Summary
제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.
Abstract
수년에 걸쳐 발표된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2)에 대한 풍부한 연구를 통해 ILC2는 항기생충 면역, 조직 복구, 열 발생 및 천식 및 알레르기 비염(AR)과 같은 자가면역 질환을 포함한 다양한 병리학적 과정을 조절하는 데 연루된 것으로 널리 알려져 있습니다. ILC2는 피부, 장, 폐 및 비강과 같은 말초 조직에 영구적으로 존재합니다. 그러나 비강 점막 면역의 정확한 기능에 대한 정보는 제한적입니다. CD226은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 염증성 단핵구에서 발현되는 활성화 공동자극 분자입니다. 그러나 ILC2가 CD226을 발현하는지 또는 ILC2s 관련 질병의 발병기전에서 역할을 하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 비강 점막에서 ILC2를 분리 및 식별하는 방법을 확립하고 건강한 AR 마우스에서 얻은 ILC2에서 CD226 발현을 검출했습니다. 여기에서 우리는 비강 점막 질환에서 면역 장애의 내부 병리학적 메커니즘을 탐색하는 데 도움이 될 마우스 비강 점막에서 ILC2s의 분리 및 식별을 위한 이 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 생쥐의 복강 조직에서 처음 발견되었고, 이후 혈액 및 폐, 피부 및 비강과 같은 다른 말초 조직에 존재하는 것으로 입증되었다 1,2,3. 조직 상주 세포로서 ILC2는 주로 국소적으로 유지 및 증식되며 수많은 제2형 사이토카인을 생성하고 제2형 면역을 유도하여 외인성 유해 자극에 반응하는 첫 번째 가드 역할을 합니다 4,5,6. ILC2는 또한 감염된 조직으로 인신매매를 함으로써 그 효과를 발휘할 수 있다 7,8.
T-헬퍼 2(Th2) 세포와 유사하게, ILC2의 복잡한 조절 네트워크는 기도 알레르기 질환을 포함한 다양한 제2형 염증성 질환의 진행에 중요한 관여를 보장합니다 8,9. 천식에서 상피세포 유래 알람민은 인터루킨(IL)-4, IL-5, IL-13의 분비를 통해 폐 염증을 촉진하는 ILC2를 활성화시킬 수 있다10. 임상 연구에서도 중증 천식 환자의 객담과 혈액에서 ILC2 수치가 유의하게 상승한 것으로 나타났으며, 이는 ILC2가 천식 중증도와 천식 진행의 예측 인자로서의 기능과 관련이 있음을 시사한다11.
알레르기성 비염(AR)은 매년 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 만성 염증성 질환이며, 이 질환에 대한 효과적인 치료법은 제한적이다12,13. ILC2는 감작 단계 또는 증상 생성 및 염증 단계14에서 AR의 병태생리학에서 중요한 역할을 합니다. AR 환자의 경우, 말초 혈액 내 ILC2 수치가 국소 및 전신적으로 상승하는 것으로 보고되었다15. 그러나 AR의 병태생리학 및 진행에 대한 ILC2의 특정 효과와 기본 메커니즘은 여전히 추가 탐색이 필요합니다.
CD226 - 공동자극 분자 역할을 하는 막횡단 당단백질 - 은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 기타 염증성 단핵구에서 발현됩니다16,17. CD226과 그의 리간드 (CD155 및/또는 CD112) 또는 경쟁자 (TIGIT)의 상호작용은 다양한 면역 세포의 생물학적 기능에 참여할 수 있게 한다18. 세포독성 림프구 (CTL) 상의 CD226에 대한 항원-제시 세포 상의 리간드의 결합은 두 세포의 동시 활성화를 촉진하는 반면, CTL의 활성화는 CD226의 경쟁자인 TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체)에 의해 추가로 억제될 수 있다19,20. 인간 생체 외 연구에 따르면 T 세포의 CD226 및 CD155는 차등 조절 Th 하위 집합21을 통해 Th1/Th17과 Th2 사이의 균형을 조절합니다. CD226은 마찬가지로 혈소판 부착 및 NK 종양 사멸 활성을 매개할 수 있다22,23. 한편, CD226은 다양한 감염성 질환, 자가면역질환 및 종양의 발병기전에서 잘 연구되어 있다 18,24,25. 현재 CD226은 면역 요법의 새로운 밝은 지점이되었습니다. 연구에 따르면 세포외 소포체는 NK 세포에서 CD226 발현을 역전시켜 세포독성 활성을 회복하고 폐암의 진행에 개입할 수 있다26. 최근 연구에서는 단일 세포 RNA 시퀀싱27에 의해 높은 CD226 발현을 특징으로 하는 태아 장 그룹 3 ILC의 하위 클러스터가 밝혀졌으며, 이는 CD226이 선천성 림프 세포 매개 면역에서 역할을 발휘할 수 있음을 나타냅니다.
