Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63525
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 4, 4, 1
1Otolaryngological Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3Orthopedic Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 4Department of Immunology, Fourth Military Medical University
* These authors contributed equally

Summary

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s), המעורבים בדלקת מסוג 2, משתתפים בעיקר בתגובה לזיהום הלמינת'ס, מחלות אלרגיות, הומאוסטזיס מטבולי ותיקון רקמות. במחקר זה מודגם הליך לבידוד ILC2s מרירית האף וזיהוי הביטוי של CD226.

Abstract

עם מחקרים רבים על תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s) שפורסמו לאורך השנים, ILC2s ידועים כמעורבים בוויסות תהליכים פתולוגיים שונים, כולל חסינות נגד הלמינת'ס, תיקון רקמות, תרמוגנזה, ומחלות אוטואימוניות כגון אסטמה ונזלת אלרגית (AR). ILC2s שוכנים דרך קבע ברקמות היקפיות כגון העור, המעיים, הריאות וחלל האף; עם זאת, יש מידע מוגבל על הפונקציות המדויקות שלהם חסינות רירית האף. CD226 היא מולקולה קוסטימולטורית מפעילה, המתבטאת בעיקר בתאי הרג טבעי (NK), תאי T ומונוציטים דלקתיים. עם זאת, האם ILC2s מבטאים CD226 או ממלאים תפקיד בפתוגנזה של מחלות הקשורות ל- ILC2s עדיין לא ידוע. כאן, ביססנו שיטה לבודד ולזהות ILC2s מרירית האף וזיהינו ביטוי CD226 על ILC2s שהתקבל מעכברים בריאים ועכברי AR. במאמר זה נתאר פרוטוקול זה לבידוד וזיהוי של ILC2s מרירית האף של עכבר, אשר יסייע לחקור את המנגנון הפתולוגי הפנימי של הפרעות אימונולוגיות במחלות רירית האף.

Introduction

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s) התגלו לראשונה ברקמות חלל הצפק של עכברים ולאחר מכן הוכחו כנמצאים בדם וברקמות היקפיות אחרות כגון הריאות, העור וחלל האף 1,2,3. כתאים שוכנים ברקמות, ILC2s נשמרים ומתרבים בעיקר באופן מקומי ומתפקדים כשומרים הראשונים המגיבים לגירויים מזיקים אקסוגניים באמצעות ייצור ציטוקינים רבים מסוג 2 וגרימת חסינות מסוג 2 4,5,6. ILC2s יכולים גם להפעיל את השפעתם על ידי סחר לכיוון הרקמות הנגועות 7,8.

בדומה לתאי T-helper 2 (Th2), רשתות הבקרה המסובכות של ILC2s מבטיחות את מעורבותם המשמעותית בהתקדמות מחלות דלקתיות שונות מסוג 2, כולל מחלות אלרגיות בדרכי הנשימה 8,9. באסתמה, אזעקות שמקורן בתאי אפיתל יכולות להפעיל את ILC2s, אשר מקדמים עוד יותר דלקת ריאות באמצעות הפרשת אינטרלוקין (IL)-4, IL-5 ו- IL-1310. מחקרים קליניים הצביעו גם על כך שרמות ILC2 היו גבוהות באופן משמעותי בכיח ובדמם של חולים עם אסתמה חמורה, דבר המצביע על קשר של ILC2s עם חומרת האסתמה ותפקודם כמנבא להתקדמות אסתמה11.

נזלת אלרגית (AR) היא מחלה דלקתית כרונית נפוצה המשפיעה על מיליוני אנשים מדי שנה, והטיפולים היעילים למחלה זו מוגבלים12,13. ILC2s ממלאים תפקידים מכריעים בפתופיזיולוגיה של מציאות רבודה, בין אם בשלב הרגישות או ביצירת סימפטומים ושלבהדלקת 14. בחולים עם AR, רמות ILC2 בדם ההיקפי דווחו כגבוהות הן מקומית והן מערכתית15. עם זאת, השפעות מסוימות והמנגנונים הבסיסיים של ILC2s על הפתופיזיולוגיה וההתקדמות של AR עדיין דורשים חקירה נוספת.

