Summary
Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2s), involvert i type 2 betennelse, deltar hovedsakelig som respons på helminth infeksjon, allergiske sykdommer, metabolsk homeostase og vevsreparasjon. I denne studien er det vist en prosedyre for å isolere ILC2 fra murine neseslimhinne og oppdage uttrykket av CD226.
Abstract
Med rikelig forskning på gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2s) publisert gjennom årene, er ILC2s allment kjent for å være involvert i å regulere ulike patologiske prosesser, inkludert anti-helminth immunitet, vevsreparasjon, termogenese og autoimmune sykdommer som astma og allergisk rhinitt (AR). ILC2s bor permanent i perifert vev som hud, tarm, lunger og nesehule; Det er imidlertid begrenset informasjon om deres eksakte funksjoner ved neseslimhinneimmunitet. CD226 er et aktiverende kostimulatorisk molekyl, hovedsakelig uttrykt på naturlige dreperceller (NK), T-celler og inflammatoriske monocytter. Men om ILC2s uttrykker CD226 eller spiller en rolle i patogenesen av ILC2s-relaterte sykdommer, er fortsatt ukjent. Her etablerte vi en metode for å isolere og identifisere ILC2s fra neseslimhinnen og påviste CD226-uttrykk på ILC2 hentet fra friske og AR-mus. Her beskriver vi denne protokollen for isolering og identifisering av ILC2s fra neseslimhinnen hos mus, som vil bidra til å utforske den interne patologiske mekanismen for immunologiske forstyrrelser i neseslimhinnesykdommer.
Introduction
Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2s) ble først oppdaget i bukhulevevet hos mus og ble senere vist å være tilstede i blodet og andre perifere vev som lungene, huden og nesehulen 1,2,3. Som vevsresidente celler blir ILC2 hovedsakelig vedlikeholdt og spredt lokalt og fungerer som de første vaktene som reagerer på eksogene skadelige stimuli gjennom å produsere mange type 2 cytokiner og indusere type 2 immunitet 4,5,6. ILC2 kan også utøve sine effekter ved å smugle mot det infiserte vevet 7,8.
I likhet med T-helper 2 (Th2) celler, sikrer de kompliserte regulatoriske nettverkene av ILC2s deres betydelige involvering i utviklingen av ulike type 2 inflammatoriske sykdommer, inkludert luftveisallergiske sykdommer 8,9. Ved astma kan epitelcelleavledede alarminer aktivere ILC2, noe som ytterligere fremmer lungebetennelse gjennom utskillelse av interleukin (IL)-4, IL-5 og IL-1310. Kliniske studier har også indikert at ILC2-nivåene var signifikant forhøyet i sputum og blod hos pasienter med alvorlig astma, noe som tyder på en sammenheng mellom ILC2s og astma alvorlighetsgrad og deres funksjon som en prediktor for astmaprogresjon11.
Allergisk rhinitt (AR) er en vanlig kronisk inflammatorisk sykdom som rammer millioner av mennesker årlig, og effektive behandlinger for denne sykdommen er begrenset12,13. ILC2s spiller avgjørende roller i patofysiologien til AR, enten i sensibiliseringsfasen eller symptomgenerering og betennelsesfase14. Hos pasienter med AR er nivåene av ILC2 i perifert blod rapportert å være forhøyet både lokalt og systemisk15. Imidlertid krever visse effekter og de underliggende mekanismene til ILC2s på patofysiologien og progresjonen av AR fortsatt ytterligere utforskning.
CD226 - et transmembranglykoprotein som fungerer som et kostimulatorisk molekyl - uttrykkes primært på naturlige dreperceller (NK), T-celler og andre inflammatoriske monocytter16,17. Samspillet mellom CD226 og dets ligander (CD155 og/eller CD112) eller konkurrent (TIGIT) gjør det mulig å delta i de biologiske funksjonene til forskjellige immunceller18. Bindingen av ligandene på antigenpresenterende celler til CD226 på cytotoksisk lymfocytt (CTL) fremmer aktiveringen av begge cellene samtidig, mens aktiveringen av CTL kan undertrykkes ytterligere av TIGIT (T-celleimmunoreseptor med Ig- og ITIM-domener), konkurrenten til CD22619,20. En human ex vivo-studie viste at CD226 og CD155 på T-celler regulerer balansen mellom Th1/Th17 og Th2 gjennom differensielt modulerende Th-undergrupper21. CD226 kan likeledes formidle blodplateadhesjon og NK-tumordrepende aktivitet22,23. I mellomtiden er CD226 godt studert i patogenesen av ulike smittsomme sykdommer, autoimmune sykdommer og svulster 18,24,25. I dag har CD226 blitt et nytt lyspunkt for immunterapi. Studier har funnet at ekstracellulære vesikler kan reversere CD226-ekspresjon på NK-celler for å gjenopprette deres cytotoksiske aktivitet og gripe inn i utviklingen av lungekreft26. En nylig studie har avslørt en underklynge av fosterets tarmgruppe 3 ILC karakterisert med høyt CD226-uttrykk ved enkeltcelle-RNA-sekvensering27, noe som indikerte at CD226 kan utøve roller i den medfødte lymfoide cellemedierte immuniteten.
Vår kunnskap om ILC2 ved luftveisinflammasjon er primært basert på studier på astma; Imidlertid er lite kjent om deres funksjoner i nasal mukosal immunitet. Dermed ble det etablert en protokoll for å isolere og identifisere ILC2s fra neseslimhinnen. Studien fokuserer på uttrykket av CD226 på ILC2s i nesevev og dets variasjon mellom friske og AR-mus. Dette kan gi ny innsikt i de underliggende mekanismene for ILC2-mediert regulering i den lokale immuniteten og tjene som grunnlag for å utvikle nye tilnærminger for AR-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i henhold til retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer og protokoller ble godkjent av Scientific Research Ethics Committee of the Fourth Military Medical University (nr. 20211008).
1. Murine AR modell etablering
- Hus hann- og hunnmus av villtype (WT) C57BL/6 i alderen 8-12 uker under spesifikke patogenfrie forhold og gir standard laboratoriechow og vann.
- Emulgerer 50 mikrogram ovalbumin (OVA) i 0,2 ml steril PBS inneholdende 2 mg aluminiumhydroksid på en ren benk for å opprettholde steriliteten. På dag 0, 7 og 14 injiseres hunn- eller hannmus intraperitonealt med 50 μg hver emulgert OVA.
- På dagene 21, 22, 23, 24 og 25 drypper mus intranasalt med 50 μg OVA oppløst i 30 μL steril PBS (15 μL per nesebor) under inhalasjonsanestesi (2-3% isofluran med oksygenstrømningshastighet eller 0,5 l/min).
- Avlive musene 24 timer etter den siste utfordringen (dag 26).
2. Isolering av mononukleære celler (MNC) fra neseslimhinnen
- Euthanize musene ved cervical dislokasjon under dyp anestesi. Bløtlegg musene hodet opp i 75% etanol i 5 minutter og unngå at etanol kommer inn i det ytre neseboret. Plasser magen nedover på operasjonsbordet.
- Klipp av fortennene. På midtlinjen av hodet, gjør et snitt, og kutt opp huden ved hjelp av saks.
- Fjern underkjeven, kutt av hele nesen langs enden av ganen, og legg vevet i en 60 mm petriskål som inneholder 5 ml iskald PBS. Bruk saks og tang, fjern kjøttet og musklene som fester seg til beinene.
- Overfør musenesen til en ny 60 mm petriskål inneholdende 5 ml iskald PBS. Vask beinene to ganger med 5 ml iskald PBS.
- Overfør nesen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Knus tilstrekkelig og overfør nesen til et 15 ml rør inneholdende 2 ml forvarmet fordøyelsesbuffer (RPMI 1640 medium supplert med 1 mg/ml kollagenase IV og 10 U/ml DNase I).
- Fest lokket og plasser røret vertikalt i en orbital shaker ved 37 °C, med kontinuerlig omrøring ved 120-150 o / min i 40 minutter.
MERK: Forvarm fordøyelsesbufferen til 37 °C for å oppnå den høyeste enzymaktiviteten. - Tilsett 5 ml iskaldt RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) for å stoppe fordøyelsesprosessen.
- Filtrer gjennom en 70 μm cellesil for å fjerne faste fragmenter.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter, og kast deretter supernatanten forsiktig.
- Resuspender pelleten i iskald RPMI 1640 medium og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter. Kast supernatanten forsiktig.
- Resuspender cellepelleten i 4 ml 40 % gradientmedium med tetthet (160 μL 10x PBS + 1,44 ml tetthetsgradient medielagerløsning + 2,4 ml RPMI 1640 medium).
- Sett forsiktig inn en Pasteur-pipette på bunnen av røret og tilsett sakte 2,5 ml 80 % gradientmedier med tetthet (200 μL 10x PBS + 1,8 ml tetthetsgradientmedieoppløsning + 0,5 ml RPMI 1640 medium).
- Sett akselerasjons- og retardasjonshastigheten til sentrifugen lavere enn det tredje giret og sentrifugen til 400 x g i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern det øverste laget av urenheter før du tømmer cellene ved grensesnittet for å unngå potensiell forurensning. Tøm forsiktig laget av mononukleære celler (MNC) ved mediegrensesnittet på 40 % / 80 % tetthet til et 15 ml rør inneholdende 2 ml iskald PBS ved hjelp av en pipette. Vask cellene med iskald PBS to ganger.
3. Overflatefarging for FCM-analyse
- Høst cellene og sentrifugen ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender cellepelleten i fargebuffer (PBS supplert med 2 % FBS og 0,1 % NaN3) og sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du klargjør fargebufferen. NaN3 er svært giftig og kan forårsake skade på organer ved svelging, innånding eller i kontakt med huden. Unngå også utslipp til miljøet. - Resuspender cellene i 80 μL blokkeringsløsning (anti-CD16/32 antistoff (1:100) fortynnet i fargebuffer) per tube. Rug i 30 minutter i mørket ved 4 °C.
- Uten vask, tilsett 20 μL av passende fortynning av den overflatefargende antistoffcocktailen (tabell 1).
- Tilsett 1 μL (per test) av fikserbart levedyktig fargestoff 520 (FVD) like før du tilsetter antistoffcocktailen til prøvene. Inkuber i mørket ved 4 °C i 30 minutter. Sett matchende isotype antistoffer og fluorescens minus en (FMO) som de negative kontrollene.
- Vask cellene i 500 μL fargebuffer ved å sentrifugere ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellepelleten i 200 μL fargebuffer. Tilsett 50 μL vortexed absolutte tellekuler til de fargede cellene og agiter. Underkast dem en flowcytometri (FCM) analyse.
MERK: FCM-data ble innhentet ved hjelp av en spektralcelleanalysator og analysert med programvare for flowcytometri (FCM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En OVA-indusert murinmodell ble utviklet for å utforske rollen til ILC2s i AR. Konstruksjonen av AR murine modellen var basert på tidligere studier med små modifikasjoner 28,29,30,31. En 10 minutters video ble tatt for å måle hyppigheten av nysing og neseskrape etter den siste neseutfordringen. Allergiske symptomer hos OVA-indusert AR-mus ble presentert i figur 1. Frekvensen av nasal gnidning og nysing i AR-musene var signifikant høyere enn i kontrollgruppen.
