Summary
As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.
Abstract
Com abundantes pesquisas sobre células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) publicadas ao longo dos anos, as ILC2s são amplamente conhecidas por estarem implicadas na regulação de vários processos patológicos, incluindo imunidade anti-helmíntica, reparo tecidual, termogênese e doenças autoimunes como asma e rinite alérgica (RA). As ILC2s residem permanentemente em tecidos periféricos como pele, intestino, pulmões e cavidade nasal; no entanto, há informações limitadas sobre suas funções exatas na imunidade da mucosa nasal. CD226 é uma molécula costimulatória ativadora, expressa principalmente em células natural killer (NK), células T e monócitos inflamatórios. No entanto, se ILC2s expressam CD226 ou desempenham um papel na patogênese de doenças relacionadas a ILC2s permanece desconhecido. Aqui, estabelecemos um método para isolar e identificar ILC2s da mucosa nasal e detectamos a expressão de CD226 em ILC2s obtidas de camundongos saudáveis e AR. Neste artigo, descrevemos este protocolo para o isolamento e identificação de ILC2s da mucosa nasal de camundongos, o que ajudará a explorar o mecanismo patológico interno de distúrbios imunológicos em doenças da mucosa nasal.
Introduction
As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) foram descobertas pela primeira vez nos tecidos da cavidade peritoneal de camundongos e, posteriormente, demonstraram estar presentes no sangue e em outros tecidos periféricos, como pulmões, pele e cavidade nasal 1,2,3. Como células residentes no tecido, as ILC2 são principalmente mantidas e proliferam localmente e funcionam como os primeiros guardas respondendo a estímulos nocivos exógenos através da produção de numerosas citocinas do tipo 2 e indução de imunidade do tipo 2 4,5,6. As ILC2 também podem exercer seus efeitos pelo tráfico para os tecidos infectados 7,8.
Semelhante às células T-helper 2 (Th2), as complicadas redes regulatórias das ILC2s garantem seu envolvimento significativo na progressão de várias doenças inflamatórias do tipo 2, incluindo doenças alérgicas das vias aéreas 8,9. Na asma, alarminas derivadas de células epiteliais podem ativar ILC2s, que promovem inflamação pulmonar através da secreção de interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Estudos clínicos também indicaram que os níveis de ILC2 estavam significativamente elevados no escarro e no sangue de pacientes com asma grave, sugerindo uma associação de ILC2s com a gravidade da asma e sua função como preditor da progressão da asma11.
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica comum que afeta milhões de pessoas anualmente, e os tratamentos efetivos para essa doença são limitados12,13. As ILC2 desempenham papéis cruciais na fisiopatologia da RA, seja na fase de sensibilização ou na fase de geração de sintomas einflamação14. Em pacientes com RA, os níveis de ILC2 no sangue periférico têm sido relatados como elevados local e sistemicamente15. No entanto, certos efeitos e os mecanismos subjacentes da ILC2s sobre a fisiopatologia e a progressão da RA ainda requerem maior exploração.
CD226 - uma glicoproteína transmembrana que serve como molécula costimulatória - é expressa principalmente em células natural killer (NK), células T e outros monócitos inflamatórios16,17. A interação do CD226 e seus ligantes (CD155 e/ou CD112) ou competidores (TIGIT) permite que ele participe das funções biológicas de várias células imunes18. A ligação dos ligantes nas células apresentadoras de antígenos ao CD226 no linfócito citotóxico (CTL) promove a ativação de ambas as células simultaneamente, enquanto a ativação da CTL pode ser posteriormente suprimida pelo TIGIT (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), competidor do CD22619,20. Um estudo humano ex vivo revelou que CD226 e CD155 em células T regulam o equilíbrio entre Th1/Th17 e Th2 através da modulação diferencial dos subgrupos Th21. O CD226 também pode mediar a adesão plaquetária e a atividade de morte do tumor NK22,23. Enquanto isso, o CD226 é bem estudado na patogênese de várias doenças infecciosas, doenças autoimunes e tumores 18,24,25. Atualmente, o CD226 tornou-se um novo ponto brilhante para a imunoterapia. Estudos constataram que vesículas extracelulares podem reverter a expressão de CD226 nas células NK para restabelecer sua atividade citotóxica e intervir na progressão do câncer de pulmão26. Um estudo recente revelou um subgrupo de ILCs do grupo 3 intestinal fetal caracterizado com alta expressão de CD226 por sequenciamento de RNA de célula única27, o que indicou queCD226 pode exercer papéis na imunidade mediada por células linfoides inatas.
Nosso conhecimento sobre ILC2s na inflamação das vias aéreas é baseado principalmente em estudos sobre asma; entretanto, pouco se sabe sobre suas funções na imunidade da mucosa nasal. Assim, foi estabelecido um protocolo para isolar e identificar ILC2s da mucosa nasal. O estudo enfoca a expressão de CD226 em ILC2s em tecidos nasais e sua variação entre camundongos saudáveis e AR. Isso pode fornecer novos insights sobre os mecanismos subjacentes da regulação mediada por ILC2 na imunidade local e servir como base para o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Científica da Quarta Universidade Militar de Medicina (nº 20211008).
1. Estabelecimento do modelo de RA murino
- Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas do tipo selvagem (WT) domésticos com idade entre 8-12 semanas sob condições específicas livres de patógenos e fornecem ração e água padrão de laboratório.
- Emulsionar 50 μg de ovalbumina (OVA) em 0,2 mL de PBS estéril contendo 2 mg de hidróxido de alumínio em uma bancada limpa para manter a esterilidade. Nos dias 0, 7 e 14, injetar intraperitonealmente camundongos fêmeas ou machos com 50 μg cada de óvulos emulsionados.
- Nos dias 21, 22, 23, 24 e 25, instilar por via intranasal camundongos com 50 μg de OVA dissolvidos em 30 μL de PBS estéril (15 μL por narina) sob anestesia inalatória (isoflurano a 2-3% com fluxo de oxigênio ou 0,5 L/min).
- Eutanasiar os camundongos 24 h após o último desafio (dia 26).
2. Isolamento de células mononucleares (CMNs) da mucosa nasal
- Eutanásia dos camundongos por deslocamento cervical sob anestesia profunda. Mergulhe a cabeça dos camundongos em etanol 75% por 5 min e evite a entrada de etanol na narina externa. Coloque o abdome para baixo na mesa de cirurgia.
- Corte os dentes anteriores. Na linha média da cabeça, faça uma incisão e corte a pele usando uma tesoura.
- Remova a mandíbula inferior, corte todo o nariz ao longo da extremidade do palato e coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 mm contendo 5 mL de PBS gelado. Usando tesouras e pinças, remova a carne e os músculos aderidos aos ossos.
- Transfira o nariz do rato para uma nova placa de Petri de 60 mm contendo 5 ml de PBS gelado. Lave os ossos duas vezes com 5 mL de PBS gelado.
- Transfira o nariz para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Esmagar suficientemente e transferir o nariz para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão digestor pré-aquecido (meio RPMI 1640 suplementado com 1 mg/mL de colagenase IV e 10 U/mL de DNase I).
- Aperte a tampa e coloque o tubo verticalmente em um agitador orbital a 37 °C, com agitação contínua a 120-150 rpm por 40 min.
NOTA: Pré-aqueça o tampão digestivo a 37 °C para atingir a mais alta atividade enzimática. - Adicionar 5 mL de meio RPMI 1640 gelado contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) para interromper o processo de digestão.
- Filtrar através de um filtro de células de 70 μm para remover fragmentos sólidos.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 minutos e, em seguida, eliminar suavemente o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet em meio RPMI 1640 gelado e centrífugo a 500 x g por 5 min. Descarte suavemente o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 4 mL de meio com gradiente de densidade de 40% (160 μL de 10x PBS + 1,44 mL de solução estoque de meio com gradiente de densidade + 2,4 mL de meio RPMI 1640).
- Introduzir suavemente uma pipeta Pasteur no fundo do tubo e adicionar lentamente 2,5 ml de meio com gradiente de densidade de 80% (200 μL de 10x PBS + 1,8 ml de solução de meio de gradiente de densidade + 0,5 ml de meio RPMI 1640).
- Ajuste a velocidade de aceleração e desaceleração da centrífuga inferior à terceira marcha e centrífuga em 400 x g por 15 min à temperatura ambiente (TR).
- Remova a camada superior de impurezas antes de drenar as células na interface para evitar possíveis contaminações. Drenar cuidadosamente a camada de células mononucleares (MNCs) na interface de meio de gradiente de densidade de 40%/80% para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de PBS gelado usando uma pipeta. Lave as células com PBS gelado duas vezes.