CD226 - גליקופרוטאין טרנסממברנה המשמש כמולקולה קוסטימולטורית - מתבטא בעיקר בתאי הרג טבעי (NK), תאי T ומונוציטים דלקתיים אחרים16,17. האינטראקציה של CD226 והליגנדות שלו (CD155 ו / או CD112) או המתחרה (TIGIT) מאפשרת לו להשתתף בתפקודים הביולוגיים של תאי חיסון שונים18. קשירת הליגנדות על תאים מציגי אנטיגן ל- CD226 על לימפוציטים ציטוטוקסיים (CTL) מקדמת את ההפעלה של שני התאים בו זמנית, בעוד שההפעלה של CTL יכולה להיות מדוכאת עוד יותר על ידי TIGIT (קולטן חיסוני של תאי T עם תחומי Ig ו- ITIM), המתחרה של CD22619,20. מחקר אנושי ex vivo גילה כי CD226 ו- CD155 על תאי T מווסתים את האיזון בין Th1/Th17 ו- Th2 באמצעות אפנון דיפרנציאלי של תת-קבוצות Th21. CD226 יכול גם לתווך הידבקות טסיות ופעילות קוטלת גידוליםNK 22,23. בינתיים, CD226 נחקר היטב בפתוגנזה של מחלות זיהומיות שונות, מחלות אוטואימוניות וגידולים 18,24,25. כיום, CD226 הפך לנקודת אור חדשה עבור אימונותרפיה. מחקרים מצאו כי שלפוחיות חוץ-תאיות יכולות להפוך את ביטוי CD226 על תאי NK כדי להחזיר את פעילותם ציטוטוקסית ולהתערב בהתקדמות סרטן ריאות26. מחקר שנערך לאחרונה חשף תת-אשכול של ILCs מקבוצת המעי העוברי 3 המאופיין בביטוי CD226 גבוה על ידי ריצוף RNA חד-תאי27, אשר הצביע על כך ש- CD226 עשוי למלא תפקידים בחסינות המולדת בתיווך תאי הלימפה.

הידע שלנו על ILC2s בדלקת בדרכי הנשימה מבוסס בעיקר על מחקרים על אסתמה; עם זאת, מעט ידוע על תפקידיהם בחסינות רירית האף. לפיכך, נקבע פרוטוקול לבידוד וזיהוי ILC2s מרירית האף. המחקר מתמקד בביטוי CD226 על ILC2s ברקמות האף והשונות שלו בין עכברים בריאים לעכברים AR. זה עשוי לספק תובנות חדשות על המנגנונים הבסיסיים של רגולציה בתיווך ILC2 במערכת החיסון המקומית ולשמש בסיס לפיתוח גישות חדשות לטיפול במציאות רבודה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הנהלים והפרוטוקולים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר המדעי באוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית (מס '20211008).

1. הקמת מודל Murine AR

  1. בית זכרים ונקבות עכברים מסוג בר (WT) C57BL/6 בגילאי 8-12 שבועות בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים ומספקים צ'או מעבדה סטנדרטי ומים.
  2. תחליב 50 מיקרוגרם של ovalbumin (OVA) ב 0.2 מ"ל של PBS סטרילי המכיל 2 מ"ג של הידרוקסיד אלומיניום על ספסל נקי כדי לשמור על סטריליות. בימים 0, 7 ו-14, יש להזריק תוך צפקית לעכברים נקבות או זכרים 50 מיקרוגרם כל אחד של OVA מתחלב.
  3. בימים 21, 22, 23, 24 ו-25, החדרה תוך-אפית של עכברים עם 50 מיקרוגרם של OVA מומס ב-30 מיקרוליטר של PBS סטרילי (15 מיקרוליטר לנחיר) תחת הרדמה באינהלציה (2-3% איזופלורן עם קצב זרימת חמצן או 0.5 ליטר/דקה).
  4. הרדימו את העכברים 24 שעות לאחר האתגר האחרון (יום 26).