기도 염증에서 ILC2에 대한 우리의 지식은 주로 천식에 대한 연구를 기반으로 합니다. 그러나 비강 점막 면역에서의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 비강 점막에서 ILC2를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜이 수립되었습니다. 이 연구는 비강 조직의 ILC2에 대한 CD226의 발현과 건강한 마우스와 AR 마우스 간의 변이에 초점을 맞춥니다. 이것은 국소 면역에서 ILC2 매개 조절의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 AR 치료를 위한 새로운 접근 방식을 개발하기 위한 기초가 될 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험은 실험동물의 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행하였다. 모든 절차와 프로토콜은 제 4 군 의과 대학 과학 연구 윤리위원회 (No. 20211008)의 승인을 받았습니다.
1. Murine AR 모델 구축
- 특정 병원체가 없는 조건에서 8-12주령의 수컷 및 암컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스를 기숙하고 표준 실험실 차우와 물을 제공합니다.
- 무균 상태를 유지하기 위해 깨끗한 벤치에서 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2mL의 멸균 PBS에 50μg의 오브알부민(OVA)을 유화합니다. 0일, 7일 및 14일에 암컷 또는 수컷 마우스에 각각 50μg의 유화된 OVA를 복강 주사합니다.
- 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 흡입 마취(산소 유량 또는 0.5L/min).
- 마지막 챌린지 후 24시간(26일째)에 마우스를 안락사시킵니다.
2. 코 점막에서 단핵 세포 (MNC)의 분리
- 깊은 마취 하에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다. 생쥐 머리를 75 % 에탄올에 5 분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧 구멍으로 들어 가지 않도록하십시오. 복부를 수술대에 아래쪽으로 놓습니다.
- 앞니를 잘라내십시오. 머리의 정중선을 절개하고 가위로 피부를 자릅니다.
- 아래턱을 제거하고 입천장 끝을 따라 코 전체를 잘라낸 다음 조직을 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 넣습니다. 가위와 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 살과 근육을 제거하십시오.
- 마우스 코를 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 새로운 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS 5mL로 뼈를 두 번 씻으십시오.
- 코를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 코를 충분히 부수고 2mL의 예열 소화 완충액(1mg/mL의 콜라게나제 IV 및 10U/mL DNase I이 보충된 RPMI 1640 배지)이 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 뚜껑을 덮고 튜브를 37°C의 오비탈 셰이커에 수직으로 놓고 120-150rpm에서 40분 동안 계속 교반합니다.
참고: 소화 완충액을 37°C로 예열하여 최고의 효소 활성을 달성하십시오. - 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지 5mL를 추가하여 소화 과정을 중지합니다.
- 70μm 셀 스트레이너를 통해 여과하여 고체 조각을 제거합니다.
- 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 부드럽게 버립니다.
- 펠릿을 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지에 다시 현탁하고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부드럽게 버립니다.
- 40% 밀도 구배 배지 4mL(10x PBS 160μL + 밀도 구배 배지 원액 1.44mL + RPMI 1640 배지 2.4mL)에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 부드럽게 삽입하고 80% 밀도 구배 배지 2.5mL(10x PBS 200μL + 밀도 구배 배지 원액 1.8mL + RPMI 1640 배지 0.5mL)를 천천히 추가합니다.