3. Coloração superficial para análise de FCM
- Colher as células e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender o pellet celular em tampão corante (PBS suplementado com 2% FBS e 0,1% NaN3) e centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
CUIDADO: Seja cauteloso ao preparar o tampão de coloração. O NaN3 é muito tóxico e pode causar danos aos órgãos se ingerido, inalado ou em contato com a pele. Além disso, evite a liberação para o meio ambiente. - Ressuspender as células em solução de bloqueio de 80 μL (anticorpo anti-CD16/32 (1:100) diluído em tampão de coloração) por tubo. Incubar durante 30 minutos no escuro a 4 °C.
- Sem lavar, adicionar 20 μL da diluição apropriada do coquetel de anticorpos corantes de superfície (Tabela 1).
- Adicionar 1 μL (por teste) do corante de viabilidade fixável 520 (FVD) imediatamente antes de adicionar o cocktail de anticorpos às amostras. Incubar no escuro a 4 °C durante 30 minutos. Defina anticorpos isotípicos correspondentes e fluorescência menos um (FMO) como controles negativos.
- Lavar as células em 500 μL de tampão de coloração centrifugando a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Ressuspender o pellet de células em 200 μL de tampão corante. Adicionar 50 μL de esferas de contagem absoluta de vórtices às células coradas e agitar. Submetê-los a uma análise de citometria de fluxo (FCM).
NOTA: Os dados de FCM foram obtidos usando um analisador de células espectrais e analisados com um software de análise de citometria de fluxo (FCM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um modelo murino induzido por VA foi desenvolvido para explorar o papel da ILC2s na RA. A construção do modelo murino de RA foi baseada em estudos prévios com pequenas modificações 28,29,30,31. Um vídeo de 10 min foi capturado para medir a frequência de espirros e coçar o nariz após o último teste de provocação nasal. Os sintomas alérgicos dos camundongos OVA-induzidos-AR foram apresentados na Figura 1. A frequência de fricção nasal e espirros nos camundongos RA foi significativamente maior do que no grupo controle.
A seguir, descrevemos um procedimento para isolar as CMN da mucosa nasal murina e realizar sua caracterização por meio da análise da CFM. Cerca de 2-3 x 106 linfócitos foram obtidos de cada nariz murino. As células mortas foram excluídas pela coloração de FVD. A estratégia de gating para ILC2s entre as células isoladas foi Lin (CD11b, CD11c, CD3 e B220)− CD45+ CD90.2+ KLRG1+. Todas as comportas foram desenhadas com base no isotipo ou controle FMO. Tipicamente, ~2%-3% das células Lin− CD45+ foram identificadas na mucosa nasal de camundongos controles saudáveis (Figura 2). O número absoluto de ILC2s na mucosa nasal murina varia de 2.000-4.000.
Em seguida, isolamos as ILC2s dos camundongos AR usando o método descrito acima. Não houve diferença no número absoluto de linfócitos entre camundongos HC e AR. Os resultados da FCM indicaram que a fração de ILC2s nos camundongos RA foi de 9%-14% do número total de linfócitos Lin− CD45+ , indicando um aumento notável no número de ILC2s na mucosa nasal do RA em comparação com o de camundongos controles saudáveis (Figura 3).
Detectamos a expressão de CD226 nas ILC2s. Em média, 51,9% das ILC2s expressaram CD226 em condições não imunizadas, enquanto a proporção média de ILC2s expressando CD226 foi de 54,8% nos camundongos AR, que mostraram uma tendência não significativa de aumento em comparação com os camundongos controle. Além da frequência celular, o nível de expressão de CD226 na superfície celular também foi determinado usando a intensidade média de fluorescência (MFI) que foi auto-calculada pelo software de análise FCM. Curiosamente, o MFI de CD226 foi significativamente upregulated nos camundongos RA em comparação com os camundongos controle (Figura 4), indicando uma expressão elevada de CD226 nas ILC2s da mucosa nasal alérgica.
