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Immunology and Infection

सीडी 226 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए माउस नाक म्यूकोसा से समूह 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं का अलगाव

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63525
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 4, 4, 1
1Otolaryngological Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3Orthopedic Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 4Department of Immunology, Fourth Military Medical University
* These authors contributed equally

Summary

समूह 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाएं (आईएलसी 2), टाइप 2 सूजन में फंसी हैं, मुख्य रूप से हेल्मिन्थ संक्रमण, एलर्जी रोगों, चयापचय होमियोस्टैसिस और ऊतक की मरम्मत के जवाब में भाग लेती हैं। इस अध्ययन में, मुराइन नाक म्यूकोसा से आईएलसी 2 को अलग करने और सीडी 226 की अभिव्यक्ति का पता लगाने की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया है।

Abstract

वर्षों से प्रकाशित समूह 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी 2) पर प्रचुर मात्रा में शोध के साथ, आईएलसी 2 को व्यापक रूप से एंटी-हेल्मिन्थ प्रतिरक्षा, ऊतक की मरम्मत, थर्मोजेनेसिस और अस्थमा और एलर्जी राइनाइटिस (एआर) जैसे ऑटोइम्यून रोगों सहित विभिन्न रोग प्रक्रियाओं को विनियमित करने में फंसाया जाता है। आईएलसी 2 स्थायी रूप से परिधीय ऊतकों जैसे त्वचा, आंत, फेफड़े और नाक गुहा में रहते हैं; हालांकि, नाक म्यूकोसल प्रतिरक्षा में उनके सटीक कार्यों के बारे में सीमित जानकारी है। सीडी 226 एक सक्रिय कोस्टिमुलेटरी अणु है, जो मुख्य रूप से प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और भड़काऊ मोनोसाइट्स पर व्यक्त किया जाता है। हालांकि, क्या आईएलसी 2 सीडी 226 को व्यक्त करते हैं या आईएलसी 2 से संबंधित बीमारियों के रोगजनन में भूमिका निभाते हैं, यह अज्ञात है। यहां, हमने नाक के श्लेष्म से आईएलसी 2 को अलग करने और पहचानने के लिए एक विधि स्थापित की और स्वस्थ और एआर चूहों से प्राप्त आईएलसी 2 पर सीडी 226 अभिव्यक्ति का पता लगाया। यहां, हम माउस नाक म्यूकोसा से आईएलसी 2 के अलगाव और पहचान के लिए इस प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो नाक के श्लेष्म रोगों में प्रतिरक्षात्मक विकारों के आंतरिक रोग तंत्र का पता लगाने में मदद करेगा।

Introduction

समूह 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी 2) को पहली बार चूहों के पेरिटोनियल गुहा ऊतकों में खोजा गया था और बाद में रक्त और अन्य परिधीय ऊतकों जैसे फेफड़ों, त्वचा और नाक गुहा 1,2,3 में मौजूद होने का प्रदर्शन किया गया था। ऊतक-निवासी कोशिकाओं के रूप में, आईएलसी 2 को मुख्य रूप से बनाए रखा जाता है और स्थानीय रूप से बढ़ाया जाता है और कई टाइप 2 साइटोकिन्स के उत्पादन और टाइप 2 प्रतिरक्षा 4,5,6 को प्रेरित करने के माध्यम से बहिर्जात हानिकारक उत्तेजनाओं का जवाब देने वाले पहले गार्ड के रूप में कार्य करता है। आईएलसी 2 संक्रमित ऊतकों 7,8 की ओर तस्करी करके भी अपना प्रभाव डाल सकता है।

टी-हेल्पर 2 (टीएच 2) कोशिकाओं के समान, आईएलसी 2 के जटिल नियामक नेटवर्क विभिन्न प्रकार 2 भड़काऊ रोगों की प्रगति में उनकी महत्वपूर्ण भागीदारी सुनिश्चित करते हैं, जिसमें वायुमार्ग एलर्जी रोग 8,9 शामिल हैं। अस्थमा में, उपकला कोशिका-व्युत्पन्न अलार्मिन आईएलसी 2 को सक्रिय कर सकते हैं, जो इंटरल्यूकिन (आईएल) -4, आईएल -5 और आईएल -1310 के स्राव के माध्यम से फुफ्फुसीय सूजन को बढ़ावा देते हैं। नैदानिक अध्ययनों ने यह भी संकेत दिया है कि गंभीर अस्थमा वाले रोगियों के थूक और रक्त में आईएलसी 2 का स्तर काफी बढ़ गया था, जो अस्थमा की गंभीरता के साथ आईएलसी 2 के संबंध का सुझाव देता है और अस्थमा की प्रगति के भविष्यवक्ता के रूप में उनका कार्यकरता है।

एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) एक आम पुरानी सूजन की बीमारी है जो सालाना लाखों लोगों को प्रभावित करती है, और इस बीमारी के लिए प्रभावी उपचारसीमित हैं 12,13. आईएलसी 2 एआर के पैथोफिज़ियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, चाहे संवेदीकरण चरण या लक्षण पीढ़ी और सूजन चरण14 में। एआर वाले रोगियों में, परिधीय रक्त में आईएलसी 2 के स्तर को स्थानीय और व्यवस्थित रूप से15 दोनों को ऊंचा बताया गया है। हालांकि, एआर के पैथोफिज़ियोलॉजी और प्रगति पर आईएलसी 2 के कुछ प्रभाव और अंतर्निहित तंत्र को अभी भी आगे की खोज की आवश्यकता है।

सीडी 226 - एक ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन जो एक कोस्टिमुलेटरी अणु के रूप में कार्य करता है - मुख्य रूप से प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और अन्य भड़काऊ मोनोसाइट्स16,17 पर व्यक्त किया जाता है। सीडी 226 और इसके लिगेंड (सीडी 155 और / या सीडी 112) या प्रतियोगी (टीआईजीआईटी) की बातचीत इसे विभिन्नप्रतिरक्षा कोशिकाओं के जैविक कार्यों में भाग लेने की अनुमति देती है। साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइट (सीटीएल) पर सीडी 226 के लिए एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं पर लिगेंड का बंधन एक साथ दोनों कोशिकाओं के सक्रियण को बढ़ावा देता है, जबकि सीटीएल के सक्रियण को टीआईजीआईटी (आईजी और आईटीआईएम डोमेन के साथ टी सेल इम्यूनोसेप्टर) द्वारा आगे दबाया जा सकता है, जो सीडी 22619,20 का प्रतियोगी है। एक मानव पूर्व विवो अध्ययन से पता चला है कि टी कोशिकाओं पर सीडी 226 और सीडी 155 टीएच 1 / टी एच 17 और टी एच 2 के बीच संतुलन को अलग-अलग संशोधित टी एच उपसमुच्चय21 के माध्यम से नियंत्रित करते हैं। सीडी 226 प्लेटलेट आसंजन और एनके ट्यूमर-हत्या गतिविधि22,23 को भी मध्यस्थ कर सकता है। इस बीच, सीडी 226 विभिन्न संक्रामक रोगों, ऑटोइम्यून बीमारियों और ट्यूमर 18,24,25 के रोगजनन में अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है। वर्तमान में, सीडी 226 इम्यूनोथेरेपी के लिए एक नया उज्ज्वल स्थान बन गया है। अध्ययनों में पाया गया है कि बाह्य पुटिकाएं एनके कोशिकाओं पर सीडी 226 अभिव्यक्ति को उलट सकती हैं ताकि उनकी साइटोटोक्सिक गतिविधि को बहाल किया जा सके और फेफड़ोंके कैंसर की प्रगति में हस्तक्षेप किया जा सके। हाल के एक अध्ययन में एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण27 द्वारा उच्च सीडी 226 अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण आंतों के समूह 3 आईएलसी के एक उपसमूह का पता चला है, जिसने संकेत दिया कि सीडी 226 जन्मजात लिम्फोइड सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा में भूमिका निभा सकता है।

वायुमार्ग की सूजन में आईएलसी 2 के बारे में हमारा ज्ञान मुख्य रूप से अस्थमा पर अध्ययन पर आधारित है; हालांकि, नाक की श्लैष्मिक प्रतिरक्षा में उनके कार्यों के बारे में बहुत कम जानकारी है। इस प्रकार, नाक के श्लेष्म से आईएलसी 2 को अलग करने और पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था। अध्ययन नाक के ऊतकों में आईएलसी 2 पर सीडी 226 की अभिव्यक्ति और स्वस्थ और एआर चूहों के बीच इसकी भिन्नता पर केंद्रित है। यह स्थानीय प्रतिरक्षा में आईएलसी 2-मध्यस्थता विनियमन के अंतर्निहित तंत्र में नवीन अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और एआर उपचार के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है।

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Protocol

सभी प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे। सभी प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल को चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय (नंबर 20211008) की वैज्ञानिक अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. मुराइन एआर मॉडल स्थापना

  1. घर के नर और मादा जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) सी 57बीएल / 6 चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में 8-12 सप्ताह की आयु में रखा जाता है और मानक प्रयोगशाला चाउ और पानी प्रदान किया जाता है।
  2. बाँझपन बनाए रखने के लिए एक साफ बेंच पर 2 मिलीग्राम एल्यूमीनियम हाइड्रॉक्साइड युक्त बाँझ पीबीएस के 0.2 मिलीलीटर में ओवएल्बुमिन (ओवीए) के 50 μg का अनुकरण करें। दिन 0, 7, और 14 पर, इंट्रापरिटोनियल रूप से मादा या पुरुष चूहों को इमल्सीफाइड ओवीए के 50 μg के साथ इंजेक्ट करें।
  3. दिन 21, 22, 23, 24 और 25 पर, इंट्रानेसल रूप से चूहों को इनहेलेशन एनेस्थीसिया (ऑक्सीजन प्रवाह दर या 0.5 एल / मिनट के साथ 2-3% आइसोफ्लुरेन) के तहत बाँझ पीबीएस (15 μL प्रति नथुने) के 30 μL में घुलने वाले ओवीए के 50 μg के साथ इंट्रानेजल रूप से इंजेक्ट किया जाता है।
  4. अंतिम चुनौती (दिन 26) के 24 घंटे बाद चूहों को इच्छामृत्यु दें।

2. नाक के श्लेष्म से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) का अलगाव

  1. गहरे संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें। चूहों को 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में भिगोएं और इथेनॉल को बाहरी नथुने में प्रवेश करने से बचें। पेट को ऑपरेटिंग टेबल पर नीचे की ओर रखें।
  2. दाँत ों को काट लें। सिर की मध्य रेखा पर, एक चीरा लगाएं, और कैंची का उपयोग करके त्वचा को काट लें।
  3. निचले जबड़े को हटा दें, तालु के अंत में पूरी नाक काट दें, और ऊतक को 60 मिमी पेट्री डिश में रखें जिसमें 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस हो। कैंची और बल का उपयोग करके, हड्डियों का पालन करने वाले मांस और मांसपेशियों को हटा दें।
  4. माउस नाक को एक नए 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस होता है। 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ हड्डियों को दो बार धोएं।
  5. नाक को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. नाक को पर्याप्त रूप से स्मैश करें और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2 एमएल प्रीवार्म्ड डाइजेस्ट बफर (आरपीएमआई 1640 माध्यम 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस IV और 10 यू / एमएल डीएनएस आई के साथ पूरक) होता है।
  7. ढक्कन को बांधें और ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेकर में लंबवत रखें, 40 मिनट के लिए 120-150 आरपीएम पर निरंतर आंदोलन के साथ।
    नोट: उच्चतम एंजाइम गतिविधि प्राप्त करने के लिए डाइजेस्ट बफर को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्मिंग करें।
  8. पाचन प्रक्रिया को रोकने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त बर्फ-ठंडा आरपीएमआई 1640 माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  9. ठोस टुकड़ों को हटाने के लिए 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  10. 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर धीरे से सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  11. 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे आरपीएमआई 1640 मध्यम और सेंट्रीफ्यूज में 500 x g पर गोली को फिर से निलंबित करें। धीरे से सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  12. 40% घनत्व ढाल मीडिया के 4 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें (10x PBS का 160 μL + घनत्व ढाल मीडिया स्टॉक समाधान का 1.44 mL + RPMI 1640 माध्यम का 2.4 mL)।
  13. धीरे से ट्यूब के नीचे एक पाश्चर पिपेट डालें और धीरे-धीरे 80% घनत्व ढाल मीडिया के 2.5 एमएल जोड़ें (10x PBS का 200 μL + घनत्व ढाल मीडिया स्टॉक समाधान का 1.8 मिलीलीटर + आरपीएमआई 1640 माध्यम का 0.5 मिलीलीटर)।
  14. सेंट्रीफ्यूज के त्वरण और मंदी दर को तीसरे गियर की तुलना में कम सेट करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. संभावित संदूषण से बचने के लिए इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं को निकालने से पहले अशुद्धियों की शीर्ष परत को हटा दें। 40%/80% घनत्व ढाल मीडिया इंटरफ़ेस पर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) परत को सावधानीपूर्वक एक पिपेट का उपयोग करके 2 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पीबीएस युक्त 15 एमएल ट्यूब में निकालें। कोशिकाओं को दो बार बर्फ-ठंडे पीबीएस से धोएं।

3. एफसीएम विश्लेषण के लिए सतह धुंधला होना।

  1. कोशिकाओं की कटाई करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेल गोली को धुंधला बफर (पीबीएस 2% एफबीएस और 0.1% एनएएन3 के साथ पूरक) में पुन: निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    सावधानी: धुंधला बफर तैयार करते समय सतर्क रहें। NaN3 बहुत विषाक्त है और निगलने, साँस लेने या त्वचा के संपर्क में आने पर अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा, पर्यावरण में रिलीज से बचें।
  2. प्रति ट्यूब 80 μL ब्लॉकिंग समाधान (एंटी-CD16/32 एंटीबॉडी (1:100) धुंधला बफर में पतला) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. धोने के बिना, सतह-धुंधला एंटीबॉडी कॉकटेल (तालिका 1) के उपयुक्त कमजोर पड़ने के 20 μL जोड़ें।
  4. नमूने में एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ने से ठीक पहले फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई 520 (एफवीडी) के 1 μL (प्रति परीक्षण) जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें। आइसोटाइप एंटीबॉडी और फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके 500 μL धुंधला बफर में कोशिकाओं को धोएं।
  6. सेल गोली को 200 μL धुंधला बफर में पुन: निलंबित करें। दाग वाली कोशिकाओं में 50 μL भंवर पूर्ण गिनती मोती जोड़ें और आंदोलन करें। उन्हें फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम) विश्लेषण के अधीन करें।
    नोट: एफसीएम डेटा एक वर्णक्रमीय सेल विश्लेषक का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम) विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया था।

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Representative Results

एआर में आईएलसी 2 की भूमिका का पता लगाने के लिए एक ओवीए-प्रेरित मुराइन मॉडल विकसित किया गया था। एआर मुराइन मॉडल का निर्माण28,29,30,31 मामूली संशोधनों के साथ पिछले अध्ययनों पर आधारित था। आखिरी नाक चुनौती के बाद छींकने और नाक खरोंचने की आवृत्ति को मापने के लिए 10 मिनट का एक वीडियो कैप्चर किया गया था। ओवीए-प्रेरित-एआर चूहों के एलर्जी के लक्षण चित्रा 1 में प्रस्तुत किए गए थे। एआर चूहों में नाक रगड़ने और छींकने की आवृत्ति नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थी।

इसके बाद, हमने म्यूरिन नाक म्यूकोसा से बहुराष्ट्रीय कंपनियों को अलग करने और एफसीएम विश्लेषण का उपयोग करके उनके लक्षण वर्णन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया। प्रत्येक मुराइन नाक से लगभग 2-3 x 106 लिम्फोसाइट्स प्राप्त किए गए थे। मृत कोशिकाओं को एफवीडी धुंधला होने से बाहर रखा गया था। पृथक कोशिकाओं के बीच आईएलसी 2 के लिए गेटिंग रणनीति लिन (सीडी 11 बी, सीडी 11 सी, सीडी 3, और बी 220) - सीडी 45 + सीडी 90.2 + केएलआरजी 1 + कोशिकाएं थीं। सभी द्वार आइसोटाइप या एफएमओ नियंत्रण के आधार पर तैयार किए गए थे। आमतौर पर, स्वस्थ नियंत्रण चूहों के नाक के श्लेष्म में ~ 2% -3% लिन- सीडी 45+ कोशिकाओं की पहचान की गई थी (चित्रा 2)। मुराइन नाक म्यूकोसा में आईएलसी 2 की पूर्ण संख्या 2,000-4,000 से भिन्न होती है।

फिर हमने उपरोक्त वर्णित विधि का उपयोग करके एआर चूहों से आईएलसी 2 को अलग किया। एचसी और एआर चूहों के बीच लिम्फोसाइटों की पूर्ण संख्या में कोई अंतर नहीं था। एफसीएम परिणामों ने संकेत दिया कि एआर चूहों में आईएलसी 2 का अंश लिन- सीडी 45+ लिम्फोसाइटों की कुल संख्या का 9% -14% था, जो स्वस्थ नियंत्रण चूहों की तुलना में एआर नाक श्लेष्म में आईएलसी 2 की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि दर्शाता है (चित्रा 3)।

