Summary
与 2 型炎症有关的第 2 组先天淋巴细胞 （ILC2） 主要参与对蠕虫感染、过敏性疾病、代谢稳态和组织修复的反应。在这项研究中，展示了从鼠鼻粘膜中分离ILC2s并检测CD226表达的程序。
Abstract
随着多年来发表的对2组先天淋巴细胞（ILC2s）的大量研究，ILC2s被广泛认为与调节各种病理过程有关，包括抗蠕虫免疫，组织修复，产热和自身免疫性疾病，如哮喘和过敏性鼻炎（AR）。ILC2 永久存在于皮肤、肠道、肺和鼻腔等外周组织中;然而，关于它们在鼻粘膜免疫中的确切功能的信息有限。CD226是一种活化共刺激分子，主要在自然杀伤（NK）细胞、T细胞和炎性单核细胞上表达。然而，ILC2是否表达CD226或在ILC2s相关疾病的发病机制中发挥作用仍然未知。在这里，我们建立了一种从鼻粘膜中分离和鉴定ILC2的方法，并在从健康和AR小鼠获得的ILC2上检测CD226表达。在本文中，我们描述了该协议用于从小鼠鼻粘膜中分离和鉴定ILC2s，这将有助于探索鼻粘膜疾病中免疫疾病的内部病理机制。
Introduction
第2组先天淋巴细胞（ILC2s）首先在小鼠的腹膜腔组织中发现，随后被证明存在于血液和其他外周组织（如肺，皮肤和鼻腔1，2，3）中。作为组织驻留细胞，ILC2 主要在局部维持和增殖，并通过产生大量 2 型细胞因子和诱导 2 型免疫作为对外源性有害刺激做出反应的第一保护4，5，6。ILC2还可以通过向感染组织贩运7，8来发挥其作用。
与辅助性T细胞2（Th2）类似，ILC2的复杂调控网络确保它们显着参与各种2型炎症性疾病的进展，包括气道过敏性疾病8，9。在哮喘中，上皮细胞来源的警报蛋白可以激活ILC2，ILC2s通过分泌白细胞介素（IL）-4，IL-5和IL-1310进一步促进肺部炎症。临床研究还表明，重度哮喘患者的痰液和血液中ILC2水平显着升高，表明ILC2与哮喘严重程度及其作为哮喘进展预测因子的功能有关11。
过敏性鼻炎（AR）是一种常见的慢性炎症性疾病，每年影响数百万人，这种疾病的有效治疗方法有限12，13。ILC2 在 AR 的病理生理学中起着至关重要的作用，无论是在致敏阶段还是在症状产生和炎症阶段14。据报道，在AR患者中，外周血中的ILC2水平在局部和全身均升高15。然而，ILC2s对AR病理生理学和进展的某些影响及其机制仍有待进一步探索。
CD226 - 一种用作共刺激分子的跨膜糖蛋白 - 主要在自然杀伤（NK）细胞，T细胞和其他炎性单核细胞上表达16，17。CD226与其配体（CD155和/或CD112）或竞争对手（TIGIT）的相互作用使其能够参与各种免疫细胞的生物学功能18。抗原呈递细胞上的配体与细胞毒性淋巴细胞（CTL）上的CD226的结合同时促进两个细胞的活化，而CTL的活化可以被CD22619，20的竞争对手TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）进一步抑制。一项人类 离体 研究表明，T细胞上的CD226和CD155通过差异调节Th亚群21来调节Th1 / Th17和Th2之间的平衡。CD226同样可以介导血小板粘附和NK肿瘤杀伤活性22，23。同时，CD226在各种传染病，自身免疫性疾病和肿瘤的发病机制中得到了很好的研究18，24，25。目前，CD226已成为免疫治疗的新亮点。研究发现，细胞外囊泡可以逆转NK细胞上的CD226表达，以恢复其细胞毒性活性并干预肺癌的进展26。最近的一项研究揭示了胎儿肠道3组ILC的亚簇，其特征是通过单细胞RNA测序27具有高CD226表达的，这表明CD226可能在先天淋巴细胞介导的免疫中发挥作用。
我们对气道炎症中ILC2的了解主要基于对哮喘的研究;然而，人们对它们在鼻粘膜免疫中的功能知之甚少。因此，建立了一个从鼻粘膜中分离和鉴定ILC2的方案。该研究的重点是CD226在鼻组织中ILC2s上的表达及其在健康小鼠和AR小鼠之间的变异。这可能为ILC2介导的局部免疫调节的潜在机制提供新的见解，并作为开发AR治疗新方法的基础。
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Protocol
所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。所有程序和协议均由第四军医大学科学研究伦理委员会（第20211008号）批准。
1. 鼠AR模型建立
- 在特定无病原体条件下饲养8-12周龄的雄性和雌性野生型（WT）C57BL / 6小鼠，并提供标准的实验室食物和水。
- 在干净的工作台上将 50 μg 卵清蛋白 （OVA） 乳化在含有 2 mg 氢氧化铝的 0.2 mL 无菌 PBS 中以保持无菌。在第0，7和14天，腹膜内注射雌性或雄性小鼠，每只50μg乳化OVA。
- 在第21，22，23，24和25天，鼻内向小鼠灌注50μgOVA溶解在30μL无菌PBS（每个鼻孔15μL）下吸入麻醉（2-3%异氟醚，氧流速或0.5L / min）。
- 最后一次挑战后24小时（第26天）对小鼠实施安乐死。
2. 从鼻粘膜中分离单核细胞 （MNC）
- 在深度麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。将小鼠头浸泡在75%乙醇中5分钟，避免乙醇进入外鼻孔。将腹部向下放在手术台上。
- 切掉前牙。在头部的中线，做一个切口，然后用剪刀切开皮肤。
- 移除下颌，沿着上颚末端切掉整个鼻子，然后将组织放入含有 60 mL 冰冷 PBS 的培养皿中。使用剪刀和镊子去除粘附在骨头上的肉和肌肉。
- 将小鼠鼻子转移到含有 5 mL 冰冷 PBS 的新 60 mm 培养皿中。用 5 mL 冰冷的 PBS 清洗骨头两次。
- 将鼻端转移到 1.5 mL 微量离心管中。
- 充分粉碎并将鼻子转移到含有 2 mL 预热消化缓冲液（补充有 1 mg/mL 胶原酶 IV 和 10 U/mL DNase I 的 RPMI 1640 培养基）的 15 mL 管中。
- 盖上盖子并将管垂直置于37°C的轨道振荡器中，以120-150rpm连续搅拌40分钟。
注意：将消化缓冲液预热至37°C，以获得最高的酶活性。 - 加入 5 mL 含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的冰冷 RPMI 1640 培养基以停止消化过程。
- 通过70μm细胞过滤器过滤以去除固体碎片。
- 以500× g 离心5分钟，然后轻轻弃去上清液。
- 将沉淀重悬于冰冷的RPMI 1640培养基中，并以500× g 离心5分钟。轻轻丢弃上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 4 mL 40% 密度梯度培养基（160 μL 10x PBS + 1.44 mL 密度梯度培养基储备溶液 + 2.4 mL RPMI 1640 培养基）中。
- 将巴斯德移液器轻轻插入试管底部，缓慢加入 2.5 mL 80% 密度梯度培养基（200 μL 10x PBS + 1.8 mL 密度梯度培养基储备溶液 + 0.5 mL RPMI 1640 培养基）。
- 将离心机的加速和减速速率设置为低于三档，并在室温（RT）下将离心机以400× g 离心15分钟。
- 在排出界面处的细胞之前，请去除顶层杂质，以避免潜在的污染。使用移液器小心地将 40%/80% 密度梯度培养基界面处的单核细胞 （MNC） 层排入含有 2 mL 冰冷 PBS 的 15 mL 管中。用冰冷的PBS清洗细胞两次。
3. 用于FCM分析的表面染色
- 收获细胞并在4°C下以500× g 离心5分钟。 将细胞沉淀重悬于染色缓冲液（补充有2%FBS和0.1%NaN3的PBS）中，并在4°C下以500× g 离心5分钟。 弃去上清液。
注意：制备染色缓冲液时要小心。NaN3 毒性很大，如果吞咽、吸入或与皮肤接触，可能会对器官造成损害。此外，避免释放到环境中。 - 将细胞重悬于每管 80 μL 封闭溶液（在染色缓冲液中稀释的抗 CD16/32 抗体 （1：100） ）中。在4°C的黑暗中孵育30分钟。
- 在不洗涤的情况下，加入20 μL适当稀释的表面染色抗体混合物（表1）。
- 在将抗体混合物添加到样品之前，加入 1 μL（每次测试）可固定活性染料 520 （FVD）。在4°C的黑暗中孵育30分钟。设置匹配的同种型抗体和荧光减一（FMO）作为阴性对照。
- 通过在4°C下以500× g 离心5分钟，在500μL染色缓冲液中洗涤细胞。
- 将细胞沉淀重悬于 200 μL 染色缓冲液中。向染色细胞中加入 50 μL 涡旋绝对计数珠并搅拌。对它们进行流式细胞术（FCM）分析。
注意：使用光谱细胞分析仪获得FCM数据，并使用流式细胞术（FCM）分析软件进行分析。
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Representative Results
开发OVA诱导的小鼠模型以探索ILC2在AR中的作用。AR小鼠模型的构建基于先前的研究，略有修改28，29，30，31。拍摄了一段 10 分钟的视频，以测量上次鼻腔挑战后打喷嚏和抓鼻的频率。OVA诱导的AR小鼠的过敏症状如图1所示。AR小鼠揉鼻和打喷嚏的频率明显高于对照组。
接下来，我们描述了一种从小鼠鼻粘膜中分离MNC并使用FCM分析进行表征的程序。从每个鼠鼻中获得约2-3×106个淋巴细胞。通过FVD染色排除死细胞。分离细胞中ILC2的门控策略为Lin（CD11b，CD11c，CD3和B220）−CD45 + CD90.2+ KLRG1+细胞。所有门均基于同种型或FMO控制绘制。通常，在健康对照小鼠的鼻粘膜中鉴定出~2%-3%的Lin− CD45 +细胞（图2）。小鼠鼻粘膜中ILC2的绝对数量从2，000-4，000不等。
然后，我们使用上述方法从AR小鼠中分离ILC2。HC和AR小鼠的淋巴细胞绝对数量没有差异。FCM结果表明，AR小鼠中ILC2的比例占Lin− CD45+ 淋巴细胞总数的9%-14%，表明与健康对照小鼠相比，AR鼻粘膜中ILC2的数量显着增加（图3）。
我们在ILC2上检测到CD226的表达。平均而言，在未免疫条件下，51.9%的ILC2s表达CD226，而AR小鼠中表达CD226的ILC2的平均比例为54.8%，与对照组小鼠相比，表现出不显着的增加趋势。除细胞频率外，CD226的细胞表面表达水平还使用FCM分析软件自动计算的平均荧光强度（MFI）测定。有趣的是，与对照小鼠相比，AR小鼠CD226的MFI显着上调（图4），表明CD226在过敏性鼻粘膜ILC2s上的表达升高。
图1：OVA诱导的鼠AR模型。 （A）小鼠AR模型建立示意图。10分钟内鼻摩擦（B）和打喷嚏（C）的频率。值表示为平均值±标准差 （SD） （n = 3）。为了比较两组，进行了学生t检验;P < 0.05被认为具有统计学意义。请点击此处查看此图的大图。
图 2：ILC2 的 FCM 门控策略。如上所述，对跨国公司进行了隔离。（A）密度图显示了孤立的跨国公司沿FSC和SSC轴的分布。（B）根据FSC特性对单线管进行门控。（C）将Lin−细胞定义为CD11b，CD11c，CD3和B220阴性表达，以排除MNCs中的骨髓细胞，B细胞和T细胞。 通过可固定活性染料（FVD）染色排除死细胞。（D）ILC的特征是Lin− CD45+。（E）ILC2在ILC中由CD90.2+ KLRG1+门控。请点击此处查看此图的大图。
