entre las 24 y las 29 semanas de edad. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar con comida y agua ad libitum. Tras la eutanasia por inhalación de dióxido de carbono, seguida de luxación cervical, se cosecharon 20 fémures derechos (10 machos y 10 hembras) y se congelaron a -20 °C hasta que se probaron.

1. Creación de guías de montaje impresas en 3D personalizadas

NOTA: Este paso podría ser necesario porque diferentes cepas y fenotipos genéticos pueden tener diferentes geometrías anatómicas.

1. Obtener exploraciones μCT de las muestras representativas.
   1. Escanee muestras representativas en un escáner μCT con los siguientes ajustes: 55 kV, 145 μA para tiempos de integración de 300 ms y resolución de vóxeles de 10,5 μm.
   2. Asegúrese de que la región capturada cubra el extremo proximal del fémur y continúe hacia abajo a través del eje medio.
      NOTA: Si un escáner μCT no está disponible, se pueden utilizar radiografías planares 2D de las muestras representativas.
2. Analizar las exploraciones μCT.
   1. Utilizando el conjunto representativo de exploraciones μCT, obtenga una representación 2D de la vista anterior del fémur proximal.
      1. Obtener imágenes μCT con una resolución de vóxeles de 10,5 μm desde el eje medio hasta el extremo proximal del fémur. Compile estos segmentos utilizando software (consulte tabla de materiales) en una representación 3D de la muestra.
      2. Determine un umbral para distinguir el hueso del tejido circundante y aplique un filtro gaussiano para la reducción del ruido.
      3. Oriente las representaciones 3D para eliminar la inclinación fuera del eje y asegúrese de que se vea la superficie anterior del fémur.
      4. Exporte esta vista 2D de la representación 3D como un archivo de imagen, como .jpg o .png.
   2. Utilizando un software de análisis de imágenes (ver Tabla de Materiales), mida el ángulo del eje femoral dibujando una línea perpendicular al eje femoral de 7 mm distalmente y una segunda línea a través del pico del trocánter mayor hasta el punto medio de la línea perpendicular antes mencionada (Figura 1).
   3. A lo largo de la línea perpendicular distal de 7 mm, mida el diámetro del eje femoral por debajo del tercer trocánter.

Figura 1: Análisis μCT. μCt imágenes de fémures de ratones C57Bl/6 se utilizan para calcular el ángulo promedio del eje, medido desde la parte superior del trocánter mayor a través del centro del eje medio, ~7 mm distalmente. El diámetro del eje medio también se midió en esta posición. Las representaciones 3D del fémur proximal se orientaron en una vista anterior para mostrar el perfil del tercer trocánter. El ángulo promedio del eje fue de 93.13 ° (SD = 1.19 °), y el diámetro promedio del eje medio fue de 1.53 mm (SD = 0.14 mm) (n = 20). Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Cree las guías de montaje utilizando un programa de software de modelado 3D (consulte la Tabla de materiales) (Figura 2, Archivo complementario 1).
   NOTA: Las guías son cuboides rectangulares que miden 6,25 mm x 3,25 mm x 7 mm con una ranura en ángulo, ligeramente mayor que el diámetro medio del eje determinado en el paso 1.1.2. El ángulo de la ranura creará un ángulo consistente de 20 ° desde la vertical. Las guías deben ser consistentes en longitud, altura y anchura, pero se pueden hacer con varios diámetros de ranura para acomodar las diferencias anatómicas entre las muestras de hueso.

Figura 2: Diseño de las guías. (A) Boceto 3D y (B) visualización del accesorio de ángulo de eje medio antes de la impresión 3D. Según la literatura anterior, un ángulo de eje medio entre 20 ° maximiza la rigidez. Minimiza el momento máximo de flexión en el eje femoral para asegurar que se produzcan fracturas en el cuello y variabilidad en los resultados ^mecánicos5. Para compensar la desviación de 3.13 ° de perpendicular en los ángulos promedio del eje medio, el ángulo de fijación se estableció en 73.13 ° para producir un ángulo de 20 °. Los accesorios de alineación se imprimieron con diámetros que van desde 1.9-2.2 mm para garantizar un ajuste adecuado para diferentes diámetros de eje medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Con una impresora 3D, imprima las guías. Las guías pueden permanecer encendidas durante el proceso de prueba, por lo que imprimir múltiples réplicas de las guías puede ser beneficioso para preparar varias muestras a la vez.

2. Preparación de la muestra

1. Cosecha los fémures del ratón haciendo una incisión transversal completamente alrededor del abdomen del ratón y eliminando el tejido de la incisión a los tobillos. Después de esto, ubique la cavidad de la cadera y use cuidadosamente la punta de un par de fórceps finos para dislocar la cadera. Corte el tejido blando adicional para quitar la pierna del ratón.
2. Una vez que se cosecha la pierna, use un bisturí para dislocar y cortar a través de la articulación de la rodilla. Limpie manualmente los fémures de todos los tejidos blandos con fórceps, bisturíes y toallas de papel.
3. Pruebe las muestras cosechadas inmediatamente o guárdelas a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Si las muestras están congeladas, deje que lleguen a temperatura ambiente e hidrate en PBS durante 2 h antes de prepararlas.
4. Usando tubos cuadrados de aluminio de 1/4" x 1/4" (ver Tabla de Materiales), corte secciones de tubos de 1/2" a 1" de longitud. Con una herramienta de grabado, etiquete cada segmento de aluminio con los ID de muestra.
5. Llene la mitad de los segmentos de los tubos con masilla. Coloque estos segmentos de tubos en un accesorio para mantenerlos en posición vertical.
6. Coloque los fémures limpios en las guías impresas en 3D. Para hacer esto, coloque las muestras planas en la mesa de trabajo para que la superficie anterior esté hacia arriba. Coloque la guía directamente debajo del tercer trocánter, donde el diámetro del eje se vuelve más consistente.
   NOTA: Esto dejará ~ 7 mm del fémur proximal por encima de la guía.
7. Para evitar que el fémur gire hacia el lado lateral o medial mientras se coloca en la guía, sostenga los extremos proximal y distal con una mano al aplicar las guías, presione firmemente el fémur sobre el banco de trabajo y, con la otra mano, coloque la guía impresa en 3D en el eje medio del fémur. Asegúrese de aplicar la guía de diámetro adecuada suavemente, ya que el eje medio del fémur puede romperse si se fuerza en una guía demasiado pequeña.
8. Una vez que las guías estén en los fémures, colóquelas frente a los segmentos de aluminio correspondientes. Usando cemento óseo u otros agentes endurecedores, llene los segmentos de aluminio hasta que estén llenos, dejando un poco de espacio para el desplazamiento.
9. Coloque los fémures con guías en el segmento de aluminio correcto.
   NOTA: Las guías no estarán centradas en los segmentos de aluminio, sentados ligeramente a un lado para permitir que el extremo distal del fémur se asiente en el centro de la olla de aluminio.
10. Permita que el agente de endurecimiento se establezca. Una vez colocadas, colocamos las muestras en una placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente y dejamos rehidratar durante 2 h (Figura 3).

Figura 3: Preparación de muestras utilizando plantillas personalizadas y accesorios de pesca. (A) Las muestras en macetas de aluminio con la alineación adecuada se mantienen utilizando las guías impresas en 3D mientras el cemento óseo se está secando. (B) La radiografía antes de la prueba muestra la sombra de los accesorios de pesca y la cobertura completa de cemento óseo que rodea el extremo distal de los fémures. El área blanca saturada en la parte inferior de las macetas de aluminio es masilla, utilizada para mantener el cemento óseo en las macetas cuando se endurece. Barra de escala (Panel B) = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Configuración de hardware

1. Utilizando un sistema de pruebas mecánicas (MTS), conecte y calibre una célula de carga con resolución <1 N (consulte la Tabla de materiales) (Figura 4A).
   NOTA: La célula de carga se puede montar en el escenario o, preferiblemente, en el actuador cuando sea posible.
2. Coloque un accesorio con una ranura cuadrada que sostendrá firmemente los segmentos de aluminio con las muestras. Coloque los tornillos de ajuste en los dos lados del accesorio de sujeción para mantener firmemente las muestras en su lugar. (Figura 4B).
   NOTA: Este accesorio se puede imprimir o mecanizar en 3D y luego se puede tocar con orificios de tornillo roscados para montarlo en el marco de prueba.
3. Conecte una placa de carga al actuador. Esto puede ser simplemente un tornillo cónico con una punta aplanada (Figura 4C).
4. Coloque un estereomicroscopio en una mesa o superficie directamente frente al MTS. Si se necesita iluminación adicional para ver la configuración a través del microscopio, colóquela alrededor del sistema.

Figura 4: Configuración del hardware. (A) Configuración de las pruebas en el sistema de pruebas mecánicas, con una célula de carga de 1 kN (resolución < 1 N) y una etapa biaxial negra para garantizar el correcto posicionamiento de la muestra. (B) Primer plano del accesorio de montaje impreso en 3D conectado a la célula de carga con una varilla roscada M10 y dos pernos M4 utilizados para mantener la olla de aluminio en su lugar. (C) Vista de la muestra a través de un microscopio estereoscópico con un accesorio de carga cónico. Barra de escala (Panel C) = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Configuración del software

1. En el software MTS, comience la creación de un nuevo protocolo de flexión (flexión). Asegúrese de que el protocolo operará en el control de desplazamiento.
2. Establezca la velocidad de carga del protocolo en 0,5 mm/s.
3. Si el software tiene una configuración para las teclas programables, agregue las teclas programables "Balance" y "Zero Extension" al protocolo.
   NOTA: Esto ajustará rápidamente la carga y la posición del actuador a 0 antes de probar cada muestra.
4. Asegúrese de que el programa de software registre el tiempo en segundos, la carga en Newtons y la extensión o desplazamiento en milímetros a una frecuencia de muestreo mínima de 100 Hz.
5. Guarde el nuevo protocolo y vuelva a la pantalla principal del programa de software para comenzar a probar un nuevo conjunto de muestras.

5. Configuración de pruebas

1. Antes de montar las muestras en el MTS, obtenga una imagen de rayos X de las muestras en las macetas de aluminio. Se pueden obtener imágenes de varias muestras a la vez. Asegúrese de que se capture la vista anterior de las muestras para permitir mediciones de verificación del ángulo de maceta (Figura 5).

Figura 5. Evaluación de la alineación de la muestra. (A) El ángulo del eje desde la vertical se mide a partir de rayos X digitales planos. (B) Los ángulos representativos del eje femoral en maceta variaron de 18.11° a 23.99°, con un coeficiente de variación (COV) de 7.1% (n = 20). Las diferencias de sexo debidas a variaciones anatómicas no fueron estadísticamente significativas, según se determinó mediante una prueba t de una cola no apareada (p < 0,05). Barra de escala (Panel A) = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Coloque el segmento de aluminio con muestra en el accesorio de sujeción y apriete los tornillos del conjunto.
3. Actuador/placa de carga inferior hasta que esté a unos pocos milímetros de la cabeza femoral.
   NOTA: No precargue la muestra con ninguna fuerza y tenga cuidado de no bajar el actuador demasiado rápido, ya que es muy fácil dañar las muestras.
4. Usando el estereomicroscopio, ajuste la etapa biaxial para alinear la posición de la cabeza femoral directamente debajo de la placa de carga. Bloquee la etapa biaxial en su lugar.
5. En el software MTS, ponga a cero la posición del actuador y equilibre la célula de carga utilizando las teclas programables agregadas en el paso 4.3.
6. Comience el protocolo de carga. Dependiendo de cuánto espacio quede entre la placa de carga y la muestra, las pruebas solo tomarán de 10 a 30 s.
7. Después de la prueba, capture otra radiografía anterior de la muestra. Esto se utilizará para discernir y documentar el modo de fractura (Figura 6).

Figura 6: Imagen de rayos X de muestras después de la prueba. Todas las muestras se fracturaron en una línea bifurcada a través del cuello femoral y a lo largo de la unión del cuello femoral del eje (resaltado por el círculo naranja). Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Análisis de datos

1. Después de la recopilación de datos, exporte los datos de fuerza y desplazamiento a un software (consulte la Tabla de materiales) que permita la elaboración de gráficos y cálculos matemáticos.
2. Trazar la carga vs. desplazamiento para cada muestra (Figura 7A). Ajuste una aproximación lineal al segmento lineal de la curva de carga-desplazamiento. La pendiente de este ajuste lineal definirá la rigidez, una medida de la elasticidad de la muestra.
3. Calcule los resultados adicionales, como la carga máxima, el desplazamiento máximo, la carga de rendimiento, el desplazamiento en el punto de elasticidad, la energía a la carga máxima y la energía al punto de rendimiento.
   NOTA: El punto de rendimiento se puede determinar compensando la aproximación lineal determinada en el paso 6.2 en un 0,2%⁶. El punto en el que la línea de compensación y la carga vs. La intersección de la curva de desplazamiento determinará el punto de rendimiento. En el caso de muestras muy frágiles que muestran poco rendimiento, el punto de elasticidad puede ser el mismo que el punto máximo.

Representative Results

Cuando se colocaron en macetas con la ayuda de la guía, los ejes femorales se alinearon a 21.6 ° ± 1.5 °. Si bien esto representa una desviación del <10% del ángulo previsto de 20 °, los coeficientes de variación (COV) del ángulo de maceta en todas las muestras analizadas fueron del 7,6% y el 6,5% para ratones machos y hembras, respectivamente (n = 10 por grupo) según lo verificado por radiografías planas previas a la prueba (Figura 5). Además, las radiografías posteriores a la prueba deben usarse para evaluar el modo en que fallaron las muestras. El fracaso se observó consistentemente en los cuellos femorales, como se pretendía, de manera bifurcada, con una línea de fractura paralela al eje femoral y la otra línea perpendicular al cuello femoral (Figura 6). Si se produjeran variaciones significativas en el patrón de rotura entre las muestras, entonces la calidad ósea de las muestras podría evaluarse más a fondo a través de μCT midiendo resultados como la densidad mineral ósea volumétrica, el grosor trabecular y cortical, el espaciado y la mineralización. Si la falla no se induce consistentemente en el cuello femoral, las guías impresas en 3D pueden ajustarse.

Las medidas de resultado biomecánicas aquí informadas son consistentes con los valores reportados en flexión axial similar de configuraciones de cuello femoral7,8,9,10,11,12,13,14. Sin embargo, la alineación consistente lograda utilizando las guías impresas en 3D generalmente mejoró el COV de la carga máxima en particular (Tabla 1).

Estudio actual	Sexo	Ángulo del eje medio	Carga máxima	Rigidez	Trabajar hasta el fracaso
	Masculino	8%	10%	20%	24%
	Hembra	7%	9%	35%	38%
Jämsä et al10	Masculino	NR	22%	NR	NR
Jämsä et al8	Masculino	NR	19%	NR	NR
Kamal et al9	Hembra	NR	16%-25%	11%-28%	NR
Middleton et al7	Hembra	NR	24%-27%	NR	NR
Brent et al11	Hembra - ratas	NR	18%-24%	NR	NR
Bromer et al12*	Hembra	NR	11%-27%	NR	NR
Vegger et al13*	Hembra	NR	16%-32%	NR	NR
Lodberg14*	Hembra	NR	11%-45%	NR	NR
NR: No reportado
*: Datos extrapolados de las cifras publicadas

Tabla 1: Coeficientes de variación para las propiedades de flexión medidas de los cuellos femorales de ratón. Los coeficientes de variación representan una relación entre la desviación estándar y la media de un conjunto de datos. A medida que el COV disminuye, esto indica una agrupación más estrecha de los puntos de datos individuales alrededor de la media. Este protocolo disminuyó el COV para la carga máxima en comparación con otras publicaciones que realizaron pruebas similares.

