Summary
Врожденные лимфоидные клетки группы 2 (ILC2), участвующие в воспалении 2 типа, в основном участвуют в реакции на гельминтозную инфекцию, аллергические заболевания, метаболический гомеостаз и восстановление тканей. В этом исследовании продемонстрирована процедура выделения ILC2 из слизистой оболочки носа мышей и обнаружения экспрессии CD226.
Abstract
Благодаря многочисленным исследованиям врожденных лимфоидных клеток группы 2 (ILC2), опубликованным на протяжении многих лет, широко известно, что ILC2 участвуют в регуляции различных патологических процессов, включая иммунитет против гельминтов, восстановление тканей, термогенез и аутоиммунные заболевания, такие как астма и аллергический ринит (AR). ILC2 постоянно находятся в периферических тканях, таких как кожа, кишечник, легкие и носовая полость; Однако существует ограниченная информация об их точных функциях в иммунитете слизистой оболочки носа. CD226 представляет собой активирующую костимулирующую молекулу, в основном экспрессируемую на естественных клетках-киллеров (NK), Т-клетках и воспалительных моноцитах. Однако остается неизвестным, экспрессируют ли ILC2 CD226 или играют роль в патогенезе заболеваний, связанных с ILC2s. Здесь мы разработали метод выделения и идентификации ILC2 из слизистой оболочки носа и обнаружили экспрессию CD226 на ILC2, полученных от здоровых мышей и мышей с AR. В данной работе описан протокол выделения и идентификации ILC2 из слизистой оболочки носа мышей, который поможет исследовать внутренний патологический механизм иммунологических нарушений при заболеваниях слизистой оболочки носа.
Introduction
Врожденные лимфоидные клетки группы 2 (ILC2) были впервые обнаружены в тканях брюшной полости мышей, и впоследствии было продемонстрировано, что они присутствуют в крови и других периферических тканях, таких как легкие, кожа и носовая полость 1,2,3. Как клетки, резидентные в тканях, ILC2 в основном поддерживаются и размножаются локально и функционируют как первые охранники, реагирующие на экзогенные вредные стимулы, продуцируя многочисленные цитокины типа 2 и индуцируя иммунитет типа2 4,5,6. ILC2 также могут оказывать свое воздействие, перемещаясь к инфицированным тканям 7,8.
Подобно клеткам Т-хелперов 2 (Th2), сложные регуляторные сети ILC2 обеспечивают их значительное участие в прогрессировании различных воспалительных заболеваний 2 типа, включая аллергические заболевания дыхательных путей 8,9. При астме аферины, полученные из эпителиальных клеток, могут активировать ILC2s, которые дополнительно способствуют воспалению легких за счет секреции интерлейкина (IL)-4, IL-5 и IL-1310. Клинические исследования также показали, что уровни ILC2 были значительно повышены в мокроте и крови пациентов с тяжелой астмой, что свидетельствует о связи ILC2 с тяжестью астмы и их функцией в качестве предиктора прогрессирования астмы11.
Аллергический ринит (АР) является распространенным хроническим воспалительным заболеванием, которое ежегодно поражает миллионы людей, и эффективные методы лечения этого заболевания ограничены12,13. ILC2 играют решающую роль в патофизиологии АР, будь то фаза сенсибилизации или генерация симптомов и фазавоспаления 14. Сообщалось, что у пациентов с АР уровни ILC2 в периферической крови повышены как локально, так и системно15. Тем не менее, некоторые эффекты и основные механизмы ILC2 на патофизиологию и прогрессирование AR все еще требуют дальнейшего изучения.
CD226 - трансмембранный гликопротеин, который служит костимулирующей молекулой - в основном экспрессируется на естественных клетках-киллеров (NK), Т-клетках и других воспалительных моноцитах16,17. Взаимодействие CD226 и его лигандов (CD155 и/или CD112) или конкурента (TIGIT) позволяет ему участвовать в биологических функциях различных иммунныхклеток18. Связывание лигандов на антигенпрезентирующих клетках с CD226 на цитотоксическом лимфоците (CTL) способствует активации обеих клеток одновременно, в то время как активация CTL может быть дополнительно подавлена TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM), конкурентом CD22619,20. Исследование ex vivo на людях показало, что CD226 и CD155 на Т-клетках регулируют баланс между Th1 / Th17 и Th2 посредством дифференциально модулирующих подмножествTh 21. CD226 также может опосредовать адгезию тромбоцитов и убивающую опухоль NKактивность 22,23. Между тем, CD226 хорошо изучен в патогенезе различных инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и опухолей 18,24,25. В настоящее время CD226 стал новым светлым пятном для иммунотерапии. Исследования показали, что внеклеточные везикулы могут обратить вспять экспрессию CD226 на NK-клетках, чтобы восстановить их цитотоксическую активность и вмешаться в прогрессирование рака легких26. Недавнее исследование выявило подкластер ILC 3-й группы кишечника плода, характеризующийся высокой экспрессией CD226 при секвенировании одноклеточной РНК27, что указывает на то, что CD226 может играть роль во врожденном иммунитете, опосредованном лимфоидными клетками.
Наши знания о ILC2 при воспалении дыхательных путей в основном основаны на исследованиях астмы; Однако мало что известно об их функциях в иммунитете слизистой оболочки носа. Таким образом, был создан протокол для выделения и идентификации ILC2 из слизистой оболочки носа. Исследование фокусируется на экспрессии CD226 на ILC2 в тканях носа и его вариациях между здоровыми мышами и мышами AR. Это может дать новое представление об основных механизмах ILC2-опосредованной регуляции местного иммунитета и послужить основой для разработки новых подходов к лечению AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Все процедуры и протоколы были одобрены Комитетом по этике научных исследований Четвертого военно-медицинского университета (No 20211008).
1. Создание модели Murine AR
- Размещайте самцов и самок мышей дикого типа (WT) C57BL/6 в возрасте 8-12 недель в определенных условиях, свободных от патогенов, и обеспечьте стандартную лабораторную пищу и воду.
- Эмульгируйте 50 мкг овальбумина (OVA) в 0,2 мл стерильного PBS, содержащего 2 мг гидроксида алюминия, на чистой скамье для поддержания стерильности. В дни 0, 7 и 14 внутрибрюшинно вводят самкам или самцам мышей по 50 мкг эмульгированной OVA.
- На 21-й, 22-й, 23-й, 24-й и 25-й дни интраназально закапывают мышам 50 мкг OVA, растворенных в 30 мкл стерильного PBS (15 мкл на ноздрю) под ингаляционной анестезией (2-3% изофлуран со скоростью потока кислорода или 0,5 л/мин).
- Усыпьте мышей через 24 часа после последнего испытания (26-й день).
2. Выделение мононуклеарных клеток (ТНК) из слизистой оболочки носа
- Усыпляют мышей вывихом шейки матки под глубоким наркозом. Замочите голову мышей в 75% этаноле на 5 минут и избегайте попадания этанола во внешнюю ноздрю. Положите живот вниз на операционный стол.
- Срежьте передние зубы. По средней линии головы сделайте надрез и разрежьте кожу ножницами.
- Удалите нижнюю челюсть, отрежьте весь нос вдоль конца неба и поместите ткань в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 5 мл ледяного PBS. С помощью ножниц и щипцов удалите плоть и мышцы, прилипшие к костям.
- Перенесите нос мыши в новую чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 5 мл ледяного PBS. Дважды промойте кости 5 мл ледяного PBS.
- Перенесите нос в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Достаточно разбить и перенести нос в пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл предварительно подогретого буфера для переваривания (среда RPMI 1640 с добавлением 1 мг/мл коллагеназы IV и 10 ЕД/мл ДНКазы I).
- Закройте крышку и поместите трубку вертикально в орбитальный шейкер при 37 ° C при непрерывном перемешивании при 120-150 об/мин в течение 40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте буфер для переваривания до 37 °C для достижения максимальной активности ферментов. - Добавьте 5 мл ледяной среды RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), чтобы остановить процесс пищеварения.
- Отфильтруйте через сетчатый фильтр для ячеек размером 70 мкм для удаления твердых фрагментов.
- Центрифугу при 500 x g в течение 5 мин, а затем аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать гранулы в ледяной среде RPMI 1640 и центрифуге при 500 x g в течение 5 мин. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать клеточную гранулу в 4 мл среды с градиентом плотности 40% (160 мкл 10x PBS + 1,44 мл исходного раствора среды с градиентом плотности + 2,4 мл среды RPMI 1640).
- Аккуратно вставьте пипетку Пастера на дно пробирки и медленно добавьте 2,5 мл среды с градиентом плотности 80% (200 мкл 10x PBS + 1,8 мл исходного раствора среды с градиентом плотности + 0,5 мл среды RPMI 1640).
- Установите скорость ускорения и замедления центрифуги ниже третьей передачи и центрифуги на уровне 400 x g в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Удалите верхний слой примесей перед сливом ячеек на границе раздела, чтобы избежать потенциального загрязнения. Осторожно слейте слой мононуклеарных клеток (ТНК) на границе раздела сред с градиентом плотности 40%/80% в пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл ледяного PBS, с помощью пипетки. Промойте клетки ледяным PBS дважды.
3. Окрашивание поверхности для анализа FCM
- Соберите клетки и центрифугу при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируют клеточную гранулу в окрашивающем буфере (PBS с добавлением 2% FBS и 0,1% NaN3) и центрифуге при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости.
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при приготовлении буфера для окрашивания. NaN3 очень токсичен и может вызвать повреждение органов при проглатывании, вдыхании или контакте с кожей. Кроме того, избегайте попадания в окружающую среду. - Ресуспендируют клетки в 80 мкл блокирующего раствора (антитела против CD16/32 (1:100), разведенные в окрашивающем буфере) на пробирку. Выдерживать 30 мин в темноте при температуре 4 °C.
- Без промывки добавьте 20 мкл соответствующего разбавления коктейля антител, окрашивающих поверхность (таблица 1).
- Добавьте 1 мкл (на тест) фиксируемого жизнеспособного красителя 520 (FVD) непосредственно перед добавлением коктейля антител в образцы. Инкубировать в темноте при температуре 4 °C в течение 30 мин. Установите соответствующие антитела к изотипу и флуоресценцию минус один (FMO) в качестве отрицательного контроля.
- Промойте клетки в 500 мкл окрашивающего буфера центрифугированием при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Ресуспендируют клеточную гранулу в 200 мкл окрашивающего буфера. Добавьте 50 мкл вихревых абсолютных счетных шариков в окрашенные клетки и перемешайте. Подвергните их анализу проточной цитометрии (FCM).
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные FCM были получены с помощью спектрального анализатора клеток и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии (FCM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышиная модель, индуцированная OVA, была разработана для изучения роли ILC2 в AR. Построение мышиной модели AR было основано на предыдущих исследованиях с небольшими изменениями 28,29,30,31. Было снято 10-минутное видео для измерения частоты чихания и расчесывания носа после последнего носового вызова. Аллергические симптомы мышей, индуцированных OVA-индуцированной AR, были представлены на рисунке 1. Частота натирания носа и чихания у мышей с АР была достоверно выше, чем в контрольной группе.
Далее мы описали процедуру выделения МНК из слизистой оболочки носа мышей и их характеристики с помощью анализа FCM. Из каждого мышиного носа было получено около 2-3 х 10,6 лимфоцитов. Мертвые клетки были исключены с помощью окрашивания FVD. Стратегия стробирования для ILC2 среди изолированных клеток была Lin (CD11b, CD11c, CD3 и B220) - CD45 + CD90,2 + клетки KLRG1 +. Все затворы были нарисованы на основе изотипа или управления FMO. Как правило, ~ 2% -3% клеток Lin− CD45+ были идентифицированы в слизистой оболочке носа здоровых контрольных мышей (рис. 2). Абсолютное количество ILC2 в слизистой оболочке носа мышей колеблется от 2000 до 4000.