图3：健康和AR小鼠鼻粘膜中的ILC2 。 （A）代表性FCM图像说明了健康对照（HC）和AR组鼻腔粘膜ILCs中ILC2的比例。（B）HC和AR组中Lin− CD45 + 细胞中ILC2的比例。值表示为SD±平均值（n = 3）。学生的 t检验用于两组比较。 P < 0.05被认为具有统计学意义。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：CD226 在鼻粘膜 ILC2 中的表达。 利用上述策略对ILC2进行了表征。使用FCM评估CD226在ILC2上的表达。（A）HC和AR组中CD226表达的代表性直方图;蓝色区域代表 CD226 FMO 控件。（乙，丙）HC组和AR组CD226阳性ILC2的比例和CD226的平均荧光强度（MFI）。值表示为SD±平均值（n = 3）。进行学生 t检验以比较两组。 P < 0.05被认为是显著的。 请点击此处查看此图的大图。
| 抗体 | 荧光染料 | 克隆 | 稀释 |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/花青7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | 亚历克萨福陆 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R（B220） | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | 体育 | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | 装甲运兵车 | 2F1 | 1:160 |
表1：表面染色抗体混合物。
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Discussion
ILC2与2型炎症和炎症性疾病密切相关，越来越多的研究表明。小鼠模型和人类观察都有助于更好地了解其在上气道中的功能。在哮喘病理生理学中，ILC2 通过胸腺基质淋巴生成素、IL-25 和 IL-33 激活，这些药物主要由上皮细胞产生。然后镜像Th2细胞，ILC2产生IL-4，IL-5和IL-13以加重2型炎症32。此外，ILC2的不同亚群也产生IL-10和IL-1733，34，35。AR也是一种由2型细胞驱动的气道过敏性炎症。ILC2s在AR病理生理学中的参与最近已被证实14。然而，AR下ILC2的潜在调控机制在很大程度上仍然未知。
有证据表明，不同ILC2之间的相互作用可能依赖于表面分子36。例如，在ILC2上表达的ICOS和ICOS配体对于它们的生存和功能都是必要的37。此外，ILC2还表达ICAM-1和LFA-1，它们对细胞迁移和细胞间相互作用产生重要影响7，38。此外，ILC2可以通过这些细胞表面分子与其他免疫细胞串扰。例如，OX40L是肺部炎症中CD4 + T细胞与ILC2相互作用的主要介质39。由于CD226作为一种跨膜共刺激分子，在各种免疫细胞上表达，因此我们还在本研究中评估了其在健康和AR小鼠鼻组织中ILC2s上的表达。
一般OVA诱导的AR建模包括腹膜内全身致敏和鼻内局部刺激，通常需要至少3-4周才能达到令人满意的建模结果31。另一种OVA诱导的仅鼻腔分娩AR模型需要与一般模型方法相似的时间才能达到2型炎症和AR症状的近似水平40。然而，这两种AR建模方法对鼻腔ILC2的数量和功能仍有待进一步研究。我们评估了打喷嚏和揉鼻涕以评估AR症状。虽然包括鼻漏的评估会更有说服力，但我们发现在评估过程中很难在不干扰小鼠行为的情况下看到鼻漏，因此我们遗憾地排除了这些标准。此外，对打喷嚏和揉鼻涕的评估可能足够深刻，足以说明许多仅使用这两个标准的相关文章的鼠AR症状的严重程度41，42，43。