Figura 1: Modelo de RA murina induzida por OVA . (A) O diagrama esquemático do estabelecimento do modelo de RA murino. A frequência de fricção nasal (B) e espirros (C) em um período de 10 min. Os valores são apresentados como média ± desvio padrão (DP) (n = 3). Para a comparação entre os dois grupos, foi realizado o teste t de Student; P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de fechamento do FCM para ILC2s. As multinacionais foram isoladas conforme descrito acima. (A) O gráfico de densidade demonstra a distribuição das multinacionais isoladas ao longo dos eixos FSC e SSC. (B) Os singlets foram fechados com base nas características do FSC. (C) Células Lin− foram definidas como expressão negativa de CD11b, CD11c, CD3 e B220 para excluir células mieloides, células B e células T em MNCs. As células mortas foram excluídas por meio da coloração de corante de viabilidade fixável (FVD). (D) As ILCs são caracterizadas por Lin− CD45+. (E) ILC2s são fechadas por CD90.2+ KLRG1+ entre ILCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ILC2s na mucosa nasal de camundongos sadios e RA. (A) Imagens representativas da MCF ilustram as proporções de ILC2s entre ILCs da mucosa da cavidade nasal dos grupos controle (HC) e RA saudáveis. (B) As proporções de ILC2s em células Lin− CD45+ nos grupos HC e AR. Os valores são apresentados como média ± DP (n = 3). O teste t de Student foi realizado para comparação entre dois grupos. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão de CD226 na ILC2s da mucosa nasal. ILC2s foram caracterizadas utilizando-se a estratégia supracitada. A expressão de CD226 em ILC2s foi avaliada por FCM. (A) Histogramas representativos da expressão de CD226 nos grupos HC e AR; área azul representa o controle FMO CD226. (B,C) As proporções de ILC2s CD226-positve e intensidade média de fluorescência (MFI) de CD226 no grupo HC e grupo AR. Os valores são expressos como média ± DP (n = 3). O teste t de Student foi realizado para comparação entre os dois grupos. P < 0,05 foi considerado significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Anticorpo | Fluorochrome | Clone | Diluição |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Cianina7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Flúor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R (B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90,2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabela 1: Coquetel de anticorpos para coloração de superfície.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As ILC2 estão intimamente associadas à inflamação tipo 2 e a distúrbios inflamatórios, como demonstrado por um número crescente de estudos. Tanto os modelos em camundongos quanto a observação humana contribuem para uma melhor compreensão de sua função nas vias aéreas superiores. Na fisiopatologia da asma, as ILC2 são ativadas através da linfopoietina estromal tímica, IL-25 e IL-33, que são produzidas principalmente por células epiteliais. Em seguida, espelhando as células Th2, as ILC2 produzem IL-4, IL-5 e IL-13 para agravar a inflamação do tipo 232. Além disso, diferentes subgrupos de ILC2 também produzem IL-10 e IL-1733,34,35. A RA também é um tipo de inflamação alérgica das vias aéreas impulsionada pelas células do tipo 2. A participação das ILC2s na fisiopatologia da RA tem sido demonstradarecentemente14. No entanto, os potenciais mecanismos regulatórios de ILC2s sob RA permanecem em grande parte desconhecidos.
Evidências indicam que a interação entre diferentes ILC2s pode depender das moléculas de superfície36. Por exemplo, tanto os ICOS quanto os ICOS-ligantes expressos em ILC2s são necessários para sua sobrevivência e funções37. Além disso, ILC2s também expressam ICAM-1 e LFA-1, que exercem efeitos importantes sobre a migração celular e interação célula-célula 7,38. Além disso, ILC2s podem cruzar com outras células imunes através dessas moléculas de superfície celular. Por exemplo, o OX40L é um mediador dominante para a interação entre células T CD4+ e ILC2s na inflamação pulmonar39. Como CD226, como uma molécula costimulatória transmembrana, expressa em várias células imunes, também avaliamos sua expressão em ILC2s em tecidos nasais de camundongos saudáveis e AR neste estudo.
A modelagem geral da RA induzida por VO inclui sensibilização sistêmica intraperitoneal e estimulação local intranasal, que geralmente requerem pelo menos 3-4 semanas para alcançar resultados satisfatórios de modelagem31. Outro modelo de RA de parto nasal induzido por VA leva um tempo semelhante ao método do modelo geral para atingir um nível aproximado de inflamação do tipo 2 e sintomas de RA40. No entanto, o número e a função das ILC2s nasais por esses dois métodos de modelagem do RA ainda precisam de mais pesquisas. Foram avaliados espirros e fricção nasal para avaliar os sintomas de RA. Embora fosse mais convincente incluir a avaliação para rinorreia, achamos difícil avistar a rinorreia sem interferir no comportamento dos camundongos durante a avaliação, por isso lamentavelmente excluímos esses critérios. Além disso, a avaliação para espirros e fricção nasal pode ser profunda o suficiente para ilustrar a gravidade dos sintomas de RA murina para muitos dos artigos relevantes que empregaram apenas esses doiscritérios41,42,43.