Затем мы изолировали ILC2 от мышей AR, используя описанный выше метод. Не было различий в абсолютном количестве лимфоцитов между мышами HC и AR. Результаты FCM показали, что доля ILC2 у мышей AR составляла 9%-14% от общего количества лимфоцитов Lin− CD45+ , что указывает на значительное увеличение количества ILC2 в слизистой оболочке носа AR по сравнению со здоровыми контрольными мышами (рис. 3).
Мы обнаружили экспрессию CD226 на ILC2s. В среднем, 51,9% ILC2 экспрессировали CD226 в неиммунизированных условиях, тогда как среднее соотношение ILC2, экспрессирующих CD226, составляло 54,8% у мышей AR, что показало незначительную тенденцию к увеличению по сравнению с контрольными мышами. В дополнение к клеточной частоте, уровень экспрессии CD226 на клеточной поверхности также определяли с использованием средней интенсивности флуоресценции (MFI), которая была автоматически рассчитана программным обеспечением для анализа FCM. Интересно, что MFI CD226 был значительно повышен у мышей AR по сравнению с контрольными мышами (рис. 4), что указывает на повышенную экспрессию CD226 на ILC2 аллергической слизистой оболочки носа.
Рисунок 1: OVA-индуцированная мышиная модель AR . (A) Принципиальная схема создания мышиной AR-модели. Частота трения носа (В) и чихания (С) в течение 10 мин. Значения представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) (n = 3). Для сравнения двух групп был выполнен t-критерий Стьюдента; P < 0,05 считался статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия стробирования FCM для ILC2. ТНК были изолированы, как описано выше. (A) График плотности демонстрирует распределение изолированных ТНК по осям FSC и SSC. (B) Синглеты были закрыты на основе характеристик FSC. (C) Клетки Lin- были определены как отрицательная экспрессия CD11b, CD11c, CD3 и B220, чтобы исключить миелоидные клетки, В-клетки и Т-клетки в ТНК. Мертвые клетки были исключены с помощью окрашивания корректируемым красителем жизнеспособности (FVD). (D) ILC характеризуются Lin− CD45+. (E) ILC2 закрыты CD90.2+ KLRG1+ среди ILC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: ILC2s в слизистой оболочке носа здоровых мышей и мышей с АР. (A) Репрезентативные изображения FCM иллюстрируют пропорции ILC2 среди ILC из слизистой оболочки полости носа здоровых контрольных групп (HC) и AR. (B) Пропорции ILC2 в клетках Lin− CD45+ в группах HC и AR. Значения представлены в виде среднего значения ± SD (n = 3). t-критерий Стьюдента проводился для сравнения в двух группах. P < 0,05 считался статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия CD226 в ILC2 слизистой оболочки носа. ILC2 были охарактеризованы с использованием вышеупомянутой стратегии. Экспрессию CD226 на ILC2s оценивали с помощью FCM. (A) Репрезентативные гистограммы экспрессии CD226 в группах HC и AR; синяя область представляет собой элемент управления CD226 FMO. (В,В) Пропорции CD226-позитивных ILC2 и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD226 в группе HC и группе AR. Значения выражаются в виде среднего значения ± SD (n = 3). Для сравнения между двумя группами был проведен t-критерий Стьюдента. P < 0,05 был признан значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Антитело | Флуорохром | Клон | Разбавление |
| CD11b | ФИТК | М1/70 | 1:100 |
| CD11c | ФИТК | Н418 | 1:200 |
| КД226 | ПЭ/цианин7 | 10Э5 | 1:50 |
| CD3e | ФИТК | 145-2С11 | 1:100 |
| КД45 | Alexa Fluor 700 | 30-Ф11 | 1:200 |
| КД45Р(Б220) | ФИТК | РА3-6Б2 | 1:100 |
| CD90.2 | ЧП | 30-Н12 | 1:100 |
| КЛРГ1 | БТР | 2Ф1 | 1:160 |
Таблица 1: Коктейль антител для окрашивания поверхности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ILC2 тесно связаны с воспалением и воспалительными заболеваниями 2 типа, о чем свидетельствует растущее число исследований. Как мышиные модели, так и наблюдение за человеком способствуют лучшему пониманию его функции в верхних дыхательных путях. В патофизиологии астмы ILC2 активируются через стромальный лимфопоэтин тимуса, IL-25 и IL-33, которые в основном продуцируются эпителиальными клетками. Затем, отражая клетки Th2, ILC2 продуцируют IL-4, IL-5 и IL-13, усугубляя воспаление 2 типа32. Кроме того, различные подмножества ILC2 также производят IL-10 и IL-1733,34,35. AR также является типом аллергического воспаления дыхательных путей, вызванного клетками 2 типа. Участие ILC2 в патофизиологии АР было продемонстрировано недавно14. Тем не менее, потенциальные регуляторные механизмы ILC2 при AR остаются в значительной степени неизвестными.
Имеющиеся данные указывают на то, что взаимодействие между различными ILC2 может зависеть от поверхностных молекул36. Например, как ICOS, так и ICOS-лиганды, экспрессируемые на ILC2s, необходимы для их выживания и функционирования37. Кроме того, ILC2 также экспрессируют ICAM-1 и LFA-1, которые оказывают важное влияние на миграцию клеток и межклеточное взаимодействие 7,38. Кроме того, ILC2 могут перекрестно взаимодействовать с другими иммунными клетками через эти молекулы клеточной поверхности. Например, OX40L является доминирующим медиатором взаимодействия между CD4+ Т-клетками и ILC2 при воспалении легких39. Поскольку CD226, как трансмембранная костимулирующая молекула, экспрессируется на различных иммунных клетках, мы также оценили его экспрессию на ILC2 в тканях носа здоровых мышей и мышей AR в этом исследовании.
Общее OVA-индуцированное моделирование AR включает внутрибрюшинную системную сенсибилизацию и интраназально локальную стимуляцию, которые обычно требуют не менее 3-4 недель для достижения удовлетворительных результатов моделирования31. Другая модель AR, индуцированная OVA, с доставкой только из носа, требует того же времени, что и общий модельный метод, для достижения приблизительного уровня воспаления 2 типа и симптомов AR40. Тем не менее, количество и функция назальных ILC2 с помощью этих двух методов моделирования AR все еще нуждаются в дальнейших исследованиях. Мы оценили чихание и трение носа, чтобы оценить симптомы АР. Хотя было бы более убедительно включить оценку ринореи, мы обнаружили, что трудно увидеть ринорею, не вмешиваясь в поведение мышей во время оценки, поэтому мы, к сожалению, исключили эти критерии. Кроме того, оценка чихания и трения носа может быть достаточно глубокой, чтобы проиллюстрировать тяжесть симптомов АР у мышей для многих соответствующих статей, в которых использовались только эти два критерия41,42,43.
В предыдущих исследованиях, посвященных носовым ILC2 мышей, было описано выделение слизистой оболочки носа мышей44,45. Их протокол выглядит следующим образом: вкратце удалите мягкие ткани вокруг черепа, откройте носовую кость, чтобы обнажить полость носа, и соскребите слизистую оболочку носа с поверхности черепа щипцами. В то время как большая часть изолированной слизистой оболочки использовалась для IF, IHC или qPCR, мало сообщается о последующем выделении мононуклеарных клеток (MNC) и анализе FCM. В этом исследовании, учитывая небольшое количество ILC2, расположенных в слизистой оболочке носа, операция сохранила максимальный объем слизистой оболочки носа за счет переваривания всего носа вместо удаления слизистой оболочки с поверхности носовой кости. Чтобы оптимизировать протокол пищеварения, мы оценили три пищеварительные среды: 0,5 мг/мл коллагеназы IV, 1 мг/мл коллагеназы IV и 1 мг/мл коллагеназы IV и 10 ЕД/мл ДНКазы I, и сравнили процент живых клеток и частоту лимфоцитов, полученных этими тремя пищеварительными средами. Доля живых клеток, приобретенных всеми тремя средами, не имеет различий (90%-95%); Однако первые два типа пищеварения были неадекватными с более низкой частотой лимфоцитов (~ 5%). Таким образом, 1 мг / мл коллагеназы IV и 10 Ед / мл ДНКазы I были выбраны в качестве пищеварительной среды в этом исследовании. Однако другие ферменты, такие как либераза и диспаза, которые могут заменить коллагеназу, не изучались. Поскольку тип и концентрация ферментов имеют решающее значение для жизнеспособности клеток и экспрессии молекул клеточной поверхности46,47, использование и дозировка этих альтернатив во время пищеварения носа все еще нуждаются в тщательном изучении и оптимизации. Мы использовали FVD eFluor 520 для проверки жизнеспособности клеток, потому что его можно обнаружить с помощью полосового фильтра 530/30, который эквивалентен FITC, поэтому мы могли исключить мертвые клетки при стробировании Lin-клеток. Другие красители жизнеспособности клеток также не являются обязательными в соответствии со специфическими панелями антител. Кроме того, вместо внутриклеточного окрашивания транскрипционных факторов GATA3, которое обычно проводится в других исследованиях, связанных с ILC2, ILC2 в настоящем исследовании были охарактеризованы на основе маркеров клеточной поверхности, таких как Lin (CD11b, CD11c, CD3 и B220), CD45, CD90.2 и KLRG1 в анализе FCM. Среди них KLRG1, экспрессируемый на ILC2s, был идентифицирован как специфический маркер зрелой ткани ILC2s48,49. Хотя CD90.2 менее специфичен, он все же принимается в качестве ILC2-ассоциированного поверхностного маркера50. В этом исследовании мыши не различались по полу. Исследования показали, что обилие и антигены клеточной поверхности легочных ILC у мышей различаются по полу, но корреляцию назальных ILC2 с полом все еще необходимо изучить50. Кроме того, протокол не фокусировался на доле других кроветворных клеток. Различные панели антител FCM помогут решить эту проблему.
В этом протоколе описан способ выделения ILC2 из слизистой оболочки носа мыши. Выделенные ILC2 могут быть окрашены для характеристики FCM, отсортированы для культивирования клеток или стимулированы in vitro для дальнейшего анализа. В соответствии с результатами предыдущих исследований 10,45,51, значительное накопление ILC2 наблюдалось в слизистой оболочке носа мышей AR. Примечательно, что CD226 экспрессировался на локальных ILC2, и его уровень значительно увеличивался при аллергических состояниях. Таким образом, результаты этого исследования предполагают участие CD226 в ILC2-зависимом AR. Следует ли изучить в будущих исследованиях вопрос о том, экспрессируют ли ILC2 у пациентов с AR CD226 и увеличивается ли экспрессия CD226 на ILC2 при аллергических состояниях.
В заключение мы разработали протокол для выделения и идентификации ILC2 из слизистой оболочки носа и обнаружили экспрессию молекул адгезии внутри них. Протокол требует дальнейшей оптимизации; Однако отсутствие исследований, которые систематически и подробно описывают процедуру выделения и характеристики лимфоцитов, особенно врожденных лимфоидных клеток в слизистой оболочке носа, делает этот протокол предварительным справочником для исследователей, изучающих местную иммунологическую среду носа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Р.З. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (No 81871258) и средствами, предоставленными Четвертым военно-медицинским университетом (No 2020rcfczr). Ю.З. был поддержан Программой фундаментальных исследований естественных наук провинции Шэньси (No 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