2. בידוד תאים חד-גרעיניים (MNCs) מרירית האף

  1. הרדימו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם בהרדמה עמוקה. השרו את ראש העכברים באתנול 75% למשך 5 דקות והימנעו מכניסת אתנול לנחיר החיצוני. הניחו את הבטן כלפי מטה על שולחן הניתוחים.
  2. חתכו את השיניים הקדמיות. בקו האמצע של הראש, לעשות חתך, לחתוך לפתוח את העור באמצעות מספריים.
  3. מוציאים את הלסת התחתונה, חותכים את כל האף לאורך קצה החיך, ומניחים את הרקמה בתוך צלחת פטרי 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל PBS קר כקרח. בעזרת מספריים ומלקחיים, להסיר את הבשר והשרירים דבק העצמות.
  4. העבירו את אף העכבר לצלחת פטרי חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה 5 מ"ל PBS קר כקרח. לשטוף את העצמות פעמיים עם 5 מ"ל של PBS קר כקרח.
  5. מעבירים את האף לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  6. יש לרסק ולהעביר את האף במידה מספקת לצינור של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של חיץ עיכול שחומם מראש (RPMI 1640 בינוני בתוספת 1 מ"ג/מ"ל של collagenase IV ו-10 U/mL DNase I).
  7. הדקו את המכסה והניחו את הצינור אנכית בשייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37°C, עם תסיסה מתמשכת ב-120-150 סל"ד למשך 40 דקות.
    הערה: חממו מראש את מאגר העיכול ל-37°C כדי להשיג את פעילות האנזים הגבוהה ביותר.
  8. הוסף 5 מ"ל של סל"ד קר כקרח 1640 בינוני המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לעצור את תהליך העיכול.
  9. סנן דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר כדי להסיר שברים מוצקים.
  10. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן בעדינות להשליך את supernatant.
  11. השהה מחדש את הגלולה בסל"ד קר כקרח 1640 בינוני וצנטריפוגה ב 500 x גרם למשך 5 דקות. השליכו בעדינות את הסופרנטנט.
  12. השהה מחדש את גלולת התא ב- 4 מ"ל של מדיה הדרגתית בצפיפות של 40% (160 מיקרוליטר של 10x PBS + 1.44 מ"ל של תמיסת מלאי מדיה הדרגתית בצפיפות + 2.4 מ"ל של מדיום RPMI 1640).
  13. הכנס בעדינות פיפטת פסטר לתחתית הצינור והוסף באיטיות 2.5 מ"ל של מדיה הדרגתית בצפיפות 80% (200 μL של 10x PBS + 1.8 מ"ל של תמיסת מלאי מדיה הדרגתית צפיפות + 0.5 מ"ל של מדיום RPMI 1640).
  14. הגדר את קצב ההאצה וההאטה של הצנטריפוגה נמוך יותר מההילוך השלישי והצנטריפוגה על 400 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  15. הסר את השכבה העליונה של זיהומים לפני ניקוז התאים בממשק כדי למנוע זיהום פוטנציאלי. נקז בזהירות את שכבת התאים החד-גרעיניים (MNCs) בממשק המדיה ההדרגתית בצפיפות של 40%/80% לתוך צינור של 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל PBS קר כקרח באמצעות פיפטה. שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים.

3. צביעת פני שטח לניתוח FCM

  1. קצור את התאים ואת הצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F). השהה מחדש את גלולת התא במאגר צביעה (PBS בתוספת 2% FBS ו- 0.1% NaN3) וצנטריפוגה ב- 500 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
    אזהרה: יש לנקוט משנה זהירות בעת הכנת חיץ הצביעה. NaN3 רעיל מאוד ועלול לגרום נזק לאיברים אם נבלע, נשאף, או בא במגע עם העור. כמו כן, הימנעו משחרור לסביבה.
  2. השהה מחדש את התאים בתמיסת חסימה של 80 μL (נוגדן אנטי-CD16/32 (1:100) מדולל במאגר צביעה) לכל צינור. לדגור במשך 30 דקות בחושך ב 4 °C (75 °F).
  3. ללא שטיפה, יש להוסיף 20 μL של הדילול המתאים של קוקטייל הנוגדנים המכתים את פני השטח (טבלה 1).
  4. יש להוסיף 1 μL (לכל בדיקה) של צבע כדאיות קבוע 520 (FVD) ממש לפני הוספת קוקטייל הנוגדנים לדגימות. יש לדגור בחושך ב-4°C למשך 30 דקות. הגדר נוגדני איזוטיפ תואמים ופלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) כבקרות השליליות.
  5. לשטוף את התאים ב 500 μL של חיץ צביעה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  6. להשהות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של חיץ צביעה. הוסיפו 50 μL של חרוזי ספירה מוחלטים מערבולת לתאים המוכתמים והתסיסו. חשוף אותם לניתוח ציטומטריית זרימה (FCM).
    הערה: נתוני FCM התקבלו באמצעות מנתח תאים ספקטרלי ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה (FCM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל מורין המושרה על ידי OVA פותח כדי לחקור את התפקיד של ILC2s במציאות רבודה. בניית מודל AR murine התבססה על מחקרים קודמים עם שינויים קלים 28,29,30,31. סרטון בן 10 דקות צולם כדי למדוד את תדירות ההתעטשות והגירוד באף לאחר אתגר האף האחרון. תסמינים אלרגיים של עכברי AR הנגרמים על ידי OVA הוצגו באיור 1. תדירות שפשוף האף והתעטשות בעכברי AR הייתה גבוהה משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת.

לאחר מכן, תיארנו הליך לבידוד MNCs מרירית האף וביצוע האפיון שלהם באמצעות ניתוח FCM. בערך 2-3 x 106 לימפוציטים התקבלו מכל אף מורין. התאים המתים לא נכללו בצביעת FVD. אסטרטגיית ה-gating עבור תאי ILC2 בקרב התאים המבודדים הייתה Lin (CD11b, CD11c, CD3 ו-B220) - תאי CD45+ CD90.2+ KLRG1+. כל השערים שורטטו על בסיס איזוטיפ או בקרת FMO. בדרך כלל, ~2%-3% מתאי Lin-CD45+ זוהו ברירית האף של עכברי ביקורת בריאים (איור 2). המספר המוחלט של ILC2s ברירית האף נע בין 2,000-4,000.

לאחר מכן בודדנו את ILC2s מעכברי AR באמצעות השיטה שתוארה לעיל. לא היה הבדל במספרים המוחלטים של לימפוציטים בין עכברי HC ועכברי AR. תוצאות FCM הצביעו על כך שהחלק של ILC2s בעכברי AR היה 9%-14% מהמספר הכולל של לימפוציטים מסוג Lin-CD45+, מה שמצביע על עלייה יוצאת דופן במספר ILC2s ברירית האף של AR בהשוואה לזה של עכברי ביקורת בריאים (איור 3).

זיהינו את הביטוי של CD226 ב- ILC2s. בממוצע, 51.9% מ- ILC2s ביטאו CD226 בתנאים לא מחוסנים, בעוד שהיחס הממוצע של ILC2s המבטאים CD226 היה 54.8% בעכברי AR, אשר הראה נטייה לא מובהקת לעלייה בהשוואה לזו בעכברי ביקורת. בנוסף לתדירות התא, רמת הביטוי של פני התא של CD226 נקבעה גם באמצעות עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (MFI) שחושבה באופן אוטומטי על ידי תוכנת ניתוח FCM. באופן מעניין, ה-MFI של CD226 היה מווסת באופן משמעותי בעכברי AR בהשוואה לעכברי הביקורת (איור 4), מה שמצביע על ביטוי מוגבר של CD226 על ILC2s של רירית האף האלרגית.

Figure 1
איור 1: מודל AR מורין המושרה על ידי OVA. (A) התרשים הסכמטי של הקמת מודל ה-AR של מורין. תדירות שפשוף האף (B) והתעטשות (C) בפרק זמן של 10 דקות. הערכים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD) (n = 3). לצורך השוואה בין שתי הקבוצות, בוצע מבחן t של התלמיד; P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית FCM gating עבור ILC2s. MNCs בודדו כמתואר לעיל. (A) גרפיקת הצפיפות מדגימה את ההתפלגות של MNCs מבודדים לאורך צירי FSC ו-SSC. (B) סינגלים היו מגודרים על בסיס מאפייני FSC. (C) תאי לין הוגדרו כביטוי שלילי CD11b, CD11c, CD3 ו-B220 כדי להוציא את התאים המיאלואידים, תאי B ותאי T בתאי MNC. תאים מתים הוצאו באמצעות צביעת צבע כדאיות ניתנת לתיקון (FVD). (D) ILCs מאופיינים על ידי Lin− CD45+. (E) ILC2s מגודרים על ידי CD90.2+ KLRG1+ בקרב ILCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ILC2s ברירית האף של עכברים בריאים ועכברי AR. (A) תמונות FCM מייצגות ממחישות את הפרופורציות של ILC2s בקרב ILCs מרירית חלל האף של קבוצת בקרה בריאה (HC) ו-AR. (B) הפרופורציות של ILC2s בתאי Lin-CD45+ בקבוצות HC ו-AR. הערכים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). מבחן t של התלמיד בוצע להשוואה בין שתי קבוצות. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ביטוי CD226 ברירית האף ILC2s. ILC2s אופיינו באמצעות האסטרטגיה הנ"ל. הביטוי של CD226 ב- ILC2s הוערך באמצעות FCM. (A) היסטוגרמות מייצגות של ביטוי CD226 בקבוצות HC ו-AR; האזור הכחול מייצג את פקד CD226 FMO. (ב,ג) הפרופורציות של CD226-positve ILC2s ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (MFI) של CD226 בקבוצת HC ובקבוצת AR. הערכים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 3). מבחן t של התלמיד בוצע לצורך השוואה בין שתי הקבוצות. P < 0.05 נחשב משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן פלואורוכרום שיבוט דילול
CD11b FITC M1/70 1:100
CD11c FITC N418 1:200
CD226 PE/ציאנין7 10ה5 1:50
CD3e FITC 145-2ג11 1:100
CD45 Alexa Fluor 700 30-F11 1:200
CD45R(B220) FITC RA3-6B2 1:100
CD90.2 PE 30-H12 1:100
KLRG1 נגמ"ש 2F1 1:160

טבלה 1: קוקטייל נוגדנים מכתים על פני השטח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ILC2s קשורים קשר הדוק עם דלקת מסוג 2 והפרעות דלקתיות, כפי שהודגם במספר גדל והולך של מחקרים. הן מודלים של עכברים והן תצפיות אנושיות תורמים להבנה טובה יותר של תפקודו בדרכי הנשימה העליונות. בפתופיזיולוגיה של אסתמה, ILC2s מופעלים באמצעות לימפופיאטין סטרומה תימי, IL-25 ו- IL-33, המיוצרים בעיקר על ידי תאי אפיתל. לאחר מכן משקפים תאי Th2, ILC2s מייצרים IL-4, IL-5 ו- IL-13 כדי להחמיר דלקת מסוג2 32. יתר על כן, תת-קבוצות שונות של ILC2s מייצרות גם IL-10 ו- IL-1733,34,35. מציאות רבודה היא גם סוג של דלקת אלרגית בדרכי הנשימה המונעת על ידי תאים מסוג 2. השתתפותם של ILC2s בפתופיזיולוגיה של מציאות רבודה הודגמה לאחרונה14. עם זאת, מנגנוני הרגולציה הפוטנציאליים של ILC2s תחת AR עדיין אינם ידועים במידה רבה.

ראיות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין ILC2s שונים עשויה להסתמך על מולקולות פני השטח36. לדוגמה, הן ICOS והן ICOS-ligands המבוטאים ב- ILC2s נחוצים להישרדותם ולתפקודם37. בנוסף, ILC2s מבטאים גם ICAM-1 ו-LFA-1, אשר מפעילים השפעות חשובות על נדידת תאים ואינטראקציה בין תאים 7,38. נוסף על כך, ILC2s יכולים להצליב תאים חיסוניים אחרים דרך מולקולות אלה שעל פני התא. לדוגמה, OX40L הוא מתווך דומיננטי לאינטראקציה בין תאי T CD4+ ו- ILC2s בדלקת ריאות39. מאחר ש-CD226, כמולקולה קוסטימולטורית טרנסממברנלית, מתבטא בתאי חיסון שונים, הערכנו במחקר זה גם את ביטויו ב-ILC2s ברקמות אף מעכברים בריאים ומעכברי מציאות רבודה.

מידול AR כללי המושרה על ידי OVA כולל רגישות מערכתית תוך צפקית וגירוי מקומי תוך אפי, אשר בדרך כלל דורשים לפחות 3-4 שבועות כדי להשיג תוצאות מידול משביעות רצון31. מודל AR נוסף הנגרם על ידי OVA באף בלבד לוקח זמן דומה לשיטת המודל הכללי כדי להשיג רמה משוערת של דלקת מסוג 2 ותסמיני AR40. עם זאת, מספרם ותפקודם של ILC2s באף על ידי שתי שיטות מידול AR אלה עדיין דורשים מחקר נוסף. הערכנו התעטשות ושפשוף באף כדי להעריך תסמיני מציאות רבודה. למרות שיהיה משכנע יותר לכלול את ההערכה עבור קרנף, מצאנו שקשה לראות את הקרנף מבלי להפריע להתנהגות העכברים במהלך ההערכה, ולכן למרבה הצער לא נכללו בקריטריונים אלה. בנוסף, ההערכה עבור התעטשות ושפשוף האף עשויה להיות מעמיקה מספיק כדי להמחיש את חומרת תסמיני AR מורין עבור רבים מהמאמרים הרלוונטיים שהשתמשו רק בשני קריטריונים אלה41,42,43.

מחקרים קודמים על עכברים ILC2s האף תיארו את הבידוד של רירית האף מורין44,45. הפרוטוקול שלהם הוא כדלקמן: בקצרה, להסיר את הרקמה הרכה סביב הגולגולת, לפתוח את עצם האף כדי לחשוף את חלל האף, ולגרד את רקמת רירית האף מפני השטח של הגולגולת עם מלקחיים. בעוד שרוב הרירית המבודדת שימשה עבור IF, IHC או qPCR, מעט מאוד מדווח על הבידוד הבא של תאים חד-גרעיניים (MNCs) וניתוח FCM. במחקר זה, בהתחשב בכמויות הנמוכות של ILC2s הממוקם ברירית האף, הניתוח שמר על הנפח המרבי של רירית האף על ידי עיכול האף כולו במקום להפשיט את הרירית מפני השטח של עצם האף. כדי למטב את פרוטוקול העיכול, הערכנו שלושה חומרי עיכול: 0.5 מ"ג/מ"ל של collagenase IV, 1 מ"ג/מ"ל של collagenase IV, ו-1 מ"ג/מ"ל של collagenase IV ו-10 U/mL DNase I, והשווינו את אחוז התאים החיים ותדירות הלימפוציטים שהתקבלו על-ידי שלושת אמצעי העיכול האלה. שיעור התאים החיים הנרכשים בכל שלושת המדיות אינו שונה (90%-95%); עם זאת, שני סוגי העיכול הראשונים לא היו מספיקים עם תדירות לימפוציטים נמוכה יותר (~ 5%). לפיכך, 1 מ"ג/מ"ל של collagenase IV ו-10 U/mL של DNase I נבחרו כחומר התקציר במחקר זה. עם זאת, אנזימים אחרים כגון liberase ו dispase שעשויים להחליף collagenase לא נחקרו. מאחר שסוג וריכוז האנזימים קריטיים לקיום התא ולביטוי מולקולות התא46,47, השימוש והמינון של חלופות אלה במהלך עיכול האף עדיין דורשים חקירה ואופטימיזציה קפדנית. השתמשנו ב- FVD eFluor 520 כדי לבדוק את כדאיות התא, מכיוון שניתן לזהות אותו באמצעות מסנן מעבר פס 530/30 המקביל ל- FITC, כך שנוכל להוציא את התאים המתים בזמן שהם מעלים תאי לין. צבעי כדאיות תאים אחרים הם גם אופציונליים על פי לוחות נוגדנים ספציפיים. יתר על כן, במקום צביעה תוך תאית של גורמי שעתוק GATA3, המבוצעת בדרך כלל במחקרים אחרים הקשורים ל- ILC2, ILC2s במחקר הנוכחי אופיינו על בסיס סמנים על פני התא כגון Lin (CD11b, CD11c, CD3 ו- B220), CD45, CD90.2 ו- KLRG1 בניתוח FCM. ביניהם, KLRG1 מבוטא על ILC2s זוהה כסמן ספציפי של רקמה בוגרת ILC2s48,49. למרות CD90.2 הוא פחות ספציפי, הוא עדיין מקובל כסמן משטח50 המשויך ל- ILC2. במחקר זה, עכברים לא נבדלו לפי מין. מחקרים הראו כי השפע והאנטיגנים של תאי ILCs ריאתיים בעכברים שונים במגדר, אך עדיין יש לחקור את המתאם של ILC2s באף עם מגדר50. בנוסף, הפרוטוקול לא התמקד בשיעור התאים ההמטופויטיים האחרים. לוחות נוגדנים שונים של FCM יסייעו לפתור בעיה זו.

פרוטוקול זה תיאר שיטה לבידוד ILC2s מרירית האף. ניתן להכתים את ה-ILC2s המבודדים לצורך אפיון FCM, למיין אותם לתרבית תאים או לגרות אותם במבחנה לצורך ניתוחים נוספים. בהתאם לממצאי המחקרים הקודמים 10,45,51, נצפתה הצטברות משמעותית של ILC2s ברירית האף של עכברי AR. יש לציין כי CD226 התבטא ב-ILC2 מקומי, ורמתו עלתה משמעותית עוד יותר במצבים אלרגיים. לכן, הממצאים במחקר זה מצביעים על מעורבות של CD226 במציאות רבודה תלוית ILC2. האם ILC2s בחולים עם AR מבטאים CD226 והאם ביטוי CD226 על ILC2s עולה במצבים אלרגיים צריך להיחקר במחקרים עתידיים.

לסיכום, קבענו פרוטוקול לבידוד וזיהוי ILC2s מרירית האף וזיהינו ביטוי של מולקולות הידבקות בתוכם. הפרוטוקול דורש אופטימיזציה נוספת; עם זאת, היעדר מחקרים המתארים באופן שיטתי ודק את הליך הבידוד והאפיון של לימפוציטים, במיוחד תאי לימפה מולדים ברירית האף, הופך פרוטוקול זה להתייחסות ראשונית עבור חוקרים החוקרים את הסביבה החיסונית המקומית של האף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

R.Z. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81871258) וכספים שסופקו על ידי האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית (No.2020rcfczr). י.ז. נתמך על ידי תוכנית המחקר הבסיסית למדעי הטבע של שאאנשי (מס' 2021JM-081).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum hydroxide Meilun biological Technology 21645-51-2
CD11b eBioscience 11-0112-82 Used in antibody coctail
CD11c BioLegend 117306 Used in antibody coctail
CD16/32 BioLegend 101302 Clone: 93; Dilution 1:100
CD226 BioLegend 128812 Used in antibody coctail
CD3e BioLegend 100306 Used in antibody coctail
CD45 BioLegend 103128 Used in antibody coctail
CD45R eBioscience 11-0452-82 Used in antibody coctail
CD90.2 BD Pharmingen 553014 Used in antibody coctail
Collagenase IV DIYIBio DY40128
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950 absolute counting beads
Dnase Equation 1 Beyotime D7076
Fetal Bovine Serum gibco 10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) eBioscience 65-0867-14 FVD
HBSS, calcium, magnesium Servicebio G4204-500
KLRG1 eBioscience 17-5893-81 Used in antibody coctail
NaN3 SIGMA S2002
NovoExpress software AgilentTechnologies Version 1.5.0 flow cytometry (FCM) analysis software
OVA SIGMA 9006-59-1
PBS, 1x Servicebio G4202-500
PBS, 10x Servicebio G4207-500
Percoll Yeasen 40501ES60 density gradient media
RPMI 1640 culture media Corning 10-040-CVRV
Spectral cell analyzer SONY SA3800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  2. Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
  3. Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
  4. Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
  5. Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
  6. Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
  7. Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
  8. Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
  9. Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
  10. Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
  11. Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
  12. Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
  13. Wheatley, L. M., Togias, A. Clinical practice. Allergic rhinitis. The New England Journal of Medicine. 372 (5), 456-463 (2015).
  14. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 95 (2020).
  15. Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
  16. Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
  17. Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
  18. Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
  19. Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
  20. Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
  21. Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
  22. Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
  23. Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
  24. Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
  25. Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
  26. Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
  27. Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
  28. Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
  29. Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
  30. Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
  31. Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
  32. Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  33. Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
  34. Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
  35. Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
  36. Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
  37. Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
  38. Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
  39. Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
  40. Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
  41. Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
  42. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
  43. Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
  44. Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
  45. Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
  46. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  47. Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
  48. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  49. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  50. Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
  51. Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 183
בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang,… More

Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang, Y., Cheng, K., Zhuang, R., Bian, K. Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226. J. Vis. Exp. (183), e63525, doi:10.3791/63525 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter