Summary
Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.
Abstract
Yıllar içinde yayınlanan grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler) üzerine yapılan çok sayıda araştırma ile ILC2'lerin, anti-helmint bağışıklığı, doku onarımı, termogenez ve astım ve alerjik rinit (AR) gibi otoimmün hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli patolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol oynadığı yaygın olarak bilinmektedir. ILC2'ler cilt, bağırsak, akciğerler ve burun boşluğu gibi periferik dokularda kalıcı olarak bulunur; Bununla birlikte, burun mukozal bağışıklığındaki kesin işlevleri hakkında sınırlı bilgi vardır. CD226, esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, T hücreleri ve enflamatuar monositler üzerinde eksprese edilen aktive edici bir kostimülatör moleküldür. Bununla birlikte, ILC2'lerin CD226'yı eksprese edip etmediği veya ILC2'lerle ilişkili hastalıkların patogenezinde rol oynayıp oynamadığı bilinmemektedir. Burada, ILC2'leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir yöntem oluşturduk ve sağlıklı ve AR farelerden elde edilen ILC2'lerde CD226 ekspresyonunu tespit ettik. Burada, ILC2'lerin fare burun mukozasından izole edilmesi ve tanımlanması için bu protokolü açıklıyoruz, bu da burun mukozası hastalıklarında immünolojik bozuklukların iç patolojik mekanizmasını keşfetmeye yardımcı olacaktır.
Introduction
Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler) ilk olarak farelerin periton boşluğu dokularında keşfedildi ve daha sonra kanda ve akciğerler, deri ve burun boşluğu gibi diğer periferik dokularda mevcut olduğu gösterildi 1,2,3. Dokuda yerleşik hücreler olarak, ILC2'ler esas olarak lokal olarak korunur ve çoğalır ve çok sayıda tip 2 sitokin üreterek ve tip 2 bağışıklığı indükleyerek eksojen zararlı uyaranlara cevap veren ilk muhafızlar olarak işlev görür 4,5,6. ILC2'ler ayrıca enfekte dokulara doğru kaçakçılık yaparak da etkilerini gösterebilirler 7,8.
T-helper 2 (Th2) hücrelerine benzer şekilde, ILC2'lerin karmaşık düzenleyici ağları, hava yolu alerjik hastalıkları 8,9 da dahil olmak üzere çeşitli tip 2 enflamatuar hastalıkların ilerlemesine önemli ölçüde dahil olmalarını sağlar. Astımda, epitel hücresi kaynaklı alarminler, interlökin (IL)-4, IL-5 ve IL-1310 sekresyonu yoluyla pulmoner inflamasyonu daha da teşvik eden ILC2'leri aktive edebilir. Klinik çalışmalar ayrıca, ILC2 düzeylerinin şiddetli astımlı hastaların balgamında ve kanında anlamlı derecede yükseldiğini göstermiştir, bu da ILC2'lerin astım şiddeti ile ilişkisini ve astım progresyonunun bir göstergesi olarak işlevlerini düşündürmektedir11.
Allerjik rinit (AR), her yıl milyonlarca insanı etkileyen yaygın bir kronik inflamatuar hastalıktır ve bu hastalık için etkili tedavilersınırlıdır 12,13. ILC2'ler AR'nin patofizyolojisinde, sensitizasyon fazında veya semptom oluşturma ve inflamasyon fazı14'te önemli roller oynamaktadır. AR'li hastalarda, periferik kandaki ILC2 düzeylerinin hem lokal hem de sistemik olarak yükseldiği bildirilmiştir15. Bununla birlikte, ILC2'lerin AR'nin patofizyolojisi ve progresyonu üzerindeki bazı etkileri ve altta yatan mekanizmaları hala daha fazla araştırma gerektirmektedir.
CD226 - kostimulatör bir molekül olarak işlev gören bir transmembran glikoprotein - öncelikle doğal öldürücü (NK) hücreler, T hücreleri ve diğer enflamatuar monositler üzerinde eksprese edilir16,17. CD226 ve ligandlarının (CD155 ve / veya CD112) veya rakibinin (TIGIT) etkileşimi, çeşitli bağışıklık hücrelerinin biyolojik işlevlerine katılmasına izin verir18. Antijen sunan hücrelerdeki ligandların sitotoksik lenfosit (CTL) üzerindeki CD226'ya bağlanması, her iki hücrenin aynı anda aktivasyonunu teşvik ederken, CTL'nin aktivasyonu, CD226 19,20'nin rakibi olan TIGIT (Ig ve ITIM alanlarına sahip T hücresi immünoreseptörü) tarafından daha da baskılanabilir. Bir insan ex vivo çalışması, T hücreleri üzerindeki CD226 ve CD155'in, Th alt kümeleri 21'i farklı şekilde modüle ederekTh1 / Th17 ve Th2 arasındaki dengeyi düzenlediğini ortaya koymuştur. CD226 da trombosit yapışmasına ve NK tümör öldürme aktivitesinearacılık edebilir 22,23. Bu arada, CD226 çeşitli enfeksiyon hastalıklarının, otoimmün hastalıkların ve tümörlerin patogenezinde iyi çalışılmıştır 18,24,25. Şu anda, CD226 immünoterapi için yeni bir parlak nokta haline gelmiştir. Çalışmalar, hücre dışı veziküllerin, sitotoksik aktivitelerini eski haline getirmek ve akciğer kanserinin ilerlemesine müdahale etmek için NK hücreleri üzerindeki CD226 ekspresyonunu tersine çevirebileceğini bulmuştur26. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, CD226'nın doğuştan gelen lenfoid hücre aracılı bağışıklıkta rol oynayabileceğini gösteren tek hücreli RNA dizilimi27 ile yüksek CD226 ekspresyonu ile karakterize fetal bağırsak grubu 3 ILC'lerin bir alt kümesini ortaya koymuştur.
Hava yolu inflamasyonunda ILC2'ler hakkındaki bilgilerimiz öncelikle astım üzerine yapılan çalışmalara dayanmaktadır; Bununla birlikte, burun mukozal bağışıklığındaki işlevleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Böylece, ILC2'leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir protokol oluşturulmuştur. Çalışma, CD226'nın burun dokularındaki ILC2'ler üzerindeki ekspresyonuna ve sağlıklı ve AR fareler arasındaki varyasyonuna odaklanmaktadır. Bu, yerel bağışıklıkta ILC2 aracılı düzenlemenin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlayabilir ve AR tedavisi için yeni yaklaşımlar geliştirmek için bir temel oluşturabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedür ve protokoller Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Etik Kurulu (No. 20211008) tarafından onaylanmıştır.
1. Murine AR model kuruluşu
- 8-12 haftalık erkek ve dişi vahşi tip (WT) C57BL / 6 fareleri, spesifik patojen içermeyen koşullar altında barındırır ve standart laboratuvar çorbası ve su sağlar.
- Steriliteyi korumak için temiz bir tezgahta 2 mg alüminyum hidroksit içeren 0.2 mL steril PBS içinde 50 μg ovalbümin (OVA) emülsifiye edin. 0, 7 ve 14. günlerde, intraperitoneal olarak dişi veya erkek farelere her biri 50 μg emülsifiye OVA enjekte edilir.
- 21, 22, 23, 24 ve 25. günlerde, inhalasyon anestezisi altında 30 μL steril PBS (burun deliği başına 15 μL) içinde çözünmüş 50 μg OVA ile intranazal olarak farelere aşılanır (Oksijen akış hızı veya 0.5 L / dak ile% 2-3 izofluran).
- Son meydan okumadan 24 saat sonra fareleri ötenazi yapın (26. gün).
2. Mononükleer hücrelerin (ÇUŞ'lar) burun mukozasından izolasyonu
- Fareleri derin anestezi altında servikal çıkık ile ötenazi yapın. Farelerin kafasını 5 dakika boyunca% 75 etanol içinde bekletin ve dış burun deliğine etanol girmesini önleyin. Karnı ameliyat masasına aşağı doğru yerleştirin.
- Ön dişleri kesin. Başın orta hattında, bir kesi yapın ve makas kullanarak cildi kesin.
- Alt çeneyi çıkarın, damağın ucu boyunca tüm burnu kesin ve dokuyu 5 mL buz gibi soğuk PBS içeren 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Makas ve forseps kullanarak, kemiklere yapışan eti ve kasları çıkarın.
- Fare burnunu 5 mL buz gibi PBS içeren yeni bir 60 mm Petri kabına aktarın. Kemikleri iki kez 5 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
- Burnu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Burnu yeterince parçalayın ve 2 mL önceden ısıtılmış sindirim tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın (1 mg / mL kollajenaz IV ve 10 U / mL DNaz I ile desteklenen RPMI 1640 ortamı).
- Kapağı sabitleyin ve tüpü dikey olarak 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin, 40 dakika boyunca 120-150 rpm'de sürekli çalkalama yapın.