- 원심분리기의 가속 및 감속 속도를 3단 기어보다 낮게 설정하고 원심분리기를 400 x g 로 상온(RT)에서 15분 동안 조절한다.
- 잠재적인 오염을 방지하기 위해 계면에서 세포를 배출하기 전에 불순물의 최상층을 제거하십시오. 피펫을 사용하여 40%/80% 밀도 구배 배지 계면의 단핵 세포(MNC) 층을 2mL의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 15mL 튜브로 조심스럽게 배출합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
3. FCM 분석을 위한 표면 염색
- 세포를 수확하고, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 세포 펠렛을 염색 완충액(2% FBS 및 0.1%NaN3로 보충된 PBS)에 재현탁하고, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하였다. 상청액을 버리십시오.
주의 : 염색 완충액을 준비할 때 주의하십시오. NaN3는 매우 독성이 강하며 삼키거나 흡입하거나 피부에 접촉하면 장기에 손상을 줄 수 있습니다. 또한 환경으로의 방출을 피하십시오. - 튜브당 80μL 블로킹 용액(염색 완충액에 희석된 항-CD16/32 항체(1:100))에 세포를 재현탁합니다. 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
- 세척하지 않고 표면 염색 항체 칵테일의 적절한 희석액 20μL를 추가합니다(표 1).
- 항체 칵테일을 샘플에 추가하기 직전에 고정 가능한 생존도 염료 520(FVD) 1μL(테스트당)을 추가합니다. 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 일치하는 이소타입 항체와 형광 마이너스 1(FMO)을 음성 대조군으로 설정합니다.
- 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 500 μL의 염색 완충액으로 세포를 세척한다.
- 세포 펠릿을 200μL의 염색 완충액에 재현탁합니다. 50 μL의 vortexed absolute counting beads를 염색된 세포에 넣고 교반합니다. 유세포 분석(FCM) 분석을 실시합니다.
참고: FCM 데이터는 스펙트럼 세포 분석기를 사용하여 얻었고 유세포 분석(FCM) 분석 소프트웨어로 분석했습니다.
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Representative Results
AR에서 ILC2의 역할을 탐색하기 위해 OVA 유도 쥐 모델이 개발되었습니다. AR 쥐 모델의 구성은 약간의 수정 28,29,30,31을 가진 이전 연구를 기반으로 했습니다. 마지막 콧물 챌린지 후 재채기와 코 긁힘의 빈도를 측정하기 위해 10분 분량의 비디오를 캡처했습니다. OVA가 유도된 AR 마우스의 알러지 증상을 도 1에 나타내었다. AR 마우스에서 비강 마찰 및 재채기의 빈도는 대조군보다 유의하게 높았다.
다음으로, 쥐의 코 점막에서 MNC를 분리하고 FCM 분석을 사용하여 특성화를 수행하는 절차를 설명했습니다. 약 2-3 x 106개의 림프구가 각각의 쥐 코로부터 얻어졌다. 죽은 세포는 FVD 염색에 의해 배제되었다. 분리된 세포 중 ILC2에 대한 게이팅 전략은 Lin(CD11b, CD11c, CD3 및 B220)-CD45+ CD90.2+ KLRG1+ 세포였습니다. 모든 게이트는 등형 또는 FMO 제어를 기반으로 그려졌습니다. 일반적으로 Lin-CD45+ 세포의 ~2%-3%가 건강한 대조군 마우스의 비강 점막에서 확인되었습니다(그림 2). 쥐 비강 점막에서 ILC2의 절대 수는 2,000-4,000까지 다양합니다.
이어서, 전술한 방법을 사용하여 AR 마우스로부터 ILC2s를 분리하였다. HC와 AR 마우스 사이의 림프구의 절대 수에는 차이가 없었다. FCM 결과는 AR 마우스의 ILC2 비율이 Lin-CD45+ 림프구의 총 수의 9%-14%임을 나타내었으며, 이는 건강한 대조군 마우스에 비해 AR 비강 점막의 ILC2 수가 현저하게 증가했음을 나타냅니다(그림 3).
우리는 ILC2에서 CD226의 발현을 검출했습니다. 평균적으로, ILC2의 51.9%는 면역화되지 않은 조건 하에서 CD226을 발현한 반면, CD226을 발현하는 ILC2s의 평균 비율은 AR 마우스에서 54.8%였으며, 이는 대조군 마우스에서와 비교하여 유의하지 않은 증가 경향을 보였다. 세포 빈도 외에도 CD226의 세포 표면 발현 수준은 FCM 분석 소프트웨어에 의해 자동 계산된 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 결정되었습니다. 흥미롭게도, CD226의 MFI는 대조군 마우스와 비교하여 AR 마우스에서 유의하게 상향조절되었으며(도 4), 이는 알레르기성 코 점막의 ILC2s에 대한 CD226의 상승된 발현을 나타낸다.
그림 1: OVA 유도 쥐 AR 모델. (A) 쥐 AR 모델 구축의 개략도. 10분 동안 코를 문지르는 빈도(B)와 재채기(C). 값은 평균 ± 표준 편차(SD)(n = 3)로 표시됩니다. 두 그룹을 비교하기 위해 Student's t-test를 수행했습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ILC2를 위한 FCM 게이팅 전략. 다국적 기업은 전술한 바와 같이 분리하였다. (A) 밀도 그래픽은 FSC 및 SSC 축을 따라 분리된 MNC의 분포를 보여줍니다. (B) Singlets는 FSC 특성에 따라 게이팅되었습니다. (C) Lin- 세포는 다국적 기업에서 골수 세포, B 세포 및 T 세포를 배제하기 위해 CD11b, CD11c, CD3 및 B220 음성 발현으로 정의되었습니다. (D) ILC는 Lin-CD45+를 특징으로 합니다. (E) ILC2는 ILC 중 CD90.2+ KLRG1+에 의해 게이트됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 건강한 AR 마우스의 비강 점막에 있는 ILC2s. (A) 대표적인 FCM 이미지는 건강한 대조군(HC) 및 AR 그룹의 비강 점막에서 ILC 중 ILC2의 비율을 보여줍니다. (B) HC 및 AR 그룹의 Lin-CD45+ 세포에서 ILC2의 비율. 값은 평균 ± SD(n=3)로 표시됩니다. 두 그룹 비교를 위해 Student's t-test를 수행했습니다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 비강 점막 ILC2에서 CD226 발현. ILC2는 위에서 언급한 전략을 사용하여 특성화되었습니다. ILC2s 상의 CD226의 발현을 FCM을 사용하여 평가하였다. (a) HC 및 AR 그룹에서 CD226 발현의 대표적인 히스토그램; 파란색 영역은 CD226 FMO 컨트롤을 나타냅니다. (나,씨) HC 그룹 및 AR 그룹에서 CD226 양성 ILC2의 비율 및 CD226의 평균 형광 강도(MFI). 값은 평균 ± SD(n=3)로 표현된다. 두 그룹 간의 비교를 위해 Student's t-test를 수행했습니다. P < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체 | 형광 색소 | 클론 | 희석 |
| CD11b입니다 | 핏 | M1/70 시리즈 | 1:100 |
| CD11c | 핏 | N418 | 1:200 |
| CD226 (영어) | PE/시아닌7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | 핏 | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 (CD45) | 알렉사 플루오르 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R (B220) | 핏 | RA3-6B2 시리즈 | 1:100 |
| CD90.2 (영어) | 체육 | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 (한국어판) | 증권 시세 표시기 | 2층1 | 1:160 |
표 1: 표면 염색 항체 칵테일.
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Discussion
ILC2는 제2형 염증 및 염증성 질환과 밀접한 관련이 있으며, 이는 점점 더 많은 연구에서 입증되고 있습니다. 마우스 모델과 인간 관찰 모두 상기도에서의 기능을 더 잘 이해하는 데 기여합니다. 천식 병태생리학에서 ILC2는 주로 상피 세포에서 생성되는 흉선 기질 림프포이에틴, IL-25 및 IL-33을 통해 활성화됩니다. 그런 다음 Th2 세포를 미러링하여 ILC2는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하여 유형 2 염증을 악화시킵니다32. 또한, ILC2의 상이한 하위세트는 또한 IL-10 및 IL-1733,34,35를 생성한다. AR은 또한 제2형 세포에 의해 유발되는 기도 알레르기 염증의 한 유형입니다. AR 병태생리학에서 ILC2의 참여는 최근14에서 입증되었습니다. 그러나 AR에서 ILC2의 잠재적 규제 메커니즘은 거의 알려지지 않았습니다.
증거는 상이한 ILC2s 사이의 상호작용이 표면 분자(36)에 의존할 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, ILC2에서 발현되는 ICOS와 ICOS-리간드는 모두 생존과 기능을 위해 필요하다37. 또한, ILC2는 또한 ICAM-1 및 LFA-1을 발현하며, 이는 세포 이동 및 세포-세포 상호작용에 중요한 영향을 미친다 7,38. 또한 ILC2는 이러한 세포 표면 분자를 통해 다른 면역 세포와 누화할 수 있습니다. 예를 들어, OX40L은 폐 염증에서 CD4+ T 세포와 ILC2 사이의 상호작용에 대한 지배적인 매개체이다39. CD226은 막횡단 공동자극 분자로서 다양한 면역 세포에서 발현되기 때문에 이 연구에서 건강한 AR 마우스의 비강 조직에서 ILC2에 대한 발현도 평가했습니다.
일반적인 OVA 유도 AR 모델링은 복강내 전신 감작 및 비강내 국소 자극을 포함하며, 이는 만족스러운 모델링 결과를 얻기 위해 일반적으로 최소 3-4주가 필요하다31. 또 다른 OVA 유도 비강 전용 전달 AR 모델은 제2형 염증 및 AR 증상의 대략적인 수준을 달성하기 위해 일반적인 모델 방법과 유사한 시간이 걸린다(40). 그러나 이 두 가지 AR 모델링 방법에 의한 비강 ILC2의 수와 기능은 여전히 추가 연구가 필요합니다. AR 증상을 평가하기 위해 재채기와 코 마찰을 평가했다. 콧물에 대한 평가를 포함하는 것이 더 설득력이 있겠지만, 평가 중 생쥐의 행동을 방해하지 않고는 콧물을 관찰하기 어렵다는 것을 발견했기 때문에 유감스럽게도 이러한 기준을 제외했습니다. 또한, 재채기 및 비강 마찰에 대한 평가는 이들 두 가지 기준만을 채택한 많은 관련 논문에 대한 쥐 AR 증상의 중증도를 설명하기에 충분히 심오할 수 있다(41,42,43).
생쥐 비강 ILC2에 대한 이전 연구에서는 쥐 비강 점막의 분리를 설명했습니다44,45. 그들의 프로토콜은 다음과 같습니다 : 간단히 말해서, 두개골 주위의 연조직을 제거하고, 비강 뼈를 열어 비강을 노출시키고, 집게로 두개골 표면에서 코 점막 조직을 긁어냅니다. 분리된 점막의 대부분이 IF, IHC 또는 qPCR에 사용되었지만, 단핵 세포(MNC)의 다음 분리 및 FCM 분석에 대해서는 거의 보고되지 않았습니다. 본 연구에서는 비점막에 위치한 ILC2의 양이 적다는 점을 감안하여 비강 표면에서 점막을 제거하는 대신 코 전체를 소화시켜 비점막의 최대 부피를 유지하였다. 소화 프로토콜을 최적화하기 위해 0.5mg/mL의 콜라게나제 IV, 1mg/mL의 콜라게나제 IV, 1mg/mL의 콜라게나제 IV 및 10U/mL의 DNase I의 세 가지 소화 배지를 평가하고 이 세 가지 소화 배지에서 얻은 살아있는 세포의 백분율과 림프구 빈도를 비교했습니다. 세 가지 배지 모두에 의해 획득 된 살아있는 세포의 비율은 차이가 없습니다 (90 % -95 %). 그러나 처음 두 가지 유형의 소화는 낮은 림프구 빈도(~5%)로 부적절했습니다. 따라서 이 연구에서 1mg/mL의 콜라게나제 IV와 10U/mL의 DNase I을 다이제스트 배지로 선택했습니다. 그러나 콜라게나제를 대체할 수 있는 리베라아제 및 디스파제와 같은 다른 효소는 연구되지 않았습니다. 효소의 종류와 농도가 세포 생존율과 세포 표면 분자 발현에 중요하기 때문에46,47, 코 소화 중 이러한 대안의 사용과 투여량은 여전히 신중한 탐색과 최적화가 필요합니다. FVD eFluor 520을 사용하여 세포 생존율을 확인했는데, 이는 FITC와 동등한 530/30 대역 통과 필터를 사용하여 검출할 수 있기 때문에 Lin-세포를 게이팅하는 동안 죽은 세포를 배제할 수 있기 때문입니다. 다른 세포 생존율 염료도 특정 항체 패널에 따라 선택 사항입니다. 또한, 다른 ILC2 관련 연구에서 일반적으로 수행되는 전사 인자 GATA3의 세포 내 염색 대신, 본 연구의 ILC2는 FCM 분석에서 Lin(CD11b, CD11c, CD3 및 B220), CD45, CD90.2 및 KLRG1과 같은 세포 표면 마커를 기반으로 특성화되었습니다. 그 중에서도, ILC2s에서 발현되는 KLRG1은 성숙 조직 ILC2s의 특이적 마커로서 확인되었다48,49. CD90.2는 덜 특이적이지만, 여전히 ILC2 관련 표면 마커(50)로서 받아들여지고 있다. 이 연구에서 마우스는 성별로 구별되지 않았습니다. 연구에 따르면 생쥐에서 폐 ILC의 풍부함과 세포 표면 항원은 성별이 다르지만 비강 ILC2와 성별의 상관 관계는 여전히 연구해야합니다50. 또한, 프로토콜은 다른 조혈 세포의 비율에 초점을 맞추지 않았습니다. 다른 FCM 항체 패널이 이 문제를 해결하는 데 도움이 될 것입니다.
이 프로토콜은 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하는 방법을 설명했습니다. 분리된 ILC2는 FCM 특성 분석을 위해 염색하거나, 세포 배양을 위해 분류하거나, 추가 분석을 위해 시험관 내에서 자극할 수 있습니다. 이전 연구의 결과와 일치하게10,45,51, AR 마우스의 비점막에서 ILC2s의 실질적인 축적이 관찰되었다. 특히, CD226은 국소 ILC2에서 발현되었으며, 그 수준은 알레르기 질환에서 유의하게 증가했다. 따라서 이 연구의 결과는 ILC2 의존성 AR에서 CD226의 관여를 시사합니다. AR 환자의 ILC2가 CD226을 발현하는지 여부와 ILC2에 대한 CD226 발현이 알레르기 질환에서 증가하는지 여부는 향후 연구에서 조사해야 합니다.
결론적으로, 우리는 비강 점막에서 ILC2를 분리 및 식별하기 위한 프로토콜을 수립하고 그 안에 있는 접착 분자의 발현을 감지했습니다. 프로토콜에는 추가 최적화가 필요합니다. 그러나 림프구, 특히 비강 점막의 선천성 림프 세포를 분리하고 특성화하는 절차를 체계적이고 세밀하게 설명하는 연구가 부족하기 때문에 이 프로토콜은 국소 비강 면역학적 환경을 탐구하는 연구자들을 위한 예비 참고 자료가 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
R.Z.는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81871258)과 제 4 군 의과 대학 (No.2020rcfczr)이 제공 한 기금의 지원을 받았습니다. Y.Z.는 산시성 자연과학 기초 연구 프로그램(No. 2021JM-081)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
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