Deretter beskrev vi en prosedyre for å isolere MNCs fra murine neseslimhinne og utføre karakteriseringen ved hjelp av FCM-analyse. Ca. 2-3 x 106 lymfocytter ble tatt fra hver murintnese. De døde cellene ble ekskludert ved FVD-farging. Gatingstrategien for ILC2s blant de isolerte cellene var Lin (CD11b, CD11c, CD3 og B220) - CD45 + CD90.2+ KLRG1+ celler. Alle portene ble tegnet basert på isotype eller FMO-kontroll. Vanligvis ble ~2%-3% av Lin− CD45+ celler identifisert i neseslimhinnen hos friske kontrollmus (figur 2). Det absolutte antallet ILC2 i murine neseslimhinne varierer fra 2000-4000.
Vi isolerte deretter ILC2s fra AR-musene ved hjelp av den ovenfor beskrevne metoden. Det var ingen forskjell i absolutt antall lymfocytter mellom HC- og AR-mus. FCM-resultatene indikerte at fraksjonen av ILC2s i AR-musene var 9% -14% av det totale antallet Lin-CD45 + lymfocytter, noe som indikerer en bemerkelsesverdig økning i antall ILC2s i AR neseslimhinne sammenlignet med det i friske kontrollmus (figur 3).
Vi oppdaget uttrykket av CD226 på ILC2s. I gjennomsnitt uttrykte 51,9% av ILC2s CD226 under uimmuniserte forhold, mens gjennomsnittlig forhold mellom ILC2s som uttrykker CD226 var 54,8% i AR-musene, som viste en ikke-signifikant tendens til å øke sammenlignet med kontrollmusene. I tillegg til cellefrekvens ble celleoverflateekspresjonsnivået for CD226 også bestemt ved bruk av gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) som ble automatisk beregnet av FCM-analyseprogramvare. Interessant nok ble MFI av CD226 signifikant oppregulert i AR-musene sammenlignet med kontrollmusene (figur 4), noe som indikerer et forhøyet uttrykk for CD226 på ILC2s i den allergiske neseslimhinnen.
Figur 1: OVA-indusert murine AR-modell . (A) Det skjematiske diagrammet for murine AR-modelletableringen. Hyppigheten av nasal gnidning (B) og nysing (C) i en 10 min periode. Verdier er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) (n = 3). For å sammenligne de to gruppene ble det utført Student t-test; P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: FCM-gatingstrategi for ILC2s. MNCs ble isolert som beskrevet ovenfor. (A) Tetthetsgrafikken viser fordelingen av isolerte MNCer langs FSC- og SSC-aksene. (B) Singlets ble gated basert på FSC-egenskaper. (C) Lin-celler ble definert som CD11b, CD11c, CD3 og B220 negativt uttrykk for å ekskludere myeloide celler, B-celler og T-celler i MNC. Døde celler ble ekskludert ved hjelp av fikserbar levedyktig fargestoff (FVD) farging. (D) ILC kjennetegnes av Lin− CD45+. (E) ILC2 styres av CD90.2+ KLRG1+ blant ILC-er. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: ILC2 i neseslimhinnen hos friske mus og AR-mus. (A) Representative FCM-bilder illustrerer proporsjonene av ILC2 blant ILC fra nesehuleslimhinnen i sunn kontroll (HC) og AR-grupper. (B) Andelene av ILC2s i Lin-CD45+ celler i HC- og AR-grupper. Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3). Studentens t-test ble utført for sammenlikning med to grupper. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CD226-uttrykk i neseslimhinnens ILC2s. ILC2s ble karakterisert ved hjelp av ovennevnte strategi. Uttrykket av CD226 på ILC2s ble evaluert ved hjelp av FCM. (A) Representative histogrammer av CD226-uttrykk i HC- og AR-grupper; Det blå området representerer CD226 FMO-kontrollen. (B,C) Andelene av CD226-positve ILC2s og gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av CD226 i HC-gruppen og AR-gruppen. Verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 3). Student t-test ble utført for sammenligning mellom de to gruppene. P < 0,05 ble ansett som signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff | Fluorokrom | Klon | Fortynning |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Cyanine7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R (B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabell 1: Antistoffcocktail for overflatefarging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ILC2 er nært forbundet med type 2 betennelse og inflammatoriske lidelser, som demonstrert av et økende antall studier. Både musemodeller og menneskelig observasjon bidrar til en bedre forståelse av funksjonen i de øvre luftveiene. I astmapatofysiologi aktiveres ILC2 gjennom tymisk stromale lymfopoietin, IL-25 og IL-33, som hovedsakelig produseres av epitelceller. Deretter speiler Th2-celler, produserer ILC2 IL-4, IL-5 og IL-13 for å forverre type 2 betennelse32. Videre produserer forskjellige undergrupper av ILC2 også IL-10 og IL-1733,34,35. AR er også en type luftveisallergisk betennelse drevet av type 2-celler. Deltakelsen av ILC2s i AR patofysiologi har blitt demonstrert nylig14. Imidlertid forblir de potensielle reguleringsmekanismene til ILC2s under AR stort sett ukjente.