NOT: En yüksek enzim aktivitesini elde etmek için sindirim tamponunu önceden 37 °C'ye ısıtın. - Sindirim sürecini durdurmak için% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 5 mL buz gibi soğuk RPMI 1640 ortamı ekleyin.
- Katı parçaları çıkarmak için 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı yavaşça atın.
- Peleti buz gibi soğuk RPMI 1640 orta ve santrifüjde 500 x g'de 5 dakika boyunca tekrar askıya alın. Supernatan'ı yavaşça atın.
- Hücre peletini 4 mL'lik %40 yoğunluklu gradyan ortamında (160 μL 10x PBS + 1,44 mL yoğunluk gradyan ortam stok çözeltisi + 2,4 mL RPMI 1640 ortam) yeniden askıya alın.
- Tüpün altına yavaşça bir Pasteur pipet yerleştirin ve yavaşça 2,5 mL %80 yoğunluklu gradyan ortamı ekleyin (200 μL 10x PBS + 1,8 mL yoğunluk gradyanı ortam stok çözeltisi + 0,5 mL RPMI 1640 ortam).
- Santrifüjün hızlanma ve yavaşlama oranını üçüncü vitesten ve santrifüjden daha düşük bir değere ayarlayın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
- Potansiyel kontaminasyonu önlemek için arayüzdeki hücreleri boşaltmadan önce üst safsızlık tabakasını temizleyin. %40/%80 yoğunluklu gradyan ortam arabirimindeki mononükleer hücreler (ÇUŞ'lar) katmanını, bir pipet kullanarak 2 mL buz gibi soğuk PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice boşaltın. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.
3. FCM analizi için yüzey boyama
- Hücreleri hasat edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini boyama tamponunda (PBS% 2 FBS ve% 0.1 NaN3 ile desteklenmiş) tekrar askıya alın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Supernatan'ı atın.
DİKKAT: Boyama tamponunu hazırlarken dikkatli olun. NaN3 çok toksiktir ve yutulduğunda, solunduğunda veya ciltle temas ettiğinde organlara zarar verebilir. Ayrıca, çevreye salınımdan kaçının. - Hücreleri tüp başına 80 μL bloke edici çözelti (boyama tamponunda seyreltilmiş anti-CD16/32 antikoru (1:100)) içinde yeniden askıya alın. Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Yıkamadan, yüzey lekeleyici antikor kokteylinin uygun seyreltmesinden 20 μL ekleyin (Tablo 1).
- Antikor kokteylini numunelere eklemeden hemen önce 1 μL (test başına) sabitlenebilir canlılık boyası 520 (FVD) ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Negatif kontroller olarak eşleşen izotip antikorları ve floresan eksi bir (FMO) ayarlayın.
- Hücreleri 500 μL boyama tamponunda, 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yaparak yıkayın.
- Hücre peletini 200 μL boyama tamponunda yeniden askıya alın. Lekeli hücrelere 50 μL vorteksli mutlak sayma boncukları ekleyin ve çalkalayın. Onları bir akış sitometrisi (FCM) analizine tabi tutun.
NOT: FCM verileri spektral hücre analizörü kullanılarak elde edilmiş ve akış sitometrisi (FCM) analiz yazılımı ile analiz edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ILC2'lerin AR'deki rolünü araştırmak için OVA kaynaklı bir murin modeli geliştirilmiştir. AR murin modelinin yapımı, 28,29,30,31 küçük değişikliklerle önceki çalışmalara dayanıyordu. Son burun meydan okumasından sonra hapşırma ve burun kaşınma sıklığını ölçmek için 10 dakikalık bir video çekildi. OVA-indüklenmiş-AR farelerin allerjik semptomları Şekil 1'de sunulmuştur. AR farelerde burun sürtünme ve hapşırma sıklığı kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksekti.
Daha sonra, ÇUŞ'ları murin burun mukozasından izole etmek ve FCM analizini kullanarak karakterizasyonlarını gerçekleştirmek için bir prosedür tanımladık. Her murin burnundan yaklaşık 2-3 x 106 lenfosit elde edildi. Ölü hücreler FVD boyaması ile dışlandı. İzole edilen hücreler arasında ILC2'ler için geçit stratejisi Lin (CD11b, CD11c, CD3 ve B220) - CD45 + CD90.2 + KLRG1 + hücreleri idi. Tüm kapılar izotip veya FMO kontrolüne göre çizildi. Tipik olarak, Lin− CD45+ hücrelerinin ~%2-%3'ü sağlıklı kontrol farelerinin burun mukozasında tanımlanmıştır (Şekil 2). Murin burun mukozasındaki ILC2'lerin mutlak sayısı 2.000-4.000 arasında değişmektedir.
Daha sonra ILC2'leri yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak AR farelerinden izole ettik. HC ve AR fareleri arasında mutlak lenfosit sayılarında fark yoktu. FCM sonuçları, AR farelerinde ILC2'lerin fraksiyonunun, Lin-CD45 + lenfositlerin toplam sayısının% 9 -% 14'ü olduğunu ve AR burun mukozasındaki ILC2 sayısında sağlıklı kontrol farelerindekine kıyasla kayda değer bir artış olduğunu göstermiştir (Şekil 3).
ILC2'lerde CD226 ekspresyonunu tespit ettik. Ortalama olarak, ILC2'lerin% 51.9'u aşılanmamış koşullar altında CD226'yı ifade ederken, CD226'yı ifade eden ILC2'lerin ortalama oranı, AR farelerinde% 54.8 idi ve bu da kontrol farelerindekine kıyasla anlamlı olmayan bir artış eğilimi gösterdi. Hücre frekansına ek olarak, CD226'nın hücre yüzeyi ekspresyon seviyesi, FCM analiz yazılımı tarafından otomatik olarak hesaplanan ortalama floresan yoğunluğu (MFI) kullanılarak da belirlendi. İlginç bir şekilde, CD226'nın MFI'si, AR farelerinde kontrol farelerine kıyasla önemli ölçüde yukarı regüle edilmiştir (Şekil 4), alerjik burun mukozasının ILC2'lerinde CD226'nın yüksek bir ekspresyonunu göstermektedir.
Resim 1: OVA kaynaklı murin AR modeli. (A) Murin AR modeli kuruluşunun şematik diyagramı. 10 dakikalık bir süre içinde burun sürtünme (B) ve hapşırma (C) sıklığı. Değerler ortalama ± standart sapma (SD) (n = 3) olarak sunulur. İki grubu karşılaştırmak için Student t-testi uygulandı; P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ILC2'ler için FCM geçit stratejisi. ÇUŞ'lar yukarıda tarif edildiği gibi izole edilmiştir. (A) Yoğunluk grafiği, izole edilmiş ÇUŞ'ların FSC ve SSC eksenleri boyunca dağılımını gösterir. (B) Tekliler FSC özelliklerine göre kapılıydı. (C) Lin-hücreleri, ÇUŞ'larda miyeloid hücreleri, B hücrelerini ve T hücrelerini dışlamak için CD11b, CD11c, CD3 ve B220 negatif ekspresyonu olarak tanımlandı. (D) ILC'ler Lin− CD45+ ile karakterize edilir. (E) ILC2'ler, ILC'ler arasında CD90.2+ KLRG1+ ile kapatılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sağlıklı ve AR farelerin burun mukozasındaki ILC2'ler. (A) Temsili FCM görüntüleri, sağlıklı kontrol (HC) ve AR gruplarının burun boşluğu mukozasından ILC'ler arasındaki ILC2'lerin oranlarını göstermektedir. (B) HC ve AR gruplarındaki Lin− CD45+ hücrelerindeki ILC2'lerin oranları. Değerler SD'± ortalama olarak sunulur (n = 3). İki gruplu karşılaştırma için öğrenci t-testi yapıldı. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nazal mukozal ILC2'lerde CD226 ekspresyonu. ILC2'ler yukarıda belirtilen strateji kullanılarak karakterize edilmiştir. CD226'nın ILC2'ler üzerindeki ekspresyonu FCM kullanılarak değerlendirildi. (A) HC ve AR gruplarında CD226 ekspresyonunun temsili histogramları; mavi alan CD226 FMO kontrolünü temsil eder. (B,C) HC grubu ve AR grubunda CD226-pozitif ILC2'lerin oranları ve CD226'nın ortalama floresan yoğunluğu (MFI). Değerler SD'± ortalama olarak ifade edilir (n = 3). İki grup arasında karşılaştırma için öğrenci t-testi yapıldı. P < 0.05 anlamlı olarak değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor | Florokrom | Klon | Seyreltme |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Siyanin7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Flor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tablo 1: Yüzey boyama antikor kokteyli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ILC2'ler, artan sayıda çalışmanın gösterdiği gibi, tip 2 inflamasyon ve inflamatuar bozukluklarla yakından ilişkilidir. Hem fare modelleri hem de insan gözlemi, üst solunum yolundaki işlevinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur. Astım patofizyolojisinde, ILC2'ler çoğunlukla epitel hücreleri tarafından üretilen timik stromal lenfopoietin, IL-25 ve IL-33 yoluyla aktive edilir. Daha sonra Th2 hücrelerini yansıtan ILC2'ler, tip 2 inflamasyonu şiddetlendirmek için IL-4, IL-5 ve IL-13 üretir32. Ayrıca, ILC2'lerin farklı alt kümeleri de IL-10 ve IL-1733,34,35 üretir. AR ayrıca tip 2 hücreler tarafından yönlendirilen bir tür hava yolu alerjik iltihabıdır. ILC2'lerin AR patofizyolojisine katılımı yakın zamanda gösterilmiştir14. Bununla birlikte, AR altındaki ILC2'lerin potansiyel düzenleyici mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir.
Kanıtlar, farklı ILC2'ler arasındaki etkileşimin yüzey moleküllerine dayanabileceğini göstermektedir36. Örneğin, ILC2'lerde ifade edilen hem ICOS hem de ICOS-ligandları hayatta kalmaları ve işlevleri için gereklidir37. Ek olarak, ILC2'ler ayrıca hücre göçü ve hücre-hücre etkileşimi üzerinde önemli etkiler gösteren ICAM-1 ve LFA-1'i de eksprese eder 7,38. Ek olarak, ILC2'ler bu hücre yüzeyi molekülleri aracılığıyla diğer bağışıklık hücreleriyle çapraz konuşabilir. Örneğin, OX40L, akciğer iltihabında CD4 + T hücreleri ve ILC2'ler arasındaki etkileşim için baskın bir aracıdır39. CD226, bir transmembran kostimülatör molekülü olarak, çeşitli bağışıklık hücreleri üzerinde eksprese ettiğinden, bu çalışmada sağlıklı ve AR farelerden burun dokularında ILC2'ler üzerindeki ekspresyonunu da değerlendirdik.
Genel OVA kaynaklı AR modellemesi, tatmin edici modelleme sonuçları elde etmek için genellikle en az 3-4 hafta gerektiren intraperitoneal sistemik sensitizasyon ve intranazal lokal stimülasyonu içerir31. Başka bir OVA kaynaklı nazal sadece doğum AR modeli, yaklaşık tip 2 inflamasyon ve AR semptomları40 seviyesine ulaşmak için genel model yöntemiyle benzer bir zaman alır. Bununla birlikte, bu iki AR modelleme yöntemiyle nazal ILC2'lerin sayısı ve işlevi hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. AR semptomlarını değerlendirmek için hapşırma ve burun sürtünmesini değerlendirdik. Rinore için değerlendirmeyi dahil etmek daha ikna edici olsa da, değerlendirme sırasında farelerin davranışlarına müdahale etmeden rinoreyi görmenin zor olduğunu gördük, bu yüzden ne yazık ki bu kriterleri dışladık. Ek olarak, hapşırma ve burun sürtünmesi için yapılan değerlendirme, sadece bu iki kriteri kullanan ilgili makalelerin çoğu için murin AR semptomlarının şiddetini gösterecek kadar derin olabilir41,42,43.
