Summary
Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.
Abstract
Con abundantes investigaciones sobre células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) publicadas a lo largo de los años, se sabe ampliamente que las ILC2 están implicadas en la regulación de diversos procesos patológicos, incluida la inmunidad antihelmintos, la reparación de tejidos, la termogénesis y las enfermedades autoinmunes como el asma y la rinitis alérgica (AR). Las ILC2 residen permanentemente en tejidos periféricos como la piel, el intestino, los pulmones y la cavidad nasal; Sin embargo, hay información limitada sobre sus funciones exactas en la inmunidad de la mucosa nasal. CD226 es una molécula coestimuladora activadora, expresada principalmente en células asesinas naturales (NK), células T y monocitos inflamatorios. Sin embargo, sigue sin conocerse si las ILC2 expresan CD226 o desempeñan un papel en la patogénesis de las enfermedades relacionadas con ILC2. Aquí, establecimos un método para aislar e identificar ILC2s de la mucosa nasal y detectamos la expresión de CD226 en ILC2s obtenidas de ratones sanos y AR. Aquí, describimos este protocolo para el aislamiento e identificación de ILC2 de la mucosa nasal del ratón, que ayudará a explorar el mecanismo patológico interno de los trastornos inmunológicos en las enfermedades de la mucosa nasal.
Introduction
Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) se descubrieron por primera vez en los tejidos de la cavidad peritoneal de ratones y posteriormente se demostró que estaban presentes en la sangre y otros tejidos periféricos como los pulmones, la piel y la cavidad nasal 1,2,3. Como células residentes en tejidos, las ILC2 se mantienen y proliferan principalmente localmente y funcionan como los primeros protectores que responden a estímulos dañinos exógenos mediante la producción de numerosas citoquinas tipo 2 e induciendo inmunidad tipo 2 4,5,6. Las ILC2 también pueden ejercer sus efectos traficando hacia los tejidos infectados 7,8.
Al igual que las células T-helper 2 (Th2), las complicadas redes reguladoras de ILC2 aseguran su participación significativa en la progresión de diversas enfermedades inflamatorias tipo 2, incluidas las enfermedades alérgicas de las vías respiratorias 8,9. En el asma, las alarminas derivadas de células epiteliales pueden activar ILC2, que promueven aún más la inflamación pulmonar a través de la secreción de interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Los estudios clínicos también han indicado que los niveles de ILC2 fueron significativamente elevados en el esputo y la sangre de pacientes con asma grave, lo que sugiere una asociación de ILC2 con la gravedad del asma y su función como predictor de la progresión del asma11.
La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica común que afecta a millones de personas anualmente, y los tratamientos efectivos para esta enfermedad son limitados12,13. Las ILC2 juegan un papel crucial en la fisiopatología de la RA, ya sea en la fase de sensibilización o en la fase de generación de síntomas e inflamación14. En pacientes con AR, los niveles de ILC2 en la sangre periférica han sido reportados elevados tanto local como sistémicamente15. Sin embargo, ciertos efectos y los mecanismos subyacentes de ILC2 sobre la fisiopatología y la progresión de AR aún requieren una exploración adicional.
CD226 - una glicoproteína transmembrana que sirve como molécula coestimuladora - se expresa principalmente en células asesinas naturales (NK), células T y otros monocitos inflamatorios16,17. La interacción de CD226 y sus ligandos (CD155 y/o CD112) o competidor (TIGIT) le permite participar en las funciones biológicas de varias células inmunes18. La unión de los ligandos en las células presentadoras de antígeno a CD226 en el linfocito citotóxico (CTL) promueve la activación de ambas células simultáneamente, mientras que la activación de CTL puede ser suprimida aún más por TIGIT (inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM), el competidor de CD226 19,20. Un estudio ex vivo en humanos reveló que CD226 y CD155 en células T regulan el equilibrio entre Th1 / Th17 y Th2 a través de la modulación diferencial de los subconjuntosTh 21. El CD226 también puede mediar la adhesión plaquetaria y la actividad de destrucción tumoral NK22,23. Mientras tanto, CD226 está bien estudiado en la patogénesis de diversas enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes y tumores 18,24,25. En la actualidad, CD226 se ha convertido en un nuevo punto brillante para la inmunoterapia. Los estudios han encontrado que las vesículas extracelulares pueden revertir la expresión de CD226 en las células NK para restablecer su actividad citotóxica e intervenir en la progresión del cáncer de pulmón26. Un estudio reciente ha revelado un subgrupo de ILC del grupo intestinal fetal 3 caracterizado con una alta expresión de CD226 por secuenciación de ARN unicelular27, lo que indica que CD226 podría ejercer funciones en la inmunidad mediada por células linfoides innatas.
Nuestro conocimiento sobre las ILC2 en la inflamación de las vías respiratorias se basa principalmente en estudios sobre el asma; Sin embargo, se sabe poco sobre sus funciones en la inmunidad de la mucosa nasal. Por lo tanto, se estableció un protocolo para aislar e identificar ILC2s de la mucosa nasal. El estudio se centra en la expresión de CD226 en ILC2s en tejidos nasales y su variación entre ratones sanos y AR. Esto puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de la regulación mediada por ILC2 en la inmunidad local y servir como base para desarrollar nuevos enfoques para el tratamiento de AR.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Pautas de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Científica de la Cuarta Universidad Médica Militar (Nº 20211008).
1. Establecimiento del modelo Murine AR
- Alojar ratones machos y hembras C57BL / 6 de tipo salvaje (WT) de 8 a 12 semanas en condiciones específicas libres de patógenos y proporcionar comida y agua estándar de laboratorio.
- Emulsionar 50 μg de ovoalbúmina (OVA) en 0,2 ml de PBS estéril que contiene 2 mg de hidróxido de aluminio en un banco limpio para mantener la esterilidad. En los días 0, 7 y 14, inyecte intraperitonealmente ratones hembra o macho con 50 μg cada uno de OVA emulsionada.
- En los días 21, 22, 23, 24 y 25, instilar intranasalmente ratones con 50 μg de OVA disuelto en 30 μL de PBS estéril (15 μL por fosa nasal) bajo anestesia por inhalación (2-3% de isoflurano con una tasa de flujo de oxígeno o 0,5 L / min).
- Eutanasia a los ratones 24 h después del último desafío (día 26).
2. Aislamiento de células mononucleares (EMN) de la mucosa nasal
- Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo anestesia profunda. Remoje la cabeza de los ratones en etanol al 75% durante 5 minutos y evite que el etanol entre en la fosa nasal externa. Coloque el abdomen hacia abajo en la mesa de operaciones.
- Cortar los dientes anteriores. En la línea media de la cabeza, haga una incisión y abra la piel con tijeras.
- Retire la mandíbula inferior, corte toda la nariz a lo largo del extremo del paladar y coloque el tejido en una placa de Petri de 60 mm que contenga 5 ml de PBS helado. Usando tijeras y fórceps, retire la carne y los músculos adheridos a los huesos.
- Transfiera la nariz del ratón a una nueva placa de Petri de 60 mm que contenga 5 ml de PBS helado. Lave los huesos dos veces con 5 ml de PBS helado.
- Transfiera la nariz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Aplastar y transferir suficientemente la nariz a un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón digestivo precalentado (RPMI 1640 medio suplementado con 1 mg/ml de colagenasa IV y 10 U/ml DNasa I).
- Sujetar la tapa y colocar el tubo verticalmente en un agitador orbital a 37 °C, con agitación continua a 120-150 rpm durante 40 min.
NOTA: Precaliente el tampón de digestión a 37 °C para lograr la mayor actividad enzimática. - Agregue 5 ml de medio RPMI 1640 helado que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) para detener el proceso de digestión.
- Filtrar a través de un filtro celular de 70 μm para eliminar fragmentos sólidos.
- Centrifugar a 500 x g durante 5 min, y luego desechar suavemente el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet en medio RPMI 1640 helado y centrifugar a 500 x g durante 5 min. Deseche suavemente el sobrenadante.
- Resuspender el pellet celular en 4 ml de medio de gradiente de densidad al 40% (160 μL de 10x PBS + 1,44 ml de solución madre de medios de gradiente de densidad + 2,4 ml de medio RPMI 1640).
- Inserte suavemente una pipeta Pasteur en el fondo del tubo y añada lentamente 2,5 ml de medio de gradiente de densidad al 80% (200 μL de 10x PBS + 1,8 ml de solución madre de medios de gradiente de densidad + 0,5 ml de medio RPMI 1640).
- Ajuste la velocidad de aceleración y desaceleración de la centrífuga por debajo de la tercera marcha y la centrífuga a 400 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Retire la capa superior de impurezas antes de drenar las células en la interfaz para evitar una posible contaminación. Drene cuidadosamente la capa de células mononucleares (MNC) en la interfaz de medios de gradiente de densidad 40%/80% en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de PBS helado usando una pipeta. Lave las celdas con PBS helado dos veces.
3. Tinción superficial para análisis FCM
- Cosechar las células y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender el pellet celular en tampón de tinción (PBS suplementado con 2% FBS y 0,1% NaN3) y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al preparar el tampón de tinción. NaN3 es muy tóxico y puede causar daño a los órganos si se ingiere, inhala o entra en contacto con la piel. Además, evite la liberación al medio ambiente. - Resuspender las células en solución bloqueante de 80 μL (anticuerpo anti-CD16/32 [1:100] diluido en tampón de tinción) por tubo. Incubar durante 30 min en la oscuridad a 4 °C.
- Sin lavar, añadir 20 μL de la dilución adecuada del cóctel de anticuerpos para la tinción superficial (Tabla 1).
- Agregue 1 μL (por prueba) de colorante de viabilidad reparable 520 (FVD) justo antes de agregar el cóctel de anticuerpos a las muestras. Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Establecer anticuerpos de isotipo coincidentes y fluorescencia menos uno (FMO) como controles negativos.
- Lavar las células en 500 μL de tampón de tinción centrifugando a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón de tinción. Agregue 50 μL de cuentas de conteo absoluto de vórtice a las celdas teñidas y agite. Somételos a un análisis de citometría de flujo (FCM).
NOTA: Los datos de FCM se obtuvieron utilizando un analizador de células espectrales y se analizaron con software de análisis de citometría de flujo (FCM).
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Representative Results
Se desarrolló un modelo murino inducido por OVA para explorar el papel de ILC2s en AR. La construcción del modelo murino AR se basó en estudios previos con ligeras modificaciones 28,29,30,31. Se capturó un video de 10 minutos para medir la frecuencia de los estornudos y el rascado nasal después del último desafío nasal. Los síntomas alérgicos de los ratones AR inducidos por OVA se presentaron en la Figura 1. La frecuencia de frotamiento nasal y estornudos en los ratones AR fue significativamente mayor que en el grupo de control.
A continuación, describimos un procedimiento para aislar las EMN de la mucosa nasal murina y realizar su caracterización mediante análisis de MCA. Se obtuvieron alrededor de 2-3 x 106 linfocitos de cada nariz murina. Las células muertas fueron excluidas por tinción FVD. La estrategia de activación para ILC2 entre las células aisladas fue Lin (CD11b, CD11c, CD3 y B220)− CD45+ CD90.2+ células KLRG1+. Todas las puertas se dibujaron en base al isotipo o control FMO. Típicamente, ~ 2% -3% de células Lin-CD45 + se identificaron en la mucosa nasal de ratones de control sanos (Figura 2). El número absoluto de ILC2 en la mucosa nasal murina varía de 2.000 a 4.000.
Luego aislamos los ILC2 de los ratones AR utilizando el método descrito anteriormente. No hubo diferencia en el número absoluto de linfocitos entre los ratones HC y AR. Los resultados de FCM indicaron que la fracción de ILC2s en los ratones AR fue del 9% -14% del número total de linfocitos Lin-CD45+, lo que indica un aumento notable en el número de ILC2s en la mucosa nasal AR en comparación con el de ratones control sanos (Figura 3).
Detectamos la expresión de CD226 en las ILC2. En promedio, el 51,9% de las ILC2 expresaron CD226 en condiciones no inmunizadas, mientras que la proporción promedio de ILC2 que expresaron CD226 fue del 54,8% en los ratones AR, lo que mostró una tendencia no significativa a aumentar en comparación con la de los ratones control. Además de la frecuencia celular, el nivel de expresión de la superficie celular de CD226 también se determinó utilizando la intensidad media de fluorescencia (MFI) que se calculó automáticamente mediante el software de análisis FCM. Curiosamente, la MFI de CD226 fue significativamente regulada al alza en los ratones AR en comparación con los ratones control (Figura 4), lo que indica una expresión elevada de CD226 en las ILC2 de la mucosa nasal alérgica.
Figura 1: Modelo de AR murino inducido por OVA . (A) El diagrama esquemático del establecimiento del modelo AR murino. La frecuencia de frotamiento nasal (B) y estornudos (C) en un período de 10 minutos. Los valores se presentan como media ± desviación estándar (DE) (n = 3). Para la comparación de los dos grupos, se realizó la prueba t de Student; P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de compuerta FCM para ILC2s. Las multinacionales se aislaron como se describió anteriormente. (A) El gráfico de densidad muestra la distribución de MNC aisladas a lo largo de los ejes FSC y SSC. (B) Los singletes fueron cerrados en función de las características del FSC. (C) Las células Lin− se definieron como expresión negativa CD11b, CD11c, CD3 y B220 para excluir las células mieloides, las células B y las células T en las MNC. Las células muertas se excluyeron mediante tinción de colorante de viabilidad reparable (FVD). (D) Las ILC se caracterizan por Lin-CD45+. (E) Las ILC2 están cerradas por CD90.2+ KLRG1+ entre las ILC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ILC2s en la mucosa nasal de ratones sanos y AR. (A) Las imágenes representativas de FCM ilustran las proporciones de ILC2 entre ILC de la mucosa de la cavidad nasal de los grupos control sano (HC) y AR. (B) Las proporciones de ILC2s en lin-células CD45+ en grupos HC y AR. Los valores se presentan como la media ± DE (n = 3). La prueba t de Student se realizó para una comparación de dos grupos. P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión de CD226 en ILC2s de la mucosa nasal. Las ILC2 se caracterizaron utilizando la estrategia antes mencionada. La expresión de CD226 en ILC2s se evaluó mediante FCM. (A) histogramas representativos de la expresión de CD226 en grupos HC y AR; el área azul representa el control CD226 FMO. (B,C) Las proporciones de ILC2 positivas para CD226 y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD226 en el grupo HC y el grupo AR. Los valores se expresan como la media ± DE (n = 3). Se realizó la prueba t de Student para la comparación entre los dos grupos. P < 0,05 fue considerado significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo | Fluorocromo | Clon | Dilución |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/cianina7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PEI | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tabla 1: Cóctel de anticuerpos de tinción superficial.
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Discussion
Las ILC2 están estrechamente asociadas con la inflamación tipo 2 y los trastornos inflamatorios, como lo demuestra un número creciente de estudios. Tanto los modelos de ratón como la observación humana contribuyen a una mejor comprensión de su función en las vías respiratorias superiores. En la fisiopatología del asma, las ILC2 se activan a través de la linfopoyetina del estroma tímico, IL-25 e IL-33, que son producidas principalmente por células epiteliales. Luego, reflejando las células Th2, las ILC2 producen IL-4, IL-5 e IL-13 para agravar la inflamación tipo 232. Además, diferentes subconjuntos de ILC2 también producen IL-10 e IL-1733,34,35. AR también es un tipo de inflamación alérgica de las vías respiratorias impulsada por células tipo 2. La participación de ILC2s en la fisiopatología de la RA ha sido demostrada recientemente14. Sin embargo, los posibles mecanismos reguladores de las ILC2 bajo AR siguen siendo en gran parte desconocidos.
La evidencia indica que la interacción entre diferentes ILC2 puede depender de las moléculas de superficie36. Por ejemplo, tanto los ligandos ICOS como los ICOS expresados en ILC2s son necesarios para su supervivencia y funciones37. Además, las ILC2 también expresan ICAM-1 y LFA-1, que ejercen efectos importantes sobre la migración celular y la interacción célula-célula 7,38. Además, las ILC2 pueden comunicarse con otras células inmunes a través de estas moléculas de la superficie celular. Por ejemplo, OX40L es un mediador dominante para la interacción entre las células T CD4+ y las ILC2 en la inflamación pulmonar39. Debido a que CD226, como molécula coestimuladora transmembrana, se expresa en varias células inmunes, también evaluamos su expresión en ILC2 en tejidos nasales de ratones sanos y AR en este estudio.
El modelado general de RA inducida por OVA incluye sensibilización sistémica intraperitoneal y estimulación local intranasal, que generalmente requieren al menos 3-4 semanas para lograr resultados satisfactoriosde modelado 31. Otro modelo de AR de administración nasal inducida por OVA toma un tiempo similar al método del modelo general para lograr un nivel aproximado de inflamación tipo 2 y síntomas de AR40. Sin embargo, el número y la función de las ILC2 nasales por estos dos métodos de modelado AR aún necesitan más investigación. Se evaluaron los estornudos y el frotamiento nasal para evaluar los síntomas de AR. Aunque sería más convincente incluir la evaluación de la rinorrea, encontramos que es difícil ver la rinorrea sin interferir con el comportamiento de los ratones durante la evaluación, por lo que lamentablemente excluimos estos criterios. Además, la evaluación de los estornudos y el frotamiento nasal podría ser lo suficientemente profunda como para ilustrar la gravedad de los síntomas murinos de AR para muchos de los artículos relevantes que emplearon solo estos dos criterios41,42,43.
Estudios previos sobre ILC2s nasales en ratones han descrito el aislamiento de mucosa nasal murina44,45. Su protocolo es el siguiente: brevemente, retire el tejido blando alrededor del cráneo, abra el hueso nasal para exponer la cavidad nasal y raspe el tejido de la mucosa nasal de la superficie del cráneo con fórceps. Si bien la mayor parte de la mucosa aislada se utilizó para IF, IHC o qPCR, se informa poco sobre el siguiente aislamiento de células mononucleares (MNC) y el análisis de FCM. En este estudio, considerando las bajas cantidades de ILC2s localizadas en la mucosa nasal, la operación retuvo el volumen máximo de la mucosa nasal al digerir toda la nariz en lugar de quitar la mucosa de la superficie del hueso nasal. Para optimizar el protocolo de digestión, evaluamos tres medios digestivos: 0,5 mg/mL de colagenasa IV, 1 mg/mL de colagenasa IV y 1 mg/mL de colagenasa IV y 10 U/mL DNasa I, y comparamos el porcentaje de células vivas y la frecuencia de linfocitos obtenida por estos tres medios digestivos. La proporción de células vivas adquiridas por los tres medios no tiene diferencia (90%-95%); Sin embargo, los dos primeros tipos de digestión fueron inadecuados con menor frecuencia de linfocitos (~ 5%). Por lo tanto, 1 mg / ml de colagenasa IV y 10 U / ml de DNasa I fueron elegidos como el medio de digestión en este estudio. Sin embargo, no se han estudiado otras enzimas como la liberasa y la dispasa que pueden reemplazar a la colagenasa. Dado que el tipo y la concentración de enzimas son críticos para la viabilidad celular y la expresión de moléculas de la superficie celular46,47, el uso y la dosificación de estas alternativas durante la digestión de la nariz aún necesitan una exploración y optimización cuidadosas. Utilizamos FVD eFluor 520 para verificar la viabilidad celular, ya que se puede detectar utilizando un filtro de paso de banda 530/30 que es equivalente a FITC, por lo que podríamos excluir las células muertas mientras se activan las células Lin. Otros colorantes de viabilidad celular también son opcionales de acuerdo con paneles de anticuerpos específicos. Además, en lugar de la tinción intracelular de los factores de transcripción GATA3, que generalmente se realiza en otros estudios relacionados con ILC2, las ILC2 en el presente estudio se caracterizaron en función de marcadores de superficie celular como Lin (CD11b, CD11c, CD3 y B220), CD45, CD90.2 y KLRG1 en el análisis de FCM. Entre ellos, KLRG1 expresado en ILC2s ha sido identificado como un marcador específico de ILC2s de tejido maduro48,49. Aunque CD90.2 es menos específico, todavía se acepta como un marcador de superficie asociado a ILC250. En este estudio, los ratones no se distinguieron por sexo. La investigación ha demostrado que la abundancia y los antígenos de superficