Summary
Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2'er), der er impliceret i type 2-inflammation, deltager hovedsageligt som reaktion på helminthinfektion, allergiske sygdomme, metabolisk homeostase og vævsreparation. I denne undersøgelse demonstreres en procedure til isolering af ILC2'er fra murin næseslimhinde og detektering af ekspression af CD226.
Abstract
Med rigelig forskning på gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2'er) offentliggjort gennem årene er ILC2'er almindeligt kendt for at være impliceret i regulering af forskellige patologiske processer, herunder anti-helminth immunitet, vævsreparation, termogenese og autoimmune sygdomme som astma og allergisk rhinitis (AR). ILC2'er befinder sig permanent i perifert væv såsom hud, tarm, lunger og næsehule; Der er dog begrænset information om deres nøjagtige funktioner i nasal slimhindeimmunitet. CD226 er et aktiverende costimulatorisk molekyle, hovedsageligt udtrykt på naturlige dræberceller (NK), T-celler og inflammatoriske monocytter. Men om ILC2'er udtrykker CD226 eller spiller en rolle i patogenesen af ILC2s-relaterede sygdomme forbliver ukendt. Her etablerede vi en metode til at isolere og identificere ILC2'er fra næseslimhinden og detekterede CD226-ekspression på ILC2'er opnået fra raske mus og AR-mus. Heri beskriver vi denne protokol til isolering og identifikation af ILC2'er fra museslimhinden, som vil hjælpe med at udforske den interne patologiske mekanisme for immunologiske lidelser i næseslimhindesygdomme.
Introduction
Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2s) blev først opdaget i bughulevæv hos mus og blev efterfølgende påvist at være til stede i blodet og andre perifere væv såsom lunger, hud og næsehule 1,2,3. Som vævsresidente celler vedligeholdes og formeres ILC2'er hovedsageligt lokalt og fungerer som de første vagter, der reagerer på eksogene skadelige stimuli ved at producere adskillige type 2-cytokiner og inducere type 2-immunitet 4,5,6. ILC2'er kan også udøve deres virkninger ved handel mod det inficerede væv 7,8.
I lighed med T-hjælper 2 (Th2) celler sikrer de komplicerede regulatoriske netværk af ILC2'er deres betydelige involvering i udviklingen af forskellige type 2 inflammatoriske sygdomme, herunder luftvejsallergiske sygdomme 8,9. I astma kan epitelcelleafledte alarminer aktivere ILC2'er, som yderligere fremmer lungebetændelse gennem udskillelsen af interleukin (IL)-4, IL-5 og IL-1310. Kliniske undersøgelser har også vist, at ILC2-niveauer var signifikant forhøjede i spyt og blod hos patienter med svær astma, hvilket tyder på en sammenhæng mellem ILC2'er og astmaens sværhedsgrad og deres funktion som en forudsigelse for astmaprogression11.
Allergisk rhinitis (AR) er en almindelig kronisk inflammatorisk sygdom, der rammer millioner af mennesker årligt, og effektive behandlinger for denne sygdom er begrænset12,13. ILC2'er spiller afgørende roller i patofysiologien af AR, hvad enten det er i sensibiliseringsfasen eller symptomgenerering og inflammation fase14. Hos patienter med AR er niveauerne af ILC2 i det perifere blod rapporteret at være forhøjet både lokalt og systemisk15. Imidlertid kræver visse effekter og de underliggende mekanismer i ILC2'er på patofysiologien og progressionen af AR stadig yderligere udforskning.
CD226 - et transmembranglycoprotein, der tjener som et costimulatorisk molekyle - udtrykkes primært på naturlige dræberceller (NK), T-celler og andre inflammatoriske monocytter16,17. Interaktionen mellem CD226 og dens ligander (CD155 og/eller CD112) eller konkurrent (TIGIT) gør det muligt at deltage i de biologiske funktioner i forskellige immunceller18. Bindingen af liganderne på antigenpræsenterende celler til CD226 på cytotoksisk lymfocyt (CTL) fremmer aktiveringen af begge celler samtidigt, mens aktiveringen af CTL yderligere kan undertrykkes af TIGIT (T-celleimmunoreceptor med Ig- og ITIM-domæner), konkurrenten til CD22619,20. En human ex vivo-undersøgelse afslørede, at CD226 og CD155 på T-celler regulerer balancen mellem Th1 / Th17 og Th2 gennem differentielt modulerende Th-delmængder21. CD226 kan ligeledes mediere blodpladeadhæsion og NK-tumordræbende aktivitet22,23. I mellemtiden er CD226 godt undersøgt i patogenesen af forskellige infektionssygdomme, autoimmune sygdomme og tumorer 18,24,25. På nuværende tidspunkt er CD226 blevet et nyt lyspunkt for immunterapi. Undersøgelser har vist, at ekstracellulære vesikler kan vende CD226-ekspression på NK-celler for at genindføre deres cytotoksiske aktivitet og gribe ind i udviklingen af lungekræft26. En nylig undersøgelse har afsløret en underklynge af føtal tarmgruppe 3 ILC'er karakteriseret ved høj CD226-ekspression ved enkeltcelle RNA-sekventering27, hvilket indikerede, at CD226 kan udøve roller i den medfødte lymfoide cellemedierede immunitet.
Vores viden om ILC2s i luftvejsbetændelse er primært baseret på studier af astma; Imidlertid er der lidt kendt om deres funktioner i nasal slimhindeimmunitet. Således blev der etableret en protokol til at isolere og identificere ILC2'er fra næseslimhinden. Undersøgelsen fokuserer på ekspressionen af CD226 på ILC2'er i næsevæv og dens variation mellem raske og AR-mus. Dette kan give ny indsigt i de underliggende mekanismer for ILC2-medieret regulering i den lokale immunitet og tjene som grundlag for udvikling af nye tilgange til AR-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr. Alle procedurer og protokoller blev godkendt af den videnskabelige forskningsetiske komité for det fjerde militære medicinske universitet (nr. 20211008).
1. Murine AR model etablering
- Husmus C57BL/6 han- og hunmus i alderen 8-12 uger under specifikke patogenfrie forhold og giver standard laboratoriechow og vand.
- Emulgerer 50 μg ovalbumin (OVA) i 0,2 ml steril PBS indeholdende 2 mg aluminiumhydroxid på en ren bænk for at opretholde sterilitet. På dag 0, 7 og 14 injiceres hun- eller hanmus intraperitonealt med 50 μg hver af emulgerede OVA'er.
- På dag 21, 22, 23, 24 og 25 instrueres mus intranasalt med 50 μg OVA opløst i 30 μL steril PBS (15 μL pr. næsebor) under inhalationsanæstesi (2-3% isofluran med en iltstrømningshastighed eller 0,5 l / min).
- Aflive musene 24 timer efter den sidste udfordring (dag 26).
2. Isolering af mononukleære celler (MNC'er) fra næseslimhinden
- Aflive musene ved cervikal dislokation under dyb anæstesi. Blødgør musehovedet i 75% ethanol i 5 minutter og undgå, at ethanol kommer ind i det ydre næsebor. Placer maven nedad på operationsbordet.
- Skær fortænderne af. Ved hovedets midterlinje skal du lave et snit og skære huden op ved hjælp af en saks.
- Fjern underkæben, skær hele næsen af langs ganenden, og læg vævet i en 60 mm petriskål indeholdende 5 ml iskold PBS. Brug saks og tang til at fjerne kød og muskler, der klæber til knoglerne.
- Overfør musenæsen til en ny 60 mm petriskål indeholdende 5 ml iskold PBS. Vask knoglerne to gange med 5 ml iskold PBS.
- Overfør næsen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Knus næsen tilstrækkeligt og overfør den til et 15 ml rør indeholdende 2 ml forvarmet fordøjelsesbuffer (RPMI 1640 medium suppleret med 1 mg/ml collagenase IV og 10 E/ml DNase I).
- Låget fastgøres og anbringes røret lodret i en orbitalryster ved 37 °C under kontinuerlig omrøring ved 120-150 o/min i 40 minutter.
BEMÆRK: Forvarm fordøjelsesbufferen til 37 °C for at opnå den højeste enzymaktivitet. - Tilsæt 5 ml iskold RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) for at stoppe fordøjelsesprocessen.
- Filtrer gennem en 70 μm cellesil for at fjerne faste fragmenter.
- Der centrifugeres ved 500 x g i 5 min, hvorefter supernatanten forsigtigt kasseres.
- Resuspender pelleten i iskold RPMI 1640 medium og centrifuger ved 500 x g i 5 min. Supernatanten kasseres forsigtigt.
- Resuspender cellepellet i 4 ml 40% densitetsgradientmedier (160 μL 10x PBS + 1,44 ml densitetsgradientmedie stamopløsning + 2,4 ml RPMI 1640 medium).
- Indsæt forsigtigt en Pasteur-pipette i bunden af røret, og tilsæt langsomt 2,5 ml 80 % densitetsgradientmedier (200 μL 10x PBS + 1,8 ml densitetsgradientmedie stamopløsning + 0,5 ml RPMI 1640-medium).
- Indstil centrifugens accelerations- og decelerationshastighed lavere end det tredje gear, og centrifuger ved 400 x g i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fjern det øverste lag af urenheder, før du dræner cellerne ved grænsefladen for at undgå potentiel forurening. Lag af mononukleære celler (MNC'er) ved mediegrænsefladen med 40%/80% densitetsgradient drænes forsigtigt i et 15 ml rør indeholdende 2 ml iskold PBS ved hjælp af en pipette. Vask cellerne med iskold PBS to gange.
3. Overfladefarvning til FCM-analyse
- Cellerne høstes og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender cellepellet i farvningsbuffer (PBS suppleret med 2% FBS og 0,1%NaN3) og centrifuger ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres.
FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du forbereder farvningsbufferen. NaN3 er meget giftigt og kan forårsage organskader ved indtagelse, indånding eller hudkontakt. Undgå også udslip til miljøet. - Resuspender cellerne i 80 μL blokerende opløsning (anti-CD16/32 antistof (1:100) fortyndet i farvningsbuffer) pr. rør. Der inkuberes i 30 minutter i mørke ved 4 °C.
- Uden vask tilsættes 20 μL af den passende fortynding af den overfladefarvende antistofcocktail (tabel 1).
- Der tilsættes 1 μL (pr. test) fikserbart levedygtighedsfarvestof 520 (FVD), lige før antistofcocktailen tilsættes prøverne. Der inkuberes mørkt ved 4 °C i 30 minutter. Indstil matchende isotypeantistoffer og fluorescens minus en (FMO) som de negative kontroller.
- Cellerne vaskes i 500 μL farvningsbuffer ved centrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellepellet i 200 μL farvningsbuffer. Tilsæt 50 μL hvirvelformede absolutte tælleperler til de farvede celler og omrør. Udsæt dem for en flowcytometri (FCM) analyse.
BEMÆRK: FCM-data blev opnået ved hjælp af en spektralcelleanalysator og analyseret med flowcytometri (FCM) analysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En OVA-induceret murinmodel blev udviklet for at udforske ILC2's rolle i AR. Konstruktionen af AR murin model var baseret på tidligere undersøgelser med små ændringer 28,29,30,31. En 10 minutters video blev optaget for at måle hyppigheden af nysen og næseskrabning efter den sidste næseudfordring. Allergiske symptomer hos de OVA-inducerede AR-mus blev vist i figur 1. Hyppigheden af nasal gnidning og nysen i AR-musene var signifikant højere end i kontrolgruppen.
Dernæst beskrev vi en procedure til isolering af MNC'er fra murin næseslimhinde og udføre deres karakterisering ved hjælp af FCM-analyse. Ca. 2-3 x 106 lymfocytter blev opnået fra hver murine næse. De døde celler blev udelukket ved FVD-farvning. Gating strategien for ILC2s blandt de isolerede celler var Lin (CD11b, CD11c, CD3 og B220)-CD45+ CD90.2+ KLRG1+ celler. Alle porte blev tegnet baseret på isotype eller FMO-kontrol. Typisk blev ~ 2% -3% af Lin-CD45+ celler identificeret i næseslimhinden hos raske kontrolmus (figur 2). Det absolutte antal ILC2'er i murin næseslimhinde varierer fra 2.000-4.000.
Vi isolerede derefter ILC2'erne fra AR-musene ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode. Der var ingen forskel i det absolutte antal lymfocytter mellem HC- og AR-mus. FCM-resultaterne viste, at fraktionen af ILC2'er i AR-musene var 9% -14% af det samlede antal Lin-CD45+ lymfocytter, hvilket indikerer en bemærkelsesværdig stigning i antallet af ILC2'er i AR-næseslimhinden sammenlignet med antallet hos raske kontrolmus (figur 3).
Vi opdagede ekspressionen af CD226 på ILC2'erne. I gennemsnit udtrykte 51,9% af ILC2'erne CD226 under uimmuniserede forhold, mens det gennemsnitlige forhold mellem ILC2'er, der udtrykte CD226, var 54,8% hos AR-musene, hvilket viste en ikke-signifikant tendens til at stige sammenlignet med kontrolmus. Ud over cellefrekvensen blev celleoverfladeekspressionsniveauet for CD226 også bestemt ved hjælp af gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI), der automatisk blev beregnet af FCM-analysesoftware. Interessant nok blev MFI'en for CD226 signifikant opreguleret i AR-musene sammenlignet med kontrolmusene (figur 4), hvilket indikerer et forhøjet udtryk for CD226 på ILC2'erne i den allergiske næseslimhinde.
Figur 1: OVA-induceret murin AR-model . (A) Det skematiske diagram over etableringen af murine AR-modellen. Hyppigheden af nasal gnidning (B) og nysen (C) i en periode på 10 minutter. Værdier præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) (n = 3). Til sammenligning af de to grupper blev elevens t-test udført; P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: FCM gating-strategi for ILC2'er. MNC'er blev isoleret som beskrevet ovenfor. (A) Tæthedsgrafikken viser fordelingen af isolerede multinationale selskaber langs FSC- og SSC-akserne. (B) Singlets blev gated baseret på FSC-egenskaber. (C) Lin-celler blev defineret som CD11b, CD11c, CD3 og B220 negativ ekspression for at udelukke myeloide celler, B-celler og T-celler i MNC'er. Døde celler blev udelukket ved hjælp af fikserbart levedygtighedsfarvestof (FVD) farvning. (D) ILC'er er kendetegnet ved Lin-CD45+. (E) ILC2'er er lukket af CD90.2+ KLRG1+ blandt ILC'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: ILC2'er i næseslimhinden hos raske mus og AR-mus. (A) Repræsentative FCM-billeder illustrerer andelen af ILC2'er blandt ILC'er fra næsehulenes slimhinde i sunde kontrol- (HC) og AR-grupper. (B) Andelene af ILC2'er i Lin-CD45+ celler i HC- og AR-grupper. Værdier præsenteres som gennemsnittet ± SD (n = 3). Elevens t-test blev udført til en to-gruppe sammenligning. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: CD226-ekspression i næseslimhinden ILC2'er. ILC2'er blev karakteriseret ved hjælp af ovennævnte strategi. Ekspressionen af CD226 på ILC2'er blev evalueret ved hjælp af FCM. (A) Repræsentative histogrammer af CD226-ekspression i HC- og AR-grupper; blåt område repræsenterer CD226 FMO-kontrollen. (B,C) Proportionerne af CD226-positve ILC2'er og gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) af CD226 i HC-gruppen og AR-gruppen. Værdier udtrykkes som gennemsnittet ± SD (n = 3). Elevens t-test blev udført til sammenligning mellem de to grupper. P < 0,05 blev anset for signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antistof | Fluorochrom | Klon | Fortynding |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/cyanin7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90,2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabel 1: Overfladefarvning af antistofcocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ILC2'er er tæt forbundet med type 2-inflammation og inflammatoriske lidelser, som det fremgår af et stigende antal undersøgelser. Både musemodeller og menneskelig observation bidrager til en bedre forståelse af dens funktion i de øvre luftveje. I astmapatofysiologi aktiveres ILC2'er gennem thymisk stromal lymfopoietin, IL-25 og IL-33, som hovedsagelig produceres af epitelceller. Derefter spejler Th2-celler producerer ILC2'er IL-4, IL-5 og IL-13 for at forværre type 2-inflammation32. Desuden producerer forskellige undergrupper af ILC2'er også IL-10 og IL-1733,34,35. AR er også en type luftvejsallergisk betændelse drevet af type 2-celler. ILC2s deltagelse i AR-patofysiologi er blevet demonstreret for nylig14. Imidlertid forbliver de potentielle reguleringsmekanismer for ILC2'er under AR stort set ukendte.
Beviser tyder på, at interaktionen mellem forskellige ILC2'er kan stole på overflademolekylerne36. For eksempel er både ICOS og ICOS-ligander udtrykt på ILC2'er nødvendige for deres overlevelse og funktioner37. Derudover udtrykker ILC2'er også ICAM-1 og LFA-1, som udøver vigtige effekter på cellemigration og celle-celle-interaktion 7,38. Derudover kan ILC2'er krydstale med andre immunceller gennem disse celleoverflademolekyler. For eksempel er OX40L en dominerende mediator for interaktionen mellem CD4 + T-celler og ILC2'er i lungebetændelse39. Fordi CD226, som et transmembran costimulatorisk molekyle, udtrykker på forskellige immunceller, evaluerede vi også dets ekspression på ILC2'er i næsevæv fra raske og AR-mus i denne undersøgelse.
Generel OVA-induceret AR-modellering inkluderer intraperitonealt systemisk sensibilisering og intranasalt lokal stimulering, som normalt kræver mindst 3-4 uger for at opnå tilfredsstillende modelleringsresultater31. En anden OVA-induceret NASAL-only levering AR-model tager samme tid som den generelle modelmetode for at opnå et omtrentligt niveau af type 2-betændelse og AR-symptomer40. Antallet og funktionen af nasale ILC2'er ved disse to AR-modelleringsmetoder har dog stadig brug for yderligere forskning. Vi vurderede nysen og nasal gnidning for at evaluere AR-symptomer. Selvom det ville være mere overbevisende at inkludere vurderingen for rhinoré, fandt vi, at det er svært at få øje på rhinoré uden at forstyrre musens adfærd under evalueringen, så vi udelukkede desværre disse kriterier. Derudover kan evalueringen for nysen og nasal gnidning være dyb nok til at illustrere sværhedsgraden af murin AR-symptomer for mange af de relevante artikler, der kun anvendte disse to kriterier41,42,43.
Tidligere undersøgelser af mus nasal ILC2s har beskrevet isolering af murin næseslimhinde44,45. Deres protokol er som følger: Fjern kort blødt væv omkring kraniet, åbn næsebenet for at udsætte næsehulen, og skrab næseslimhindevævet af overfladen af kraniet med tang. Mens det meste af den isolerede slimhinde blev brugt til IF, IHC eller qPCR, rapporteres der kun lidt om følgende isolering af mononukleære celler (MNC'er) og FCM-analyse. I denne undersøgelse, i betragtning af de lave mængder ILC2'er placeret i næseslimhinden, bevarede operationen det maksimale volumen af næseslimhinden ved at fordøje hele næsen i stedet for at fjerne slimhinden fra overfladen af næsebenet. For at optimere fordøjelsesprotokollen evaluerede vi tre fordøjelsesmedier: 0,5 mg / ml collagenase IV, 1 mg / ml collagenase IV og 1 mg / ml collagenase IV og 10 U / ml DNase I og sammenlignede procentdelen af levende celler og lymfocytfrekvens opnået af disse tre fordøjelsesmedier. Andelen af levende celler erhvervet af alle tre medier har ingen forskel (90% -95%); De to første typer fordøjelse var imidlertid utilstrækkelige med lavere lymfocytfrekvens (~ 5%). Således blev 1 mg/ml collagenase IV og 10 E/ml DNase I valgt som fordøjelsesmedie i dette studie. Andre enzymer såsom liberase og dispase, der kan erstatte kollagenase, er imidlertid ikke undersøgt. Da typen og koncentrationen af enzymer er afgørende for cellelevedygtighed og celleoverflademolekyleekspression46,47, kræver brugen og doseringen af disse alternativer under næsens fordøjelse stadig omhyggelig udforskning og optimering. Vi brugte FVD eFluor 520 til at kontrollere cellelevedygtighed, fordi det kan detekteres ved hjælp af et 530/30-båndpasfilter, der svarer til FITC, så vi kunne udelukke de døde celler, mens vi lukkede Lin-celler. Andre cellelevedygtighedsfarvestoffer er også valgfri i henhold til specifikke antistofpaneler. I stedet for intracellulær farvning af transkriptionsfaktorer GATA3, som normalt udføres i andre ILC2-relaterede undersøgelser, blev ILC2'er i denne undersøgelse karakteriseret baseret på celleoverflademarkører såsom Lin (CD11b, CD11c, CD3 og B220), CD45, CD90.2 og KLRG1 i FCM-analyse. Blandt dem er KLRG1 udtrykt på ILC2'er blevet identificeret som en specifik markør for modent væv ILC2s48,49. Selvom CD90.2 er mindre specifik, accepteres den stadig som en ILC2-associeret overflademarkør50. I denne undersøgelse blev mus ikke skelnet efter køn. Forskning har vist, at overflod og celleoverfladeantigener af lunge-ILC'er hos mus er forskellige i køn, men sammenhængen mellem nasale ILC2'er og køn skal stadig undersøges50. Derudover fokuserede protokollen ikke på andelen af andre hæmatopoietiske celler. Forskellige FCM-antistofpaneler ville hjælpe med at løse dette problem.
Denne protokol beskrev en metode til at isolere ILC2'er fra murins næseslimhinde. De isolerede ILC2'er kan farves til FCM-karakterisering, sorteres for cellekultur eller stimuleres in vitro til yderligere analyser. I overensstemmelse med resultaterne af de tidligere undersøgelser 10,45,51 blev der observeret en betydelig ophobning af ILC2'er i næseslimhinden hos AR-mus. Især blev CD226 udtrykt på lokale ILC2'er, og dets niveau steg signifikant yderligere under allergiske tilstande. Derfor antyder resultaterne i denne undersøgelse involvering af CD226 i ILC2-afhængig AR. Hvorvidt ILC2'er hos patienter med AR express CD226, og om CD226-ekspressionen på ILC2'er øges i allergiske tilstande, bør undersøges i fremtidige undersøgelser.
Afslutningsvis etablerede vi en protokol til isolering og identifikation af ILC2'er fra næseslimhinden og detekterede ekspressionen af vedhæftningsmolekyler i dem. Protokollen kræver yderligere optimering; Manglen på undersøgelser, der systematisk og minutiøst beskriver proceduren til isolering og karakterisering af lymfocytter, især medfødte lymfoide celler i næseslimhinden, gør denne protokol til en foreløbig reference for forskere, der udforsker det lokale nasale immunologiske miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
RZ blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 81871258) og midler fra Fourth Military Medical University (nr. 2020rcfczr). Y.Z. blev støttet af Shaanxis naturvidenskabelige grundforskningsprogram (nr. 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