Como era de esperar, se observaron diferencias de sexo en las propiedades mecánicas medidas. Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba t de una cola sin aparear. Los cuellos femorales de ratones machos fueron significativamente más fuertes y rígidos que los especímenes de ratones hembra (p = 0,009 y p = 0,0006, respectivamente). Además, los cuellos femorales femeninos experimentaron deformaciones más significativas (p = 0,014) y trabajaron hasta el fracaso (p = 0,024) en comparación con los especímenes de ratones machos (Figura 7). Esto es consistente con la menor densidad mineral ósea en las mujeres y subraya la sensibilidad de la prueba para detectar diferencias fisiológicamente relevantes. En las cohortes de ratones machos y hembras utilizadas en este estudio, la densidad mineral ósea de los ratones hembra fue significativamente menor que la de sus homólogos masculinos, según lo determinado por una exploración de absorciometría de rayos X de doble energía (DEXA) y una prueba t no apareada de una cola (p = 0,036).

Figura 7: Resultados biomecánicos. (A) Se utiliza una curva de fuerza-desplazamiento representativa, que muestra un ajuste lineal de desplazamiento del 0,2%, para derivar la rigidez y el punto de rendimiento. Las medidas de resultado seleccionadas se trazan por dispersión que muestran la media y la desviación estándar, incluyendo (B) carga máxima (en el fallo), (C) rigidez, (D) desplazamiento máximo (en el fallo) y (E) trabajo a fallo (área debajo de la curva hasta el punto de falla). Los asteriscos indican diferencias significativas determinadas mediante una prueba t no apareada de una cola (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n = 10 por cohorte de sexo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para confirmar que las ligeras variaciones en el ángulo de maceta no contribuyeron a la variabilidad experimental, cada medida de resultado biomecánica se trazó contra el ángulo de maceta y realizó una regresión lineal simple para la cohorte masculina, la cohorte femenina y todas las muestras agrupadas (Figura 8). Luego se probó la hipótesis de que la pendiente de regresión lineal no es cero. El análisis de regresión demostró que, a excepción de la rigidez, las ligeras variaciones en el ángulo de maceta (rango de 18° a 24°) no afectaron las medidas de resultado biomecánicas. Para la rigidez, hubo una correlación lineal significativa con el ángulo de maceta (^R2 = 0,29, p < 0,05).

Figura 8: Efecto del ángulo de maceta en los resultados biomecánicos. Las medidas de resultado biomecánicas que incluyen (A) carga máxima, (B) rigidez, (C) desplazamiento máximo y (D) trabajo hasta el fracaso se trazaron contra el ángulo de maceta y se correlacionaron mediante una regresión lineal simple para la cohorte masculina, la cohorte femenina y todas las muestras agrupadas. Las líneas negras sólidas muestran una regresión lineal de muestras agrupadas, con líneas punteadas que indican intervalos de confianza. La variabilidad en el ángulo de maceta no afectó significativamente la carga máxima, el desplazamiento máximo o el trabajo de falla. Sin embargo, a medida que aumentaba el ángulo de maceta, la rigidez aumentaba, según lo determinado por una prueba de Pearson (p = 0.0126, n = 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Lenguaje de triángulo estándar (. STL) de las guías. Este archivo se puede utilizar para imprimir las guías descritas en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este protocolo describe una prueba confiable de flexión en voladizo para cuellos femorales murinos. El escenario de flexión en voladizo natural que ocurre en el cuello femoral generalmente no está representado en las pruebas estándar de flexión de 3 y 4 ^puntos5. Este método de prueba es mejor y replica de manera más confiable el tipo de fracturas de cuello femoral experimentadas por pacientes con fragilidad ósea. El enfoque principal al realizar este protocolo es eliminar la variabilidad debido a la maceta inconsistente del eje femoral. Críticamente, seguir de cerca los pasos descritos en las secciones primera y cuarta del protocolo asegurará que la creación de las guías y el protocolo de carga replicarán lo que se informa en esta publicación. Como se puede predecir teóricamente y demostrar experimentalmente, el ángulo del eje medio en relación con el eje de carga puede afectar las tensiones experimentadas por el cuello femoral y la probabilidad de que la fractura ocurra en el cuello femoral. Grupos anteriores han demostrado que el ángulo del eje medio influye significativamente en la rigidez y la fuerza compresiva del fémur cuando se carga a través de la cabeza femoral. El análisis paramétrico de los efectos de los ángulos de inclinación del eje medio mostró que los momentos máximos de flexión en los ejes femorales experimentan un mínimo en los ángulos del eje medio entre 15° y 25°, lo que también maximiza la rigidez del ^eje5. Este ángulo, por lo tanto, minimiza la probabilidad de fracturas por compresión en el eje y aumenta la probabilidad de fracturas por flexión en el cuello femoral.

Varios parámetros podrían afectar los resultados de cualquier prueba biomecánica y confundir la capacidad de detectar diferencias significativas debido a variables experimentales fisiológicamente relevantes. Esta variabilidad se ve agravada por el pequeño tamaño de los huesos largos del ratón. Entre los parámetros que requieren atención en esta prueba, en particular, se encuentran el número de ciclos de congelación-descongelación y el estado de hidratación del hueso, la tasa de carga y la alineación del eje femoral en relación con el eje de carga. El protocolo estipula que todas las muestras pasan por el mismo número de ciclos de congelación-descongelación y una ventana de 2 h para la hidratación en PBS a temperatura ambiente. La velocidad de carga también se establece en un valor uniforme de 0,5 mm/^s3,4. Además, las guías impresas en 3D se diseñaron para posicionar consistentemente el fémur en un ángulo de eje medio de ~ 20 ° durante el paso de maceta. Esto dio como resultado ángulos consistentes de los ejes medios en el rango de 18 ° a 24 °, sin efectos sexuales significativos debido a las diferencias anatómicas y los coeficientes de variación de 7.6% y 6.5% para ratones machos y hembras, respectivamente. Estas guías son accesibles, se modifican fácilmente utilizando un software de modelado sólido estándar y se reproducen bajo demanda utilizando una impresora 3D de escritorio de bajo costo.

Los resultados representativos demostraron que el protocolo de prueba es sensible a diferencias fisiológicas sutiles, como el sexo, con un tamaño de muestra razonable de n = 10. Un análisis retrospectivo de potencia que tuvo en cuenta los efectos de tamaño determinados experimentalmente (δ = Δmean/SD) a n = 10 sugirió que la potencia se estimó en un 57% para la carga máxima en la falla (δ = 0.8), >95% para la rigidez (δ = 1.77) y el desplazamiento máximo (δ = 1.9), y 83% para el trabajo a falla (δ = 1.77), respectivamente. Junto con los pequeños coeficientes de variación (Tabla 1), este análisis de potencia confirma que la variación en el ángulo de maceta afectó negativamente la sensibilidad y confiabilidad del protocolo.

El análisis subjetivo del modo de falla también demostró que el 100% de las muestras analizadas fallaron en el cuello femoral, ya que todas ellas mostraron una fractura bifurcada, con una línea de fractura que corre paralela al eje en el sitio donde se encuentra con el cuello y otra línea de fractura perpendicular al cuello femoral en el vértice de la bifurcación. Esto abarca características de dos modos clínicamente relevantes de fracturas de cuello femoral; las fracturas intertrocantéricas y transcervicales de ^cuello15. Las pruebas de flexión en voladizo del cuello femoral no se usan tan comúnmente y se describen en la literatura como las pruebas estándar de torsión o flexión de los ejes medios femorales y tibiales en modelos de roedores de osteoporosis. Solo se identificaron un puñado de estudios para describir dichos protocolos utilizando modelos de ratón y rata5,7,8,9,16,17. El ángulo en el que se colocaron los fémures durante las pruebas no siempre se informa. Algunos con descripciones detalladas utilizan una cantidad excesiva de accesorios y software personalizados para alinear sus ^muestras5, pero aún así recurren a la maceta a mano, introduciendo el mismo error humano en otros protocolos.

Este protocolo está diseñado para muestras murinas y está especificado para ratones C57Bl/ 6, pero podría adaptarse fácilmente a modelos animales grandes u otras cepas murinas con diferente geometría femoral. Los futuros investigadores que utilicen este protocolo pueden necesitar modificar la cantidad de hueso expuesto, ya que el tercer trocánter puede no estar precisamente a 7 mm distalmente de la cabeza femoral. Las modificaciones adicionales al protocolo incluyen el uso de un agente endurecedor que se puede suavizar después de la prueba para liberar la muestra si se desean más pruebas. Esto podría hacerse con una aleación de bismuto que podría fundirse en un baño de agua caliente después de la prueba para liberar la ^muestra7. La modificación final que los usuarios podrían hacer a este protocolo se elude en el paso 3.1, siendo el tipo y posicionamiento de la célula de carga. Se debe utilizar una célula de carga axial con una resolución inferior a 1 N. Una célula de carga de 50 N sería apropiada en función de las cargas máximas observadas. Además, se debe utilizar una célula de carga que solo mida la tensión o la compresión para evitar cualquier momento de flexión de la composición que la célula de carga pueda experimentar por la carga excéntrica en relación con la célula de carga. Otra forma de evitar las mediciones de fuerza compuesta sería fijar la célula de carga al actuador para garantizar que la fuerza de carga esté en línea con la célula de carga.

Este protocolo simplifica la necesidad de accesorios personalizados, describe cómo se pueden imprimir las guías en cualquier impresora 3D disponible comercialmente y utiliza equipos de laboratorio comunes para probar muestras de manera exhaustiva y reproducible, como lo demuestran los coeficientes de variación más bajos reportados en el estudio actual (Tabla 1). Sin embargo, este protocolo no está restringido por la necesidad de una impresora 3D. Existen soluciones disponibles comercialmente, donde los archivos de renderizado 3D se pueden enviar a las empresas de impresión y las piezas se pueden enviar de vuelta. Además, este modo de doblar la carga en el cuello femoral simula la ubicación y los tipos de fracturas clínicamente encontradas. Con el número de personas en alto riesgo de fracturas por fragilidad, se predice que habrá más de 21.3 millones de fracturas de cadera cada año para ²⁰⁵⁰¹⁸. La inmensa carga social, financiera y médica que esto plantea, las pruebas confiables en modelos de roedores pueden mejorar el rigor y la reproducibilidad de la investigación orientada a comprender la etiología de la osteoporosis y la terapéutica para tratarla de manera efectiva.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼” x ¼” square aluminum tubing	Grainger	48KU67	Cut to lengths of 1/2" to 1" lengths
1 kN load cell	Instron	2527-130	Any load cell with sub 1 N resolution can be used.
3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope	Omano	OM2300S-GX4	Microscope used to precisely line up samples with loading platen.
3D printed guides	Custom made		Angled slots at 73.13°, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm
3D printed mount	Custom made		Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.
Acrylic Base Plate Material Kit	Keystone Industries	921392	Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.
Amira	ThermoFisher Scientific		Used to compile µCT scans
Biaxial stage	Custom made		Used to center femoral head of sample under the loading platen.
BioMed Amber Resin	formlabs	RS-F2-BMAM-01	Any resin from formlabs could be used for this project.
Bluehill 3	Instron	V3.66	Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.
ElectroPuls 10000	Instron	E10000	Mechanical testing system
Faxitron UltraFocus	Faxitron BioOptics	2327A40311	X-ray imaging system
Form 2	formlabs	F2	Used to print the mount and guides
Form 2 Resin Tank LT	formlabs	RT-F2-02	LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin
ImageJ	National Institutes of Health	ImageJ	Used to assess µCT and X-ray images
Laxco iLED Series LED Light Source	ThermoFisher Scientific	AMPSILED30W	Light source used in conjugtion with microscope.
Loading platen	Custom made		This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.
Mount attachment	Custom made		To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod
Phosphate Buffer Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010031	Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.
Plumber's putty	Oatey	31174	Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.
PreForm	formlabs	Preform 3.15.2	Formlabs software
Tissue Culture Dish	Corning	353003	Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.
vivaCT 40	Scanco	µCT 40	Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.