Summary
Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2), implicate nell'infiammazione di tipo 2, partecipano principalmente alla risposta all'infezione da elminti, alle malattie allergiche, all'omeostasi metabolica e alla riparazione dei tessuti. In questo studio, viene dimostrata una procedura per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina e rilevare l'espressione di CD226.
Abstract
Con abbondanti ricerche sulle cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) pubblicate nel corso degli anni, le ILC2 sono ampiamente note per essere implicate nella regolazione di vari processi patologici, tra cui l'immunità anti-elminti, la riparazione dei tessuti, la termogenesi e le malattie autoimmuni come l'asma e la rinite allergica (AR). Le ILC2 risiedono permanentemente nei tessuti periferici come la pelle, l'intestino, i polmoni e la cavità nasale; Tuttavia, ci sono informazioni limitate sulle loro esatte funzioni nell'immunità della mucosa nasale. CD226 è una molecola costimolatoria attivante, espressa principalmente su cellule natural killer (NK), cellule T e monociti infiammatori. Tuttavia, se le ILC2 esprimono CD226 o svolgono un ruolo nella patogenesi delle malattie correlate alle ILC2 rimane sconosciuto. Qui, abbiamo stabilito un metodo per isolare e identificare ILC2 dalla mucosa nasale e rilevato l'espressione di CD226 su ILC2 ottenute da topi sani e AR. Qui, descriviamo questo protocollo per l'isolamento e l'identificazione di ILC2 dalla mucosa nasale del topo, che aiuterà a esplorare il meccanismo patologico interno dei disturbi immunologici nelle malattie della mucosa nasale.
Introduction
Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2) sono state scoperte per la prima volta nei tessuti della cavità peritoneale dei topi e successivamente hanno dimostrato di essere presenti nel sangue e in altri tessuti periferici come polmoni, pelle e cavità nasale 1,2,3. Come cellule residenti nei tessuti, le ILC2 sono principalmente mantenute e proliferate localmente e funzionano come le prime guardie che rispondono agli stimoli dannosi esogeni producendo numerose citochine di tipo 2 e inducendo l'immunità di tipo 2 4,5,6. Le ILC2 possono anche esercitare i loro effetti attraverso il traffico verso i tessuti infetti 7,8.
Analogamente alle cellule T-helper 2 (Th2), le complicate reti regolatorie delle ILC2 assicurano il loro coinvolgimento significativo nella progressione di varie malattie infiammatorie di tipo 2, comprese le malattie allergiche delle vie aeree 8,9. Nell'asma, le allarmine derivate dalle cellule epiteliali possono attivare ILC2, che promuovono ulteriormente l'infiammazione polmonare attraverso la secrezione di interleuchina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Studi clinici hanno anche indicato che i livelli di ILC2 erano significativamente elevati nell'espettorato e nel sangue dei pazienti con asma grave, suggerendo un'associazione di ILC2 con la gravità dell'asma e la loro funzione come predittore della progressione dell'asma11.
La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica comune che colpisce milioni di persone ogni anno e i trattamenti efficaci per questa malattia sono limitati12,13. Le ILC2 svolgono un ruolo cruciale nella fisiopatologia dell'AR, sia nella fase di sensibilizzazione che nella generazione di sintomi e nella fase14 dell'infiammazione. Nei pazienti con AR, i livelli di ILC2 nel sangue periferico sono stati segnalati per essere elevati sia localmente che sistemicamente15. Tuttavia, alcuni effetti e i meccanismi alla base delle ILC2 sulla fisiopatologia e sulla progressione dell'AR richiedono ancora ulteriori esplorazioni.
CD226 - una glicoproteina transmembrana che funge da molecola costimolatoria - è espressa principalmente su cellule natural killer (NK), cellule T e altri monociti infiammatori16,17. L'interazione di CD226 e dei suoi ligandi (CD155 e/o CD112) o concorrente (TIGIT) gli consente di partecipare alle funzioni biologiche di varie cellule immunitarie18. Il legame dei ligandi sulle cellule presentanti l'antigene a CD226 sui linfociti citotossici (CTL) promuove l'attivazione di entrambe le cellule contemporaneamente, mentre l'attivazione della CTL può essere ulteriormente soppressa da TIGIT (immunorecettore delle cellule T con domini Ig e ITIM), il concorrente di CD22619,20. Uno studio umano ex vivo ha rivelato che CD226 e CD155 sulle cellule T regolano l'equilibrio tra Th1 / Th17 e Th2 attraverso la modulazione differenziale dei sottoinsiemi Th21. CD226 può anche mediare l'adesione piastrinica e l'attività di uccisione del tumore NK22,23. Nel frattempo, CD226 è ben studiato nella patogenesi di varie malattie infettive, malattie autoimmuni e tumori 18,24,25. Allo stato attuale, CD226 è diventato un nuovo punto luminoso per l'immunoterapia. Gli studi hanno scoperto che le vescicole extracellulari possono invertire l'espressione di CD226 sulle cellule NK per ripristinare la loro attività citotossica e intervenire nella progressione del cancro del polmone26. Uno studio recente ha rivelato un sottogruppo di ILC intestinali fetali di gruppo 3 caratterizzati da un'elevata espressione di CD226 mediante sequenziamento dell'RNA a singola cellula27, che ha indicato che CD226 potrebbe esercitare ruoli nell'immunità innata linfoide-mediata dalle cellule.
La nostra conoscenza delle ILC2 nell'infiammazione delle vie aeree si basa principalmente su studi sull'asma; Tuttavia, si sa poco sulle loro funzioni nell'immunità della mucosa nasale. Pertanto, è stato stabilito un protocollo per isolare e identificare le ILC2 dalla mucosa nasale. Lo studio si concentra sull'espressione di CD226 sulle ILC2 nei tessuti nasali e sulla sua variazione tra topi sani e AR. Ciò può fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base della regolazione mediata da ILC2 nell'immunità locale e servire come base per lo sviluppo di nuovi approcci per il trattamento dell'AR.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure e i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Ricerca Scientifica della Quarta Università Medica Militare (n. 20211008).
1. Creazione di modelli AR murini
- Ospitare topi selvatici maschi e femmine (WT) C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane in specifiche condizioni prive di agenti patogeni e fornire chow e acqua standard di laboratorio.
- Emulsionare 50 μg di ovoalbumina (OVA) in 0,2 mL di PBS sterile contenente 2 mg di idrossido di alluminio su un banco pulito per mantenere la sterilità. Nei giorni 0, 7 e 14, iniettare per via intraperitoneale topi femmina o maschio con 50 μg ciascuno di OAV emulsionati.
- Nei giorni 21, 22, 23, 24 e 25, i topi instillati per via intranasale con 50 μg di OAV disciolti in 30 μL di PBS sterile (15 μL per narice) in anestesia per inalazione (isoflurano al 2-3% con una portata di ossigeno o 0,5 L / min).
- Eutanasia dei topi 24 ore dopo l'ultima sfida (giorno 26).
2. Isolamento delle cellule mononucleate (MNC) dalla mucosa nasale
- Eutanasia dei topi per lussazione cervicale in anestesia profonda. Immergere i topi a testa in su in etanolo al 75% per 5 minuti ed evitare che l'etanolo entri nella narice esterna. Posizionare l'addome verso il basso sul tavolo operatorio.
- Taglia i denti anteriori. Sulla linea mediana della testa, fai un'incisione e apri la pelle usando le forbici.
- Rimuovere la mascella inferiore, tagliare l'intero naso lungo la fine del palato e posizionare il tessuto in una capsula di Petri da 60 mm contenente 5 ml di PBS ghiacciato. Usando forbici e pinze, rimuovere la carne e i muscoli che aderiscono alle ossa.
- Trasferire il naso del topo in una nuova capsula di Petri da 60 mm contenente 5 ml di PBS ghiacciato. Lavare le ossa due volte con 5 ml di PBS ghiacciato.
- Trasferire il naso in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Rompere e trasferire sufficientemente il naso in una provetta da 15 mL contenente 2 mL di tampone digest preriscaldato (RPMI 1640 medium integrato con 1 mg/mL di collagenasi IV e 10 U/mL DNasi I).
- Fissare il coperchio e posizionare il tubo verticalmente in uno shaker orbitale a 37 °C, con agitazione continua a 120-150 giri/min per 40 minuti.
NOTA: Preriscaldare il tampone digestivo a 37 °C per ottenere la massima attività enzimatica. - Aggiungere 5 ml di terreno RPMI 1640 ghiacciato contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) per interrompere il processo di digestione.
- Filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere i frammenti solidi.
- Centrifugare a 500 x g per 5 minuti, quindi eliminare delicatamente il surnatante.
- Risospendere il pellet in RPMI 1640 a freddo ghiacciato e centrifugare a 500 x g per 5 minuti. Scartare delicatamente il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di fluido gradiente al 40% (160 μL di 10x PBS + 1,44 mL di soluzione madre di fluido a gradiente di densità + 2,4 mL di mezzo RPMI 1640).
- Inserire delicatamente una pipetta Pasteur sul fondo del tubo e aggiungere lentamente 2,5 ml di fluido con gradiente all'80% (200 μL di 10x PBS + 1,8 mL di soluzione madre di fluido con gradiente di densità + 0,5 mL di fluido RPMI 1640).
- Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga più bassa rispetto alla terza marcia e centrifugare a 400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere lo strato superiore di impurità prima di drenare le celle all'interfaccia per evitare potenziali contaminazioni. Drenare accuratamente lo strato di celle mononucleate (MNC) all'interfaccia del fluido con gradiente di densità del 40%/80% in un tubo da 15 mL contenente 2 mL di PBS ghiacciato utilizzando una pipetta. Lavare le cellule con PBS ghiacciato due volte.
3. Colorazione superficiale per l'analisi FCM
- Raccogliere le cellule e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in tampone colorante (PBS integrato con 2% FBS e 0,1% NaN3) e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si prepara il tampone anti-colorazione. NaN3 è molto tossico e può causare danni agli organi se ingerito, inalato o a contatto con la pelle. Inoltre, evitare il rilascio nell'ambiente. - Risospendere le cellule in una soluzione bloccante da 80 μL (anticorpo anti-CD16/32 (1:100) diluito in tampone colorante) per provetta. Incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
- Senza lavare, aggiungere 20 μL della diluizione appropriata del cocktail di anticorpi che colora la superficie (Tabella 1).
- Aggiungere 1 μL (per test) di colorante vitalità fissabile 520 (FVD) appena prima di aggiungere il cocktail di anticorpi ai campioni. Incubare al buio a 4 °C per 30 min. Impostare gli anticorpi isotipo corrispondenti e la fluorescenza meno uno (FMO) come controlli negativi.
- Lavare le celle in 500 μL di tampone colorante centrifugando a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone colorante. Aggiungere 50 μL di perline di conteggio assoluto a vortice alle cellule colorate e agitare. Sottoporli a un'analisi di citometria a flusso (FCM).
NOTA: I dati FCM sono stati ottenuti utilizzando un analizzatore di cellule spettrali e analizzati con il software di analisi della citometria a flusso (FCM).
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Representative Results
È stato sviluppato un modello murino indotto da OAV per esplorare il ruolo delle ILC2 nell'AR. La costruzione del modello murino AR si è basata su studi precedenti con lievi modifiche 28,29,30,31. È stato catturato un video di 10 minuti per misurare la frequenza degli starnuti e dei graffi nasali dopo l'ultima sfida nasale. I sintomi allergici dei topi AR indotti da OAV sono stati presentati nella Figura 1. La frequenza di sfregamento nasale e starnuti nei topi AR era significativamente più alta rispetto al gruppo di controllo.