以前关于小鼠鼻ILC2的研究已经描述了小鼠鼻粘膜的分离44，45。他们的方案如下：简而言之，去除颅骨周围的软组织，打开鼻骨露出鼻腔，并用镊子将鼻粘膜组织从颅骨表面刮掉。虽然大多数分离的粘膜用于IF，IHC或qPCR，但关于以下单核细胞（MNC）分离和FCM分析的报道很少。在这项研究中，考虑到位于鼻粘膜中的ILC2含量较低，该手术通过消化整个鼻子而不是从鼻骨表面剥离粘膜来保留鼻粘膜的最大体积。为了优化消化方案，我们评估了三种消化培养基：0.5 mg/mL 胶原酶 IV、1 mg/mL 胶原酶 IV、1 mg/mL 胶原酶 IV 和 10 U/mL DNase I，并比较了这三种消化培养基获得的活细胞百分比和淋巴细胞频率。所有三种培养基获得的活细胞比例没有差异（90%-95%）;然而，前两种类型的消化不足，淋巴细胞频率较低（~5%）。因此，本研究选择1 mg/mL胶原酶IV和10 U/mL脱氧核糖核酸酶I作为消化培养基。然而，尚未研究其他可能取代胶原酶的酶，如自由酶和分散酶。由于酶的类型和浓度对细胞活力和细胞表面分子表达至关重要46，47，因此在鼻子消化过程中这些替代品的使用和剂量仍需要仔细探索和优化。我们使用FVD eFluor 520来检查细胞活力，因为它可以使用相当于FITC的530/30带通滤波器进行检测，因此我们可以在对Lin-细胞进行门控时排除死细胞。根据特定的抗体组合，其他细胞活力染料也是可选的。此外，与通常在其他ILC2相关研究中进行的转录因子GATA3的细胞内染色不同，本研究中的ILC2s基于细胞表面标志物（如Lin（CD11b，CD11c，CD3和B220），CD45，CD90.2和KLRG1在FCM分析中进行表征。其中，在ILC2s上表达的KLRG1已被鉴定为成熟组织ILC2s48，49的特异性标志物。尽管CD90.2的特异性较低，但它仍被接受为ILC2相关的表面标志物50。在这项研究中，小鼠没有按性别区分。研究表明，小鼠肺ILCs的丰度和细胞表面抗原在性别上存在差异，但鼻腔ILC2s与性别的相关性仍需研究50。此外，该方案没有关注其他造血细胞的比例。不同的FCM抗体组合将有助于解决这个问题。
该协议描述了一种从小鼠鼻粘膜中分离ILC2的方法。分离的ILC2可以染色以进行FCM表征，分类用于细胞培养，或在体外刺激以进行进一步分析。与先前研究10，45，51的结果一致，在AR小鼠的鼻粘膜中观察到ILC2s的大量积累。值得注意的是，CD226在局部ILC2上表达，其水平在过敏条件下进一步显着增加。因此，本研究的结果表明CD226参与ILC2依赖性AR。AR患者中的ILC2是否表达CD226以及ILC2s上的CD226表达是否在过敏性疾病中增加，应在未来的研究中进行调查。
总之，我们建立了一个从鼻粘膜中分离和鉴定ILC2s的方案，并检测了其中粘附分子的表达。该协议需要进一步优化;然而，缺乏系统，详细描述分离和表征淋巴细胞的程序的研究，特别是鼻粘膜中的先天淋巴细胞，使该协议成为研究人员探索局部鼻免疫环境的初步参考。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
R.Z.得到了国家自然科学基金（第81871258号）和第四军医大学（第2020号）的资助。Y.Z.获得陕西省自然科学基础研究发展计划（编号：2021JM-081）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
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