Estudos prévios com ILC2s nasais de camundongos descreveram o isolamento da mucosa nasal murina44,45. Seu protocolo é o seguinte: Resumidamente, remover o tecido mole ao redor do crânio, abrir o osso nasal para expor a cavidade nasal e raspar o tecido da mucosa nasal da superfície do crânio com pinças. Enquanto a maior parte da mucosa isolada foi usada para FI, IHQ ou qPCR, pouco é relatado sobre o seguinte isolamento de células mononucleares (MNCs) e análise de FCM. Neste estudo, considerando as baixas quantidades de ILC2s localizadas na mucosa nasal, a operação reteve o volume máximo da mucosa nasal digerindo todo o nariz ao invés de retirar a mucosa da superfície do osso nasal. Para otimizar o protocolo de digestão, avaliamos três meios de digestão: 0,5 mg/mL de colagenase IV, 1 mg/mL de colagenase IV e 1 mg/mL de colagenase IV e 10 U/mL de DNase I, e comparamos a porcentagem de células vivas e a frequência de linfócitos obtidas por esses três meios de digestão. A proporção de células vivas adquiridas pelos três meios não tem diferença (90%-95%); no entanto, os dois primeiros tipos de digestão foram inadequados, com menor frequência de linfócitos (~5%). Assim, 1 mg/mL de colagenase IV e 10 U/mL de DNase I foram escolhidos como meio de digestão neste estudo. Entretanto, outras enzimas, como liberase e dispase, que podem substituir a colagenase, não foram estudadas. Uma vez que o tipo e a concentração de enzimas são críticos para a viabilidade celular e expressão de moléculas na superfície celular46,47, o uso e a dosagem dessas alternativas durante a digestão nasal ainda necessitam de exploração e otimização cuidadosas. Usamos FVD eFluor 520 para verificar a viabilidade celular, porque ele pode ser detectado usando um filtro passa-banda 530/30 que é equivalente ao FITC, para que pudéssemos excluir as células mortas durante o confinamento de células Lin-. Outros corantes de viabilidade celular também são opcionais de acordo com painéis de anticorpos específicos. Além disso, em vez da coloração intracelular dos fatores de transcrição GATA3, que geralmente é realizada em outros estudos relacionados à ILC2, as ILC2s do presente estudo foram caracterizadas com base em marcadores de superfície celular como Lin (CD11b, CD11c, CD3 e B220), CD45, CD90.2 e KLRG1 na análise da FCM. Dentre elas, a KLRG1 expressa na ILC2s tem sido identificada como marcador específico de ILC2s teciduais maduras48,49. Embora o CD90.2 seja menos específico, ele ainda é aceito como um marcador de superfície associado à ILC250. Neste estudo, os camundongos não foram distinguidos por sexo. Pesquisas têm mostrado que a abundância e os antígenos de superfície celular das ILCs pulmonares em camundongos são diferentes em relação ao sexo, mas a correlação das ILC2s nasais com o gênero ainda precisa ser estudada50. Além disso, o protocolo não enfocou a proporção de outras células hematopoiéticas. Diferentes painéis de anticorpos FCM ajudariam a resolver esse problema.
Este protocolo descreveu um método para isolar ILC2s da mucosa nasal murina. As ILC2s isoladas podem ser coradas para caracterização de FCM, classificadas para cultura celular ou estimuladas in vitro para análises posteriores. Consistente com os achados de estudos prévios10,45,51, um acúmulo substancial de ILC2s foi observado na mucosa nasal de camundongos RA. Notavelmente, CD226 foi expresso em ILC2s locais, e seu nível aumentou significativamente ainda mais em condições alérgicas. Portanto, os achados deste estudo sugerem o envolvimento do CD226 na RA dependente de ILC2. Se ILC2s em pacientes com RA expressam CD226 e se a expressão de CD226 em ILC2s aumenta em condições alérgicas deve ser investigado em estudos futuros.
Em conclusão, estabelecemos um protocolo para isolar e identificar ILC2s da mucosa nasal e detectamos a expressão de moléculas de adesão dentro delas. O protocolo requer maior otimização; Entretanto, a escassez de estudos que descrevam sistemática e minuciosamente o procedimento de isolamento e caracterização de linfócitos, particularmente as células linfoides inatas da mucosa nasal, torna este protocolo uma referência preliminar para os pesquisadores que exploram o ambiente imunológico nasal local.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
R.Z. foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81871258) e fundos fornecidos pela Quarta Universidade Médica Militar (No.2020rcfczr). Y.Z. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Básica em Ciências Naturais de Shaanxi (No. 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