Successivamente, abbiamo descritto una procedura per isolare le multinazionali dalla mucosa nasale murina ed eseguire la loro caratterizzazione utilizzando l'analisi FCM. Circa 2-3 x 106 linfociti sono stati ottenuti da ciascun naso murino. Le cellule morte sono state escluse dalla colorazione FVD. La strategia di gating per le ILC2 tra le cellule isolate era Lin (CD11b, CD11c, CD3 e B220)− CD45+ CD90.2+ KLRG1+. Tutte le porte sono state disegnate in base al controllo isotipo o FMO. Tipicamente, ~2%-3% delle cellule Lin-CD45+ sono state identificate nella mucosa nasale di topi di controllo sani (Figura 2). Il numero assoluto di ILC2 nella mucosa nasale murina varia da 2.000-4.000.
Abbiamo quindi isolato gli ILC2 dai topi AR usando il metodo sopra descritto. Non c'era differenza nel numero assoluto di linfociti tra topi HC e AR. I risultati FCM hanno indicato che la frazione di ILC2 nei topi AR era del 9% -14% del numero totale di linfociti Lin-CD45+, indicando un notevole aumento del numero di ILC2 nella mucosa nasale AR rispetto a quella nei topi di controllo sani (Figura 3).
Abbiamo rilevato l'espressione di CD226 sulle ILC2. In media, il 51,9% delle ILC2 ha espresso CD226 in condizioni non immunizzate, mentre il rapporto medio di ILC2 che esprimono CD226 è stato del 54,8% nei topi AR, che ha mostrato una tendenza non significativa ad aumentare rispetto a quella nei topi di controllo. Oltre alla frequenza cellulare, anche il livello di espressione della superficie cellulare di CD226 è stato determinato utilizzando l'intensità media di fluorescenza (MFI) calcolata automaticamente dal software di analisi FCM. È interessante notare che l'MFI di CD226 era significativamente sovraregolato nei topi AR rispetto ai topi di controllo (Figura 4), indicando un'elevata espressione di CD226 sulle ILC2 della mucosa nasale allergica.
Figura 1: Modello AR murino indotto da OVA . (A) Il diagramma schematico dell'istituzione del modello AR murino. La frequenza dello sfregamento nasale (B) e degli starnuti (C) in un periodo di 10 minuti. I valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD) (n = 3). Per confrontare i due gruppi, è stato eseguito il t-test di Student; P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating FCM per ILC2. Le multinazionali sono state isolate come descritto sopra. (A) Il grafico della densità mostra la distribuzione delle multinazionali isolate lungo gli assi FSC e SSC. (B) Le canottiere sono state recintate in base alle caratteristiche FSC. (C) Le cellule Lin− sono state definite come espressione negativa di CD11b, CD11c, CD3 e B220 per escludere le cellule mieloidi, le cellule B e le cellule T nelle multinazionali. Le cellule morte sono state escluse mediante colorazione con colorante di vitalità fissabile (FVD). (D) LE ILC sono caratterizzate da Lin− CD45+. (E) Le ILC2 sono iscritte da CD90.2+ KLRG1+ tra le ILC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: ILC2 nella mucosa nasale di topi sani e AR. (A) Le immagini rappresentative di FCM illustrano le proporzioni di ILC2 tra le ILC della mucosa della cavità nasale dei gruppi di controllo sano (HC) e AR. (B) Le proporzioni di ILC2 nelle cellule Lin-CD45+ nei gruppi HC e AR. I valori sono presentati come media ± SD (n = 3). Il t-test dello studente è stato eseguito per un confronto a due gruppi. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Espressione di CD226 nelle ILC2 della mucosa nasale. Le ILC2 sono state caratterizzate utilizzando la strategia sopra menzionata. L'espressione di CD226 sulle ILC2 è stata valutata utilizzando FCM. (A) istogrammi rappresentativi dell'espressione di CD226 nei gruppi HC e AR; l'area blu rappresenta il controllo FMO CD226. (B,C) Le proporzioni di ILC2 CD226-positive e l'intensità media di fluorescenza (MFI) di CD226 nel gruppo HC e nel gruppo AR. I valori sono espressi come media ± SD (n = 3). Il t-test dello studente è stato eseguito per il confronto tra i due gruppi. P < 0,05 è stato considerato significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Anticorpo | Fluorocromo | Clone | Diluizione |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Cianina7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabella 1: Cocktail di anticorpi per la colorazione superficiale.
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Discussion
Le ILC2 sono strettamente associate all'infiammazione di tipo 2 e ai disturbi infiammatori, come dimostrato da un numero crescente di studi. Sia i modelli murini che l'osservazione umana contribuiscono a una migliore comprensione della sua funzione nelle vie aeree superiori. Nella fisiopatologia asmatica, le ILC2 sono attivate attraverso la linfopoietina stromale timica, IL-25 e IL-33, che sono per lo più prodotte dalle cellule epiteliali. Quindi, rispecchiando le cellule Th2, le ILC2 producono IL-4, IL-5 e IL-13 per aggravare l'infiammazione di tipo 232. Inoltre, diversi sottoinsiemi di ILC2 producono anche IL-10 e IL-1733,34,35. L'AR è anche un tipo di infiammazione allergica delle vie aeree guidata dalle cellule di tipo 2. La partecipazione delle ILC2 alla fisiopatologia AR è stata recentemente dimostrata14. Tuttavia, i potenziali meccanismi di regolazione delle ILC2 nell'ambito dell'AR rimangono in gran parte sconosciuti.
L'evidenza indica che l'interazione tra diverse ILC2 può basarsi sulle molecole di superficie36. Ad esempio, sia ICOS che ICOS-ligands espressi sulle ILC2 sono necessari per la loro sopravvivenza e le loro funzioni37. Inoltre, le ILC2 esprimono anche ICAM-1 e LFA-1, che esercitano importanti effetti sulla migrazione cellulare e sull'interazione cellula-cellula 7,38. Inoltre, le ILC2 possono dialogare con altre cellule immunitarie attraverso queste molecole della superficie cellulare. Ad esempio, OX40L è un mediatore dominante per l'interazione tra cellule T CD4 + e ILC2 nell'infiammazione polmonare39. Poiché CD226, come molecola costimolatoria transmembrana, si esprime su varie cellule immunitarie, abbiamo anche valutato la sua espressione su ILC2 nei tessuti nasali di topi sani e AR in questo studio.
La modellazione AR indotta da OAV generale include la sensibilizzazione sistemica intraperitoneale e la stimolazione locale intranasale, che di solito richiedono almeno 3-4 settimane per ottenere risultati di modellazione soddisfacenti31. Un altro modello AR di somministrazione nasale indotto da OAV richiede un tempo simile al metodo del modello generale per raggiungere un livello approssimativo di infiammazione di tipo 2 e sintomi AR40. Tuttavia, il numero e la funzione delle ILC2 nasali con questi due metodi di modellazione AR necessitano ancora di ulteriori ricerche. Abbiamo valutato starnuti e sfregamenti nasali per valutare i sintomi AR. Sebbene sarebbe più convincente includere la valutazione per la rinorrea, abbiamo scoperto che è difficile vedere la rinorrea senza interferire con il comportamento dei topi durante la valutazione, quindi abbiamo purtroppo escluso questi criteri. Inoltre, la valutazione per starnuti e sfregamenti nasali potrebbe essere abbastanza profonda da illustrare la gravità dei sintomi murini di AR per molti degli articoli pertinenti che impiegavano solo questi due criteri41,42,43.