हमने ILC2s पर CD226 की अभिव्यक्ति का पता लगाया। औसतन, आईएलसी 2 के 51.9% ने अप्रतिरक्षित परिस्थितियों में सीडी 226 व्यक्त किया, जबकि सीडी 226 को व्यक्त करने वाले आईएलसी 2 का औसत अनुपात एआर चूहों में 54.8% था, जिसने नियंत्रित चूहों की तुलना में वृद्धि की एक गैर-महत्वपूर्ण प्रवृत्ति दिखाई। सेल आवृत्ति के अलावा, सीडी 226 के सेल-सतह अभिव्यक्ति स्तर को औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का उपयोग करके भी निर्धारित किया गया था जिसे एफसीएम विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से गणना की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि सीडी 226 के एमएफआई को नियंत्रण चूहों (चित्रा 4) की तुलना में एआर चूहों में काफी अधिक विनियमित किया गया था, जो एलर्जी नाक श्लेष्म के आईएलसी 2 पर सीडी 226 की एक ऊंचा अभिव्यक्ति का संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1: ओवीए-प्रेरित मुराइन एआर मॉडल। (ए) मुराइन एआर मॉडल स्थापना का योजनाबद्ध आरेख। 10 मिनट की अवधि में नाक रगड़ने (बी) और छींकने (सी) की आवृत्ति। मानों को मानक विचलन (एसडी) (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। दो समूहों की तुलना करने के लिए, छात्र का टी-टेस्ट किया गया था; पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आईएलसी 2 के लिए एफसीएम गेटिंग रणनीति। बहुराष्ट्रीय कंपनियों को अलग-थलग कर दिया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है। (ए) घनत्व ग्राफिक एफएससी और एसएससी अक्षों के साथ अलग-थलग बहुराष्ट्रीय कंपनियों के वितरण को दर्शाता है। (बी) एफएससी विशेषताओं के आधार पर सिंगलेट्स को गेट किया गया था। (C) MNCs में माइलॉयड कोशिकाओं, B कोशिकाओं और T कोशिकाओं को बाहर करने के लिए Lin- कोशिकाओं को CD11b, CD11c, CD3 और B220 नकारात्मक अभिव्यक्ति के रूप में परिभाषित किया गया था। मृत कोशिकाओं को फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई (FVD) धुंधला करने के माध्यम से बाहर रखा गया था। (डी) आईएलसी को लिन-सीडी 45+ की विशेषता है। (ङ) आईएलसी2 को आईएलसी के बीच सीडी902+ केएलआरजी1+ द्वारा गेट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: स्वस्थ और एआर चूहों के नाक के श्लेष्म में आईएलसी 2। (ए) प्रतिनिधि एफसीएम छवियां स्वस्थ नियंत्रण (एचसी) और एआर समूहों के नाक गुहा म्यूकोसा से आईएलसी के बीच आईएलसी 2 के अनुपात को दर्शाती हैं। (बी) एचसी और एआर समूहों में लिन-सीडी 45+ कोशिकाओं में आईएलसी 2 का अनुपात। मानों को एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। छात्र का टी-टेस्ट दो-समूह तुलना के लिए किया गया था। पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नाक म्यूकोसल आईएलसी 2 में सीडी 226 अभिव्यक्ति। आईएलसी 2 को उपर्युक्त रणनीति का उपयोग करके चित्रित किया गया था। आईएलसी 2 पर सीडी 226 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन एफसीएम का उपयोग करके किया गया था। (ए) एचसी और एआर समूहों में सीडी 226 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम; नीला क्षेत्र CD226 FMO नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। (बी, सी) एचसी समूह और एआर समूह में सीडी 226-पॉजिटिव आईएलसी 2 एस और सीडी 226 की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का अनुपात। मान एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। दोनों समूहों के बीच तुलना के लिए छात्र का टी-टेस्ट किया गया था। पी < 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रोग-प्रतिकारक फ्लोरोक्रोम क्लोन तनूकरण
CD11b एफआईटीसी M1/70 1:100
CD11c एफआईटीसी N418 1:200
CD226 पीई / 10E5 1:50
CD3e एफआईटीसी 145-2C11 1:100
CD45 एलेक्सा फ्लोर 700 30-F11 1:200
CD45R(B220) एफआईटीसी RA3-6B2 1:100
CD90.2 पीई 30-H12 1:100
KLRG1 APC 2F1 1:160

तालिका 1: सतह धुंधला एंटीबॉडी कॉकटेल।

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Discussion

आईएलसी 2 टाइप 2 सूजन और सूजन संबंधी विकारों के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं, जैसा कि अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चलता है। माउस मॉडल और मानव अवलोकन दोनों ऊपरी वायुमार्ग में इसके कार्य की बेहतर समझ में योगदान करते हैं। अस्थमा पैथोफिज़ियोलॉजी में, आईएलसी 2 को थाइमिक स्ट्रोमल लिम्फोपोइटिन, आईएल -25 और आईएल -33 के माध्यम से सक्रिय किया जाता है, जो ज्यादातर उपकला कोशिकाओं द्वारा निर्मित होते हैं। फिर टीएच 2 कोशिकाओं को प्रतिबिंबित करते हुए, आईएलसी 2 टाइप 2 सूजन32 को बढ़ाने के लिए आईएल -4, आईएल -5 और आईएल -13 का उत्पादन करते हैं। इसके अलावा, आईएलसी 2 के विभिन्न उपसमुच्चय भी आईएल -10 और आईएल -1733,34,35 का उत्पादन करते हैं। एआर भी टाइप 2 कोशिकाओं द्वारा संचालित वायुमार्ग एलर्जी सूजन का एक प्रकार है। एआर पैथोफिज़ियोलॉजी में आईएलसी 2 की भागीदारी हाल ही मेंप्रदर्शित की गई है। हालांकि, एआर के तहत आईएलसी 2 के संभावित नियामक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं।

साक्ष्य इंगित करता है कि विभिन्न आईएलसी 2 के बीच बातचीत सतह के अणुओं36 पर निर्भर हो सकती है। उदाहरण के लिए, आईएलसी 2 पर व्यक्त आईसीओएस और आईसीओएस-लिगेंड दोनों उनके अस्तित्वऔर कार्यों के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, आईएलसी 2 भी आईसीएएम -1 और एलएफए -1 को व्यक्त करते हैं, जो सेल माइग्रेशन और सेल-सेल इंटरैक्शन 7,38 पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालते हैं। इसके अलावा, आईएलसी 2 इन सेल-सतह अणुओं के माध्यम से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ क्रॉसस्टॉक कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, ओएक्स 40 एल फेफड़ों की सूजन में सीडी 4 + टी कोशिकाओं और आईएलसी 2 के बीच बातचीत के लिए एक प्रमुख मध्यस्थहै। क्योंकि सीडी 226, एक ट्रांसमेम्ब्रेन कोस्टिमुलेटरी अणु के रूप में, विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर व्यक्त करता है, हमने इस अध्ययन में स्वस्थ और एआर चूहों से नाक के ऊतकों में आईएलसी 2 पर इसकी अभिव्यक्ति का भी मूल्यांकन किया।

सामान्य ओवीए-प्रेरित एआर मॉडलिंग में इंट्रापरिटोनियल प्रणालीगत संवेदीकरण और इंट्रानेसल स्थानीय उत्तेजना शामिल है, जिसे आमतौर पर संतोषजनकमॉडलिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए कम से कम 3-4 सप्ताह की आवश्यकता होती है। एक अन्य ओवीए-प्रेरित नाक-केवल वितरण एआर मॉडल टाइप 2 सूजन और एआर लक्षणों40 के अनुमानित स्तर को प्राप्त करने के लिए सामान्य मॉडल विधि के समान समय लेता है। हालांकि, इन दो एआर मॉडलिंग विधियों द्वारा नाक आईएलसी 2 की संख्या और कार्य को अभी भी आगे के शोध की आवश्यकता है। हमने एआर लक्षणों का मूल्यांकन करने के लिए छींकने और नाक रगड़ने का आकलन किया। यद्यपि राइनोरिया के लिए मूल्यांकन को शामिल करना अधिक विश्वसनीय होगा, हमने पाया कि मूल्यांकन के दौरान चूहों के व्यवहार में हस्तक्षेप किए बिना राइनोरिया की दृष्टि को पकड़ना मुश्किल है, इसलिए हमने अफसोस के साथ इन मानदंडों को बाहर रखा। इसके अलावा, छींकने और नाक रगड़ने के लिए मूल्यांकन कई प्रासंगिक लेखों के लिए मुराइन एआर लक्षणों की गंभीरता को चित्रित करने के लिए पर्याप्त गहरा हो सकता है जो केवल इन दो मानदंडों41,42,43 को नियोजित करते हैं।

चूहों के नाक आईएलसी 2 के बारे में पिछले अध्ययनों ने मुराइन नाक म्यूकोसा44,45 के अलगाव का वर्णन किया है। उनका प्रोटोकॉल इस प्रकार है: संक्षेप में, खोपड़ी के चारों ओर नरम ऊतक को हटा दें, नाक गुहा को उजागर करने के लिए नाक की हड्डी खोलें, और बल के साथ खोपड़ी की सतह से नाक के श्लैष्मिक ऊतक को खुरचें। जबकि अधिकांश पृथक म्यूकोसा का उपयोग आईएफ, आईएचसी, या क्यूपीसीआर के लिए किया गया था, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) और एफसीएम विश्लेषण के निम्नलिखित अलगाव के बारे में बहुत कम बताया गया है। इस अध्ययन में, नाक के श्लेष्म में स्थित आईएलसी 2 की कम मात्रा को ध्यान में रखते हुए, ऑपरेशन ने नाक की हड्डी की सतह से म्यूकोसा को अलग करने के बजाय पूरी नाक को पचाकर नाक के श्लेष्म की अधिकतम मात्रा को बनाए रखा। पाचन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए, हमने तीन डाइजेस्ट मीडिया का मूल्यांकन किया: कोलेजनेज IV के 0.5 मिलीग्राम / एमएल, कोलेजनेस IV के 1 मिलीग्राम / एमएल, और कोलेजनेस IV के 1 मिलीग्राम / एमएल और 10 यू / एमएल डीएनएस आई, और इन तीन डाइजेस्ट मीडिया द्वारा प्राप्त जीवित कोशिकाओं और लिम्फोसाइट आवृत्ति के प्रतिशत की तुलना की। सभी तीन मीडिया द्वारा अधिग्रहित जीवित कोशिकाओं के अनुपात में कोई अंतर नहीं है (90% -95%); हालांकि, पहले दो प्रकार के पाचन कम लिम्फोसाइट आवृत्ति (~ 5%) के साथ अपर्याप्त थे। इस प्रकार, इस अध्ययन में 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस IV और 10 यू / एमएल डीनेस I को डाइजेस्ट मीडिया के रूप में चुना गया था। हालांकि, अन्य एंजाइम जैसे कि लिबेरेस और डिस्पेस जो कोलेजनेज को प्रतिस्थापित कर सकते हैं, का अध्ययन नहीं किया गया है। चूंकि सेल व्यवहार्यता और सेल-सतह अणु अभिव्यक्ति46,47 के लिए एंजाइमों का प्रकार और एकाग्रता महत्वपूर्ण है, इसलिए नाक के पाचन के दौरान इन विकल्पों के उपयोग और खुराक को अभी भी सावधानीपूर्वक अन्वेषण और अनुकूलन की आवश्यकता है। हमने सेल व्यवहार्यता की जांच करने के लिए एफवीडी ईफ्लुर 520 का उपयोग किया, क्योंकि इसे 530/30 बैंड पास फिल्टर का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है जो एफआईटीसी के बराबर है, इसलिए हम लिन-कोशिकाओं को गेट करते समय मृत कोशिकाओं को बाहर कर सकते हैं। विशिष्ट एंटीबॉडी पैनलों के अनुसार अन्य सेल व्यवहार्यता रंजक भी वैकल्पिक हैं। इसके अलावा, प्रतिलेखन कारकों GATA3 के इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के बजाय, जो आमतौर पर अन्य ILC2-संबंधित अध्ययनों में किया जाता है, वर्तमान अध्ययन में ILC2 को सेल-सतह मार्करों जैसे Lin (CD11b, CD11c, CD3, और B220), CD45, CD90.2 और KLRG1 के आधार पर एफसीएम विश्लेषण में चित्रित किया गया था। उनमें से, आईएलसी 2 एस पर व्यक्त केएलआरजी 1 को परिपक्व ऊतक आईएलसी 2 एस48,49 के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में पहचाना गया है। यद्यपि CD90.2 कम विशिष्ट है, फिर भी इसे ILC2 से जुड़े सतह मार्कर50 के रूप में स्वीकार किया जाता है। इस अध्ययन में, चूहों को सेक्स से अलग नहीं किया गया था। अनुसंधान से पता चला है कि चूहों में फुफ्फुसीय आईएलसी की बहुतायत और सेल-सतह एंटीजन लिंग में भिन्न हैं, लेकिन लिंग के साथ नाक आईएलसी 2 के सहसंबंधका अभी भी अध्ययन करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल ने अन्य हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के अनुपात पर ध्यान केंद्रित नहीं किया। विभिन्न एफसीएम एंटीबॉडी पैनल इस मुद्दे को हल करने में मदद करेंगे।

इस प्रोटोकॉल ने मुराइन नाक म्यूकोसा से आईएलसी 2 को अलग करने की एक विधि का वर्णन किया। पृथक आईएलसी 2 को एफसीएम लक्षण वर्णन के लिए दाग दिया जा सकता है, सेल कल्चर के लिए क्रमबद्ध किया जा सकता है, या आगे के विश्लेषण के लिए विट्रो में उत्तेजित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों 10,45,51 के निष्कर्षों के अनुरूप, एआर चूहों के नाक के श्लेष्म में आईएलसी 2 का पर्याप्त संचय देखा गया था। विशेष रूप से, सीडी 226 को स्थानीय आईएलसी 2 पर व्यक्त किया गया था, और एलर्जी की स्थिति में इसका स्तर काफी बढ़ गया था। इसलिए, इस अध्ययन के निष्कर्ष आईएलसी 2-निर्भर एआर में सीडी 226 की भागीदारी का सुझाव देते हैं। क्या एआर एक्सप्रेस सीडी 226 वाले रोगियों में आईएलसी 2 एस और क्या एलर्जी की स्थिति में आईएलसी 2 पर सीडी 226 अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, भविष्य के अध्ययनों में जांच की जानी चाहिए।

अंत में, हमने नाक के श्लेष्म से आईएलसी 2 को अलग करने और पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया और उनके भीतर आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति का पता लगाया। प्रोटोकॉल को और अनुकूलन की आवश्यकता है; हालांकि, अध्ययनों की कमी जो लिम्फोसाइटों को अलग करने और चिह्नित करने की प्रक्रिया का व्यवस्थित और सूक्ष्म रूप से वर्णन करती है, विशेष रूप से नाक के श्लेष्म में जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाएं, इस प्रोटोकॉल को स्थानीय नाक प्रतिरक्षात्मक वातावरण की खोज करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक प्रारंभिक संदर्भ बनाती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

आरजेड को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81871258) और चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय (संख्या 2020 rcfczr) द्वारा प्रदान किए गए धन द्वारा समर्थित किया गया था। वाईजेड को शांक्सी के प्राकृतिक विज्ञान बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (संख्या 2021जेएम -081) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum hydroxide Meilun biological Technology 21645-51-2
CD11b eBioscience 11-0112-82 Used in antibody coctail
CD11c BioLegend 117306 Used in antibody coctail
CD16/32 BioLegend 101302 Clone: 93; Dilution 1:100
CD226 BioLegend 128812 Used in antibody coctail
CD3e BioLegend 100306 Used in antibody coctail
CD45 BioLegend 103128 Used in antibody coctail
CD45R eBioscience 11-0452-82 Used in antibody coctail
CD90.2 BD Pharmingen 553014 Used in antibody coctail
Collagenase IV DIYIBio DY40128
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950 absolute counting beads
Dnase Equation 1 Beyotime D7076
Fetal Bovine Serum gibco 10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) eBioscience 65-0867-14 FVD
HBSS, calcium, magnesium Servicebio G4204-500
KLRG1 eBioscience 17-5893-81 Used in antibody coctail
NaN3 SIGMA S2002
NovoExpress software AgilentTechnologies Version 1.5.0 flow cytometry (FCM) analysis software
OVA SIGMA 9006-59-1
PBS, 1x Servicebio G4202-500
PBS, 10x Servicebio G4207-500
Percoll Yeasen 40501ES60 density gradient media
RPMI 1640 culture media Corning 10-040-CVRV
Spectral cell analyzer SONY SA3800

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इस महीने JoVE में अंक 183
सीडी 226 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए माउस नाक म्यूकोसा से समूह 2 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं का अलगाव
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Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang,… More

Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang, Y., Cheng, K., Zhuang, R., Bian, K. Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226. J. Vis. Exp. (183), e63525, doi:10.3791/63525 (2022).

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