Summary
Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die an Typ-2-Entzündungen beteiligt sind, sind hauptsächlich an der Reaktion auf Helmintheninfektionen, allergische Erkrankungen, metabolische Homöostase und Gewebereparatur beteiligt. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung von ILC2s aus der murinen Nasenschleimhaut und zum Nachweis der Expression von CD226 demonstriert.
Abstract
Mit zahlreichen Forschungsarbeiten zu angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die im Laufe der Jahre veröffentlicht wurden, ist weithin bekannt, dass ILC2 an der Regulierung verschiedener pathologischer Prozesse beteiligt ist, darunter Anti-Helminthen-Immunität, Gewebereparatur, Thermogenese und Autoimmunerkrankungen wie Asthma und allergische Rhinitis (AR). ILC2 befinden sich dauerhaft in peripheren Geweben wie Haut, Darm, Lunge und Nasenhöhle. Es gibt jedoch nur begrenzte Informationen über ihre genaue Funktion in der Immunität der Nasenschleimhaut. CD226 ist ein aktivierendes kostimulatorisches Molekül, das hauptsächlich auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), T-Zellen und entzündlichen Monozyten exprimiert wird. Es ist jedoch nicht bekannt, ob ILC2 CD226 exprimieren oder eine Rolle in der Pathogenese von ILC2s-assoziierten Erkrankungen spielen. In dieser Arbeit etablierten wir eine Methode zur Isolierung und Identifizierung von ILC2 aus der Nasenschleimhaut und wiesen die CD226-Expression auf ILC2 von gesunden und AR-Mäusen nach. In dieser Arbeit beschreiben wir dieses Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von ILC2s aus der Nasenschleimhaut von Mäusen, das dazu beitragen wird, den internen pathologischen Mechanismus immunologischer Erkrankungen bei Erkrankungen der Nasenschleimhaut zu erforschen.
Introduction
Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2) wurden zuerst im Gewebe der Peritonealhöhle von Mäusen entdeckt und später im Blut und anderen peripheren Geweben wie Lunge, Haut und Nasenhöhle nachgewiesen 1,2,3. Als geweberesidente Zellen werden ILC2s hauptsächlich lokal aufrechterhalten und vermehrt und fungieren als erste Wächter, die auf exogene schädliche Reize reagieren, indem sie zahlreiche Typ-2-Zytokine produzieren und Typ-2-Immunität induzieren 4,5,6. ILC2 können ihre Wirkung auch entfalten, indem sie in das infizierte Gewebe eindringen 7,8.
Ähnlich wie bei T-Helfer-2-Zellen (Th2) sorgen die komplizierten regulatorischen Netzwerke von ILC2 dafür, dass sie maßgeblich am Fortschreiten verschiedener entzündlicher Typ-2-Erkrankungen, einschließlich allergischer Atemwegserkrankungen, beteiligt sind 8,9. Bei Asthma können aus Epithelzellen stammende Alarmine ILC2s aktivieren, die durch die Sekretion von Interleukin (IL)-4, IL-5 und IL-13 die Lungenentzündung weiter fördern10. Klinische Studien haben auch gezeigt, dass die ILC2-Spiegel im Sputum und im Blut von Patienten mit schwerem Asthma signifikant erhöht waren, was auf einen Zusammenhang von ILC2 mit dem Schweregrad des Asthmas und ihrer Funktion als Prädiktor für das Fortschreiten des Asthmas hindeutet11.
Allergische Rhinitis (AR) ist eine häufige chronisch-entzündliche Erkrankung, von der jährlich Millionen von Menschen betroffen sind, und wirksame Behandlungen für diese Krankheit sindbegrenzt 12,13. ILC2 spielen eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der AR, sei es in der Sensibilisierungsphase oder in der Symptomentstehung und Entzündungsphase14. Bei Patienten mit AR wurde berichtet, dass die ILC2-Spiegel im peripheren Blut sowohl lokal als auch systemisch erhöht sind15. Bestimmte Effekte und die zugrunde liegenden Mechanismen von ILC2 auf die Pathophysiologie und Progression von AR müssen jedoch noch weiter erforscht werden.
CD226 - ein Transmembranglykoprotein, das als kostimulatorisches Molekül dient - wird hauptsächlich auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), T-Zellen und anderen entzündlichen Monozyten exprimiert16,17. Die Interaktion von CD226 mit seinen Liganden (CD155 und/oder CD112) oder Konkurrenten (TIGIT) ermöglicht es ihm, an den biologischen Funktionen verschiedener Immunzellen teilzunehmen18. Die Bindung der Liganden auf antigenpräsentierenden Zellen an CD226 auf zytotoxischen Lymphozyten (CTL) fördert die gleichzeitige Aktivierung beider Zellen, während die Aktivierung von CTL durch TIGIT (T-Zell-Immunrezeptor mit Ig- und ITIM-Domänen), dem Konkurrenten von CD226, weiter unterdrücktwerden kann 19,20. Eine humane ex vivo Studie zeigte, dass CD226 und CD155 auf T-Zellen das Gleichgewicht zwischen Th1/Th17 und Th2 durch differentielle Modulation von Th-Subpopulationenregulieren 21. CD226 kann ebenfalls die Thrombozytenadhäsion und die NK-tumorabtötende Aktivität vermitteln22,23. Inzwischen ist CD226 in der Pathogenese verschiedener Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und Tumoren gut untersucht 18,24,25. CD226 hat sich derzeit zu einem neuen Lichtblick für die Immuntherapie entwickelt. Studien haben gezeigt, dass extrazelluläre Vesikel die CD226-Expression auf NK-Zellen umkehren können, um ihre zytotoxische Aktivität wiederherzustellen und in das Fortschreiten von Lungenkrebs einzugreifen26. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung27 eine Untergruppe von fetalen intestinalen ILCs der Gruppe 3 aufgedeckt, die durch eine hohe CD226-Expression gekennzeichnet sind, was darauf hindeutet, dass CD226 eine Rolle in der angeborenen lymphatischen Zell-vermittelten Immunität spielen könnte.
Unser Wissen über ILC2 bei Atemwegsentzündungen basiert in erster Linie auf Studien zu Asthma; Über ihre Funktionen bei der Immunität der Nasenschleimhaut ist jedoch wenig bekannt. Daher wurde ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von ILC2 aus der Nasenschleimhaut etabliert. Die Studie konzentriert sich auf die Expression von CD226 auf ILC2s im Nasengewebe und seine Variation zwischen gesunden und AR-Mäusen. Dies könnte neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der ILC2-vermittelten Regulation in der lokalen Immunität liefern und als Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze für die AR-Behandlung dienen.
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Protocol
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Verfahren und Protokolle wurden von der Ethikkommission für wissenschaftliche Forschung der Vierten Militärmedizinischen Universität (Nr. 20211008) genehmigt.
1. Etablierung des murinen AR-Modells
- Unterbringe männliche und weibliche Wildtyp-Mäuse (WT) C57BL/6 im Alter von 8-12 Wochen unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen und stelle Standard-Laborfutter und Wasser zur Verfügung.
- Emulgieren Sie 50 μg Ovalbumin (OVA) in 0,2 ml sterilem PBS, das 2 mg Aluminiumhydroxid enthält, auf einer sauberen Bank, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. An den Tagen 0, 7 und 14 werden weiblichen oder männlichen Mäusen jeweils 50 μg emulgierte OVA intraperitoneal injiziert.
- An den Tagen 21, 22, 23, 24 und 25 wurden Mäuse mit 50 μg OVA, gelöst in 30 μl sterilem PBS (15 μl pro Nasenloch) unter Inhalationsanästhesie (2-3 % Isofluran mit einer Sauerstoffflussrate oder 0,5 l/min) intranasal instilliert.
- Euthanasieren Sie die Mäuse 24 Stunden nach der letzten Herausforderung (Tag 26).
2. Isolierung von mononukleären Zellen (MNCs) aus der Nasenschleimhaut
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation unter tiefer Betäubung. Weichen Sie die Mäuse 5 Minuten lang mit 75%igem Ethanol ein und vermeiden Sie, dass Ethanol in das äußere Nasenloch gelangt. Legen Sie den Bauch nach unten auf den Operationstisch.
- Schneiden Sie die Vorderzähne ab. Machen Sie an der Mittellinie des Kopfes einen Schnitt und schneiden Sie die Haut mit einer Schere auf.
- Entfernen Sie den Unterkiefer, schneiden Sie die gesamte Nase am Ende des Gaumens ab und legen Sie das Gewebe in eine 60-mm-Petrischale mit 5 ml eiskaltem PBS. Entfernen Sie mit Schere und Pinzette das Fleisch und die Muskeln, die an den Knochen haften.
- Setzen Sie die Mausnase in eine neue 60-mm-Petrischale mit 5 ml eiskaltem PBS um. Waschen Sie die Knochen zweimal mit 5 ml eiskaltem PBS.
- Übertragen Sie die Nase in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Die Nase wird ausreichend zerschlagen und in ein 15-ml-Röhrchen mit 2 ml vorgewärmtem Aufschlusspuffer (RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 1 mg/ml Kollagenase i.v. und 10 U/ml DNase I) überführt.
- Befestigen Sie den Deckel und legen Sie das Röhrchen senkrecht in einen Orbitalschüttler bei 37 °C, mit kontinuierlichem Rühren bei 120-150 U/min für 40 Minuten.
HINWEIS: Erwärmen Sie den Aufschlusspuffer auf 37 °C, um die höchste Enzymaktivität zu erreichen. - Fügen Sie 5 ml eiskaltes RPMI 1640-Medium hinzu, das 10 % fötales Kälberserum (FBS) enthält, um den Verdauungsprozess zu stoppen.
- Filtern Sie durch ein 70-μm-Zellsieb, um feste Fragmente zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 500 x g und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand.
- Das Pellet in eiskaltem RPMI 1640 medium resuspendieren und 5 min bei 500 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml 40%igem Gradientenmedium (160 μl 10x PBS + 1,44 ml Dichtegradientenmedien-Stammlösung + 2,4 ml RPMI 1640-Medium).
- Führen Sie vorsichtig eine Pasteurpipette in den Boden des Röhrchens ein und fügen Sie langsam 2,5 ml Gradientenmedien mit 80 % Dichte hinzu (200 μl 10x PBS + 1,8 ml Dichtegradientenmedien-Stammlösung + 0,5 ml RPMI 1640-Medium).
- Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsrate der Zentrifuge niedriger als den dritten Gang ein und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 400 x g .
- Entfernen Sie die oberste Schicht von Verunreinigungen, bevor Sie die Zellen an der Grenzfläche entleeren, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Die Schicht der mononukleären Zellen (MNCs) an der Grenzfläche des Dichtegradientenmediums mit 40 %/80 % wird vorsichtig mit einer Pipette in ein 15-ml-Röhrchen mit 2 ml eiskaltem PBS entleert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.
3. Oberflächenfärbung für die FCM-Analyse
- Die Zellen entnehmen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Das Zellpellet wird in Färbepuffer (PBS ergänzt mit 2 % FBS und 0,1 %NaN3) resuspendiert und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand.
ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Färbepuffer vorbereiten. NaN3 ist sehr giftig und kann Organe schädigen, wenn es verschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Vermeiden Sie auch die Freisetzung in die Umwelt. - Resuspendieren Sie die Zellen in 80 μL Blockierlösung (Anti-CD16/32-Antikörper (1:100) verdünnt in Färbepuffer) pro Röhrchen. 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
- Ohne Waschen 20 μl der entsprechenden Verdünnung des oberflächenfärbenden Antikörpercocktails zugeben (Tabelle 1).
- Fügen Sie 1 μl (pro Test) des fixierbaren Viabilitätsfarbstoffs 520 (FVD) hinzu, kurz bevor Sie den Antikörpercocktail zu den Proben geben. Im Dunkeln bei 4 °C für 30 min inkubieren. Legen Sie passende Isotyp-Antikörper und Fluoreszenz-Minus-Eins (FMO) als Negativkontrollen fest.
- Waschen Sie die Zellen in 500 μl Färbepuffer, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 x g zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Färbepuffer. Geben Sie 50 μl vortexed absolute Zählkügelchen zu den gefärbten Zellen und rühren Sie um. Unterziehen Sie sie einer Durchflusszytometrie (FCM).
HINWEIS: Die FCM-Daten wurden mit einem spektralen Zellanalysator ermittelt und mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware (FCM) analysiert.
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Representative Results
Ein OVA-induziertes Mausmodell wurde entwickelt, um die Rolle von ILC2s in AR zu untersuchen. Die Konstruktion des AR-Mausmodells basierte auf früheren Studien mit leichten Modifikationen 28,29,30,31. Ein 10-minütiges Video wurde aufgenommen, um die Häufigkeit des Niesens und des Nasenkratzens nach der letzten nasalen Herausforderung zu messen. Die allergischen Symptome der OVA-induzierten AR-Mäuse wurden in Abbildung 1 dargestellt. Die Häufigkeit von Nasenreiben und Niesen war bei den AR-Mäusen signifikant höher als bei der Kontrollgruppe.
Als nächstes haben wir ein Verfahren beschrieben, um MNCs aus der murinen Nasenschleimhaut zu isolieren und ihre Charakterisierung mittels FCM-Analyse durchzuführen. Aus jeder Mausnase wurden etwa 2-3 x 106 Lymphozyten gewonnen. Die toten Zellen wurden durch FVD-Färbung ausgeschlossen. Die Gating-Strategie für ILC2s unter den isolierten Zellen war Lin (CD11b, CD11c, CD3 und B220)− CD45+ CD90.2+ KLRG1+ Zellen. Alle Gatter wurden auf der Grundlage einer Isotyp- oder FMO-Kontrolle gezeichnet. Typischerweise wurden ~2%-3% der Lin−CD45+-Zellen in der Nasenschleimhaut gesunder Kontrollmäuse identifiziert (Abbildung 2). Die absolute Anzahl von ILC2 in der murinen Nasenschleimhaut variiert zwischen 2.000 und 4.000.
Anschließend isolierten wir die ILC2s aus den AR-Mäusen mit der oben beschriebenen Methode. Es gab keinen Unterschied in der absoluten Anzahl der Lymphozyten zwischen HC- und AR-Mäusen. Die FCM-Ergebnisse zeigten, dass der Anteil der ILC2 in den AR-Mäusen 9%-14% der Gesamtzahl der Lin−CD45+-Lymphozyten betrug, was auf einen bemerkenswerten Anstieg der Anzahl von ILC2s in der AR-Nasenschleimhaut im Vergleich zu gesunden Kontrollmäusen hindeutet (Abbildung 3).
Wir konnten die Expression von CD226 auf den ILC2s nachweisen. Im Durchschnitt exprimierten 51,9 % der ILC2 CD226 unter nicht immunisierten Bedingungen, während der durchschnittliche Anteil der ILC2, die CD226 exprimierten, bei den AR-Mäusen 54,8 % betrug, was eine nicht signifikante Tendenz zum Anstieg im Vergleich zu Kontrollmäusen zeigte. Zusätzlich zur Zellfrequenz wurde auch das Expressionsniveau von CD226 auf der Zelloberfläche anhand der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) bestimmt, die von der FCM-Analysesoftware automatisch berechnet wurde. Interessanterweise war der MFI von CD226 in den AR-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen signifikant hochreguliert (Abbildung 4), was auf eine erhöhte Expression von CD226 auf den ILC2s der allergischen Nasenschleimhaut hinweist.
Abbildung 1: OVA-induziertes murines AR-Modell . (A) Die schematische Darstellung der murinen AR-Modellierung. Die Häufigkeit des Nasenreibens (B) und Niesens (C) in einem Zeitraum von 10 Minuten. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) (n = 3) dargestellt. Für den Vergleich der beiden Gruppen wurde der Student's t-Test durchgeführt; P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: FCM-Gating-Strategie für ILC2s. Multinationale Unternehmen wurden wie oben beschrieben isoliert. (A) Die Dichtegrafik zeigt die Verteilung der isolierten MNCs entlang der FSC- und SSC-Achse. (B) Singlets wurden auf der Grundlage von FSC-Merkmalen geschlossen. (C) Lin−-Zellen wurden als CD11b-, CD11c-, CD3- und B220-negative Expression definiert, um die myeloiden Zellen, B-Zellen und T-Zellen in MNCs auszuschließen. (D) ILCs sind durch Lin− CD45+ charakterisiert. (E) ILC2s werden von CD90.2+ KLRG1+ unter den ILCs gegatet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: ILC2 in der Nasenschleimhaut von gesunden und AR-Mäusen. (A) Repräsentative FCM-Bilder veranschaulichen die Anteile von ILC2 unter ILCs aus der Nasenhöhlenschleimhaut gesunder Kontroll- (HC) und AR-Gruppen. (B) Die Anteile von ILC2 in Lin− CD45+ Zellen in HC- und AR-Gruppen. Die Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Der Schüler-t-Test wurde für einen Zwei-Gruppen-Vergleich durchgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: CD226-Expression in ILC2s der Nasenschleimhaut. ILC2s wurden mit der oben genannten Strategie charakterisiert. Die Expression von CD226 auf ILC2s wurde mittels FCM evaluiert. (A) Repräsentative Histogramme der CD226-Expression in HC- und AR-Gruppen; Der blaue Bereich stellt die CD226 FMO-Steuerung dar. (B,C) Die Anteile von CD226-positiven ILC2 und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD226 in der HC- und AR-Gruppe. Die Werte werden als Mittelwert ± SD (n = 3) ausgedrückt. Der t-Test der Schüler wurde zum Vergleich zwischen den beiden Gruppen durchgeführt. P < 0,05 wurde als signifikant eingestuft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Antikörper | Fluorochrom | Klonen | Verdünnung |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Cyanin7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabelle 1: Antikörper-Cocktail zur Oberflächenfärbung.
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Discussion
ILC2 stehen in engem Zusammenhang mit Typ-2-Entzündungen und entzündlichen Erkrankungen, wie eine zunehmende Zahl von Studien zeigt. Sowohl Mausmodelle als auch menschliche Beobachtungen tragen zu einem besseren Verständnis seiner Funktion in den oberen Atemwegen bei. In der Pathophysiologie des Asthmas werden ILC2s durch Thymusstroma-Lymphopoietin, IL-25 und IL-33 aktiviert, die hauptsächlich von Epithelzellen produziert werden. Umgekehrt produzieren ILC2s ILC2 IL-4, IL-5 und IL-13, um die Typ-2-Entzündung zu verschlimmern32. Darüber hinaus produzieren verschiedene Untergruppen von ILC2 auch IL-10 und IL-1733,34,35. AR ist auch eine Art von allergischer Entzündung der Atemwege, die von Typ-2-Zellen angetrieben wird. Die Beteiligung von ILC2 an der AR-Pathophysiologie wurde kürzlich nachgewiesen14. Die potentiellen Regulationsmechanismen von ILC2 unter AR sind jedoch noch weitgehend unbekannt.
Es gibt Hinweise darauf, dass die Wechselwirkung zwischen verschiedenen ILC2 auf den Oberflächenmolekülenberuhen kann 36. Zum Beispiel sind sowohl ICOS als auch ICOS-Liganden, die auf ILC2s exprimiert werden, für ihr Überleben und ihre Funktionen notwendig37. Darüber hinaus exprimieren ILC2s auch ICAM-1 und LFA-1, die wichtige Effekte auf die Zellmigration und die Zell-Zell-Interaktion ausüben 7,38. Darüber hinaus können ILC2s über diese Zelloberflächenmoleküle mit anderen Immunzellen kommunizieren. So ist OX40L ein dominanter Mediator für die Interaktion zwischen CD4+ T-Zellen und ILC2s bei Lungenentzündungen39. Da CD226 als transmembranes kostimulatorisches Molekül auf verschiedenen Immunzellen exprimiert wird, haben wir in dieser Studie auch seine Expression auf ILC2s im Nasengewebe von gesunden und AR-Mäusen untersucht.
Die allgemeine OVA-induzierte AR-Modellierung umfasst eine intraperitoneal systemische Sensibilisierung und eine intranasale lokale Stimulation, die in der Regel mindestens 3-4 Wochen benötigen, um zufriedenstellende Modellierungsergebnisse zu erzielen31. Ein anderes OVA-induziertes AR-Modell mit reiner nasaler Verabreichung benötigt ähnlich viel Zeit wie die allgemeine Modellmethode, um ein ungefähres Ausmaß an Typ-2-Entzündung und AR-Symptomen zu erreichen40. Die Anzahl und Funktion der nasalen ILC2 durch diese beiden AR-Modellierungsmethoden muss jedoch noch weiter erforscht werden. Wir bewerteten Niesen und Nasenreiben, um AR-Symptome zu bewerten. Obwohl es überzeugender wäre, die Bewertung für Rhinorrhoe einzubeziehen, fanden wir, dass es schwierig ist, die Rhinorrhoe zu sehen, ohne das Verhalten der Mäuse während der Bewertung zu beeinträchtigen, so dass wir diese Kriterien leider ausgeschlossen haben. Darüber hinaus könnte die Bewertung für Niesen und Nasenreiben tiefgreifend genug sein, um den Schweregrad der murinen AR-Symptome für viele der relevanten Artikel zu veranschaulichen, die nur diese beiden Kriterien verwendeten41,42,43.
Frühere Studien über nasale ILC2s von Mäusen haben die Isolierung der murinen Nasenschleimhautbeschrieben 44,45. Ihr Protokoll lautet wie folgt: Entfernen Sie kurz das Weichgewebe um den Schädel, öffnen Sie das Nasenbein, um die Nasenhöhle freizulegen, und kratzen Sie das Nasenschleimhautgewebe mit einer Pinzette von der Oberfläche des Schädels ab. Während der größte Teil der isolierten Mukosa für IF, IHC oder qPCR verwendet wurde, wird wenig über die anschließende Isolierung mononukleärer Zellen (MNCs) und die FCM-Analyse berichtet. In dieser Studie behielt die Operation angesichts der geringen Mengen an ILC2 in der Nasenschleimhaut das maximale Volumen der Nasenschleimhaut bei, indem die gesamte Nase verdaut wurde, anstatt die Schleimhaut von der Oberfläche des Nasenbeins zu entfernen. Um das Verdauungsprotokoll zu optimieren, untersuchten wir drei Verdauungsmedien: 0,5 mg/ml Kollagenase IV, 1 mg/ml Kollagenase IV und 1 mg/ml Kollagenase IV und 10 U/ml DNase I, und verglichen den Prozentsatz lebender Zellen und die Lymphozytenfrequenz, die von diesen drei Verdauungsmedien erhalten wurden. Der Anteil der lebenden Zellen, die von allen drei Medien aufgenommen werden, unterscheidet sich nicht (90%-95%); Die ersten beiden Arten der Verdauung waren jedoch unzureichend mit geringerer Lymphozytenfrequenz (~5%). So wurden in dieser Studie 1 mg/ml Kollagenase IV und 10 U/ml DNase I als Verdauungsmedien gewählt. Andere Enzyme wie Liberase und Dispase, die Kollagenase ersetzen könnten, wurden jedoch nicht untersucht. Da die Art und Konzentration von Enzymen entscheidend für die Lebensfähigkeit der Zellen und die Expression von Zelloberflächenmolekülen sind46,47, muss die Verwendung und Dosierung dieser Alternativen während der Nasenverdauung noch sorgfältig erforscht und optimiert werden. Wir haben FVD eFluor 520 verwendet, um die Viabilität der Zellen zu überprüfen, da es mit einem 530/30-Bandpassfilter detektiert werden kann, der dem FITC entspricht, so dass wir die toten Zellen beim Gating von Lin-Zellen ausschließen konnten. Andere Zellviabilitätsfarbstoffe sind je nach spezifischen Antikörper-Panels ebenfalls optional. Anstelle der intrazellulären Färbung des Transkriptionsfaktors GATA3, wie sie in anderen ILC2-bezogenen Studien üblich ist, wurden ILC2s in der vorliegenden Studie anhand von Zelloberflächenmarkern wie Lin (CD11b, CD11c, CD3 und B220), CD45, CD90.2 und KLRG1 in der FCM-Analyse charakterisiert. Unter ihnen wurde KLRG1, das auf ILC2s exprimiert wird, als spezifischer Marker für ILC2s im reifen Gewebe identifiziert48,49. Obwohl CD90.2 weniger spezifisch ist, wird es immer noch als ILC2-assoziierter Oberflächenmarkerakzeptiert 50. In dieser Studie wurden Mäuse nicht nach Geschlecht unterschieden. Die Forschung hat gezeigt, dass die Häufigkeit und die Zelloberflächenantigene von pulmonalen ILCs bei Mäusen unterschiedlich sind, aber die Korrelation von nasalen ILC2 mit dem Geschlecht muss noch untersucht werden50. Darüber hinaus konzentrierte sich das Protokoll nicht auf den Anteil anderer hämatopoetischer Zellen. Verschiedene FCM-Antikörper-Panels würden helfen, dieses Problem zu lösen.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von ILC2 aus der murinen Nasenschleimhaut. Die isolierten ILC2s können für die FCM-Charakterisierung gefärbt, für die Zellkultur sortiert oder in vitro für weitere Analysen stimuliert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorangegangenen Studien 10,45,51 wurde eine erhebliche Akkumulation von ILC2 in der Nasenschleimhaut von AR-Mäusen beobachtet. Bemerkenswert ist, dass CD226 auf lokalen ILC2-Stoffen exprimiert wurde und sein Spiegel bei allergischen Erkrankungen weiter signifikant anstieg. Die Ergebnisse dieser Studie deuten daher auf eine Beteiligung von CD226 an ILC2-abhängiger AR hin. Ob ILC2s bei Patienten mit AR CD226 exprimieren und ob die CD226-Expression auf ILC2s bei allergischen Erkrankungen zunimmt, sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.
Zusammenfassend haben wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von ILC2 aus der Nasenschleimhaut etabliert und die Expression von Adhäsionsmolekülen in ihnen nachgewiesen. Das Protokoll muss weiter optimiert werden. Das Fehlen von Studien, die das Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von Lymphozyten, insbesondere von angeborenen lymphatischen Zellen in der Nasenschleimhaut, systematisch und minutiös beschreiben, macht dieses Protokoll jedoch zu einer vorläufigen Referenz für Forscher, die die lokale immunologische Umgebung der Nase untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
R.Z. wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81871258) und Mitteln der Fourth Military Medical University (Nr. 2020rcfczr) unterstützt. Y.Z. wurde durch das Natural Science Basic Research Program von Shaanxi (Nr. 2021JM-081) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
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