Fareler nazal ILC2'ler ile ilgili önceki çalışmalar, murin burun mukozasının izolasyonunu44,45 olarak tanımlamıştır. Protokolleri aşağıdaki gibidir: Kısaca, kafatasının etrafındaki yumuşak dokuyu çıkarın, burun boşluğunu ortaya çıkarmak için burun kemiğini açın ve burun mukoza dokusunu kafatasının yüzeyinden forseps ile kazıyın. İzole mukozanın çoğu IF, IHC veya qPCR için kullanılırken, mononükleer hücrelerin (ÇUŞ'lar) aşağıdaki izolasyonu ve FCM analizi hakkında çok az şey bildirilmiştir. Bu çalışmada burun mukozasında bulunan ILC2 miktarlarının düşük olduğu göz önüne alındığında operasyon, mukozayı burun kemiğinin yüzeyinden sıyırmak yerine burnun tamamını sindirerek burun mukozasının maksimum hacmini korumuştur. Sindirim protokolünü optimize etmek için üç sindirim ortamını değerlendirdik: 0.5 mg / mL kollajenaz IV, 1 mg / mL kollajenaz IV ve 1 mg / mL kollajenaz IV ve 10 U / mL DNaz I ve bu üç sindirim ortamı tarafından elde edilen canlı hücrelerin yüzdesini ve lenfosit sıklığını karşılaştırdık. Her üç ortam tarafından elde edilen canlı hücrelerin oranı arasında bir fark yoktur (%90-%95); Bununla birlikte, ilk iki sindirim tipi düşük lenfosit sıklığı (~% 5) ile yetersizdi. Bu nedenle bu çalışmada sindirim ortamı olarak 1 mg/mL kollajenaz IV ve 10 U/mL DNaz I seçilmiştir. Bununla birlikte, kollajenazın yerini alabilecek liberaz ve dispaz gibi diğer enzimler çalışılmamıştır. Enzimlerin tipi ve konsantrasyonu hücre canlılığı ve hücre yüzeyi molekül ekspresyonu46,47 için kritik olduğundan, burun sindirimi sırasında bu alternatiflerin kullanımı ve dozajı hala dikkatli bir keşif ve optimizasyona ihtiyaç duymaktadır. Hücre canlılığını kontrol etmek için FVD eFluor 520 kullandık, çünkü FITC'ye eşdeğer bir 530/30 bant geçiş filtresi kullanılarak tespit edilebilir, böylece Lin- hücrelerini geçerken ölü hücreleri hariç tutabiliriz. Diğer hücre canlılık boyaları da spesifik antikor panellerine göre isteğe bağlıdır. Ayrıca, genellikle ILC2 ile ilişkili diğer çalışmalarda yapılan transkripsiyon faktörleri GATA3'ün hücre içi boyanması yerine, bu çalışmada ILC2'ler, FCM analizinde Lin (CD11b, CD11c, CD3 ve B220), CD45, CD90.2 ve KLRG1 gibi hücre yüzeyi belirteçlerine dayanarak karakterize edilmiştir. Bunlar arasında, ILC2'lerde eksprese edilen KLRG1, olgun doku ILC2'lerin spesifik bir belirteci olarak tanımlanmıştır48,49. CD90.2 daha az spesifik olmasına rağmen, ILC2 ile ilişkili bir yüzey işaretleyici50 olarak kabul edilmektedir. Bu çalışmada, fareler cinsiyete göre ayırt edilmedi. Araştırmalar, farelerde pulmoner ILC'lerin bolluğunun ve hücre yüzeyi antijenlerinin cinsiyette farklı olduğunu, ancak nazal ILC2'lerin cinsiyetle korelasyonunun hala incelenmesi gerektiğini göstermiştir50. Ek olarak, protokol diğer hematopoetik hücrelerin oranına odaklanmadı. Farklı FCM antikor panelleri bu sorunun çözülmesine yardımcı olacaktır.
Bu protokol, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek için bir yöntem tanımlamıştır. İzole ILC2'ler FCM karakterizasyonu için boyanabilir, hücre kültürü için sıralanabilir veya daha ileri analizler için in vitro olarak uyarılabilir. Önceki çalışmaların bulguları ile tutarlı olarak 10,45,51, AR farelerinin burun mukozasında önemli miktarda ILC2 birikimi gözlenmiştir. Özellikle, CD226 lokal ILC2'lerde eksprese edildi ve alerjik durumlarda seviyesi önemli ölçüde arttı. Bu nedenle, bu çalışmadaki bulgular CD226'nın ILC2'ye bağımlı AR'ye katılımını göstermektedir. AR'li hastalarda ILC2'lerin CD226'yı eksprese edip etmediği ve ILC2'lerdeki CD226 ekspresyonunun alerjik durumlarda artıp artmadığı gelecekteki çalışmalarda araştırılmalıdır.
Sonuç olarak, ILC2'leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir protokol oluşturduk ve içlerindeki adezyon moleküllerinin ekspresyonunu tespit ettik. Protokol daha fazla optimizasyon gerektirir; Bununla birlikte, lenfositlerin, özellikle burun mukozasındaki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin izole edilmesi ve karakterize edilmesi prosedürünü sistematik ve ince bir şekilde tanımlayan çalışmaların eksikliği, bu protokolü yerel nazal immünolojik ortamı araştıran araştırmacılar için bir ön referans haline getirmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
R.Z., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81871258) ve Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi (No.2020rcfczr) tarafından sağlanan fonlar tarafından desteklenmiştir. Y.Z., Shaanxi'nin Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı (No. 2021JM-081) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