Precedenti studi su ILC2 nasali di topi hanno descritto l'isolamento della mucosa nasale murina44,45. Il loro protocollo è il seguente: brevemente, rimuovere il tessuto molle intorno al cranio, aprire l'osso nasale per esporre la cavità nasale e raschiare il tessuto della mucosa nasale dalla superficie del cranio con una pinza. Mentre la maggior parte della mucosa isolata è stata utilizzata per IF, IHC o qPCR, poco è riportato sul seguente isolamento delle cellule mononucleate (MNC) e sull'analisi FCM. In questo studio, considerando le basse quantità di ILC2 localizzate nella mucosa nasale, l'operazione ha mantenuto il volume massimo della mucosa nasale digerendo l'intero naso invece di rimuovere la mucosa dalla superficie dell'osso nasale. Per ottimizzare il protocollo di digestione, abbiamo valutato tre mezzi digestivi: 0,5 mg / ml di collagenasi IV, 1 mg / ml di collagenasi IV e 1 mg / ml di collagenasi IV e 10 U / mL DNasi I, e confrontato la percentuale di cellule viventi e la frequenza dei linfociti ottenuta da questi tre mezzi digestivi. La proporzione di cellule viventi acquisite da tutti e tre i mezzi non ha differenza (90%-95%); Tuttavia, i primi due tipi di digestione erano inadeguati con una frequenza linfocitaria inferiore (~ 5%). Pertanto, 1 mg / ml di collagenasi IV e 10 U / ml di DNasi I sono stati scelti come mezzi digestivi in questo studio. Tuttavia, altri enzimi come liberase e dispase che possono sostituire la collagenasi non sono stati studiati. Poiché il tipo e la concentrazione degli enzimi sono fondamentali per la vitalità cellulare e l'espressione della molecola della superficie cellulare46,47, l'uso e il dosaggio di queste alternative durante la digestione del naso richiedono ancora un'attenta esplorazione e ottimizzazione. Abbiamo usato FVD eFluor 520 per verificare la vitalità delle cellule, perché può essere rilevato utilizzando un filtro passa banda 530/30 che è equivalente a FITC, quindi potremmo escludere le cellule morte durante il gating delle celle Lin. Anche altri coloranti di vitalità cellulare sono opzionali in base a specifici pannelli anticorpali. Inoltre, invece della colorazione intracellulare dei fattori di trascrizione GATA3, che di solito viene eseguita in altri studi correlati a ILC2, le ILC2 nel presente studio sono state caratterizzate sulla base di marcatori di superficie cellulare come Lin (CD11b, CD11c, CD3 e B220), CD45, CD90.2 e KLRG1 nell'analisi FCM. Tra questi, KLRG1 espresso su ILC2s è stato identificato come marker specifico di ILC2s del tessuto maturo48,49. Sebbene CD90.2 sia meno specifico, è ancora accettato come marcatore di superficie associato a ILC250. In questo studio, i topi non erano distinti per sesso. La ricerca ha dimostrato che l'abbondanza e gli antigeni della superficie cellulare delle ILC polmonari nei topi sono diversi nel genere, ma la correlazione delle ILC2 nasali con il genere deve ancora essere studiata50. Inoltre, il protocollo non si è concentrato sulla proporzione di altre cellule ematopoietiche. Diversi pannelli di anticorpi FCM aiuterebbero a risolvere questo problema.
Questo protocollo descriveva un metodo per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina. Le ILC2 isolate possono essere colorate per la caratterizzazione FCM, selezionate per la coltura cellulare o stimolate in vitro per ulteriori analisi. Coerentemente con i risultati degli studi precedenti 10,45,51, è stato osservato un sostanziale accumulo di ILC2 nella mucosa nasale dei topi AR. In particolare, CD226 è stato espresso su ILC2 locali e il suo livello è aumentato significativamente ulteriormente in condizioni allergiche. Pertanto, i risultati di questo studio suggeriscono il coinvolgimento di CD226 nell'AR ILC2-dipendente. Se le ILC2 nei pazienti con AR esprimono CD226 e se l'espressione di CD226 sulle ILC2 aumenta nelle condizioni allergiche dovrebbe essere studiata in studi futuri.
In conclusione, abbiamo stabilito un protocollo per isolare e identificare le ILC2 dalla mucosa nasale e rilevato l'espressione di molecole di adesione al loro interno. Il protocollo richiede un'ulteriore ottimizzazione; Tuttavia, la mancanza di studi che descrivano sistematicamente e minuziosamente la procedura per isolare e caratterizzare i linfociti, in particolare le cellule linfoidi innate nella mucosa nasale, rende questo protocollo un riferimento preliminare per i ricercatori che esplorano l'ambiente immunologico nasale locale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
R.Z. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81871258) e dai fondi forniti dalla Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). Y.Z. è stato supportato dal Programma di ricerca di base di scienze naturali dello Shaanxi (n. 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
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