Bevis indikerer at samspillet mellom forskjellige ILC2 kan stole på overflatemolekylene36. For eksempel er både ICOS og ICOS-ligander uttrykt på ILC2 nødvendige for deres overlevelse og funksjoner37. I tillegg uttrykker ILC2s også ICAM-1 og LFA-1, som utøver viktige effekter på cellemigrasjon og celle-celleinteraksjon 7,38. I tillegg kan ILC2-er krysstale med andre immunceller gjennom disse molekylene på celleoverflaten. For eksempel er OX40L en dominerende mediator for samspillet mellom CD4+ T-celler og ILC2s ved lungebetennelse39. Fordi CD226, som et transmembrant kostimulatorisk molekyl, uttrykker seg på forskjellige immunceller, evaluerte vi også uttrykket på ILC2s i nesevev fra friske og AR-mus i denne studien.
Generell OVA-indusert AR-modellering inkluderer intraperitonealt systemisk sensibilisering og intranasal lokal stimulering, som vanligvis krever minst 3-4 uker for å oppnå tilfredsstillende modelleringsresultater31. En annen OVA-indusert nasal-only levering AR-modell tar tilsvarende tid som den generelle modellmetoden for å oppnå et omtrentlig nivå av type 2-betennelse og AR-symptomer40. Imidlertid trenger antallet og funksjonen til nasale ILC2s ved disse to AR-modelleringsmetodene fortsatt ytterligere forskning. Vi vurderte nysing og nesegnidning for å evaluere AR-symptomer. Selv om det ville være mer overbevisende å inkludere vurderingen for rhinoré, fant vi at det er vanskelig å få øye på rhinoré uten å forstyrre musens oppførsel under evalueringen, så vi utelukket dessverre disse kriteriene. I tillegg kan evalueringen for nysing og nesegnidning være dyp nok til å illustrere alvorlighetsgraden av murine AR-symptomer for mange av de relevante artiklene som bare brukte disse to kriteriene41,42,43.
Tidligere studier på mus nasal ILC2 har beskrevet isolering av murine neseslimhinne44,45. Protokollen deres er som følger: Fjern kort det myke vevet rundt skallen, åpne nesebenet for å avsløre nesehulen, og skrap neseslimhinnevevet av overflaten av skallen med tang. Mens det meste av den isolerte slimhinnen ble brukt til IF, IHC eller qPCR, rapporteres lite om følgende isolering av mononukleære celler (MNC) og FCM-analyse. I denne studien, med tanke på de lave mengdene ILC2 som ligger i neseslimhinnen, beholdt operasjonen det maksimale volumet av neseslimhinnen ved å fordøye hele nesen i stedet for å strippe slimhinnen fra overflaten av nesebenet. For å optimalisere fordøyelsesprotokollen evaluerte vi tre fordøyelsesmedier: 0,5 mg / ml kollagenase IV, 1 mg / ml kollagenase IV og 1 mg / ml kollagenase IV og 10 U / ml DNase I, og sammenlignet prosentandelen levende celler og lymfocyttfrekvens oppnådd av disse tre fordøyelsesmediene. Andelen levende celler oppnådd av alle tre medier har ingen forskjell (90% -95%); Imidlertid var de to første typene fordøyelse utilstrekkelige med lavere lymfocyttfrekvens (~ 5%). Dermed ble 1 mg/ml kollagenase IV og 10 U/ml DNase I valgt som fordøyelsesmiddel i denne studien. Imidlertid har andre enzymer som liberase og dispase som kan erstatte kollagenase ikke blitt studert. Siden typen og konsentrasjonen av enzymer er avgjørende for celle levedyktighet og celleoverflatemolekyluttrykk46,47, trenger bruken og doseringen av disse alternativene under nesefordøyelsen fortsatt nøye utforskning og optimalisering. Vi brukte FVD eFluor 520 for å sjekke cellens levedyktighet, fordi det kan detekteres ved hjelp av et 530/30-båndpassfilter som tilsvarer FITC, slik at vi kunne ekskludere de døde cellene mens vi gatet Lin-celler. Andre celle levedyktighet fargestoffer er også valgfrie i henhold til spesifikke antistoff paneler. Videre, i stedet for intracellulær farging av transkripsjonsfaktorer GATA3, som vanligvis utføres i andre ILC2-relaterte studier, ble ILC2s i denne studien karakterisert basert på celleoverflatemarkører som Lin (CD11b, CD11c, CD3 og B220), CD45, CD90.2 og KLRG1 i FCM-analyse. Blant dem har KLRG1 uttrykt på ILC2s blitt identifisert som en spesifikk markør for modent vev ILC2s48,49. Selv om CD90.2 er mindre spesifikk, er den fortsatt akseptert som en ILC2-assosiert overflatemarkør50. I denne studien ble mus ikke skilt etter kjønn. Forskning har vist at overflod og celleoverflateantigener av lunge-ILC hos mus er forskjellige i kjønn, men korrelasjonen av nasale ILC2s med kjønn må fortsatt studeres50. I tillegg fokuserte protokollen ikke på andelen andre hematopoietiske celler. Ulike FCM-antistoffpaneler vil bidra til å løse dette problemet.
Denne protokollen beskrev en metode for å isolere ILC2 fra murine neseslimhinnen. De isolerte ILC2-ene kan farges for FCM-karakterisering, sorteres for cellekultur eller stimuleres in vitro for videre analyser. I samsvar med funnene fra de tidligere studiene 10,45,51 ble det observert en betydelig akkumulering av ILC2 i neseslimhinnen hos AR-mus. Spesielt ble CD226 uttrykt på lokale ILC2, og nivået økte betydelig ytterligere ved allergiske tilstander. Derfor antyder funnene i denne studien involvering av CD226 i ILC2-avhengig AR. Hvorvidt ILC2s hos pasienter med AR uttrykker CD226 og om CD226-uttrykket på ILC2s øker i allergiske tilstander, bør undersøkes i fremtidige studier.
Avslutningsvis etablerte vi en protokoll for å isolere og identifisere ILC2s fra neseslimhinnen og oppdaget uttrykket av adhesjonsmolekyler i dem. Protokollen krever ytterligere optimalisering; Mangelen på studier som systematisk og minutt beskriver prosedyren for å isolere og karakterisere lymfocytter, spesielt medfødte lymfoide celler i neseslimhinnen, gjør imidlertid denne protokollen til en foreløpig referanse for forskere som undersøker det lokale nasale immunologiske miljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
RZ ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 81871258) og midler gitt av Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). YZ ble støttet av Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (nr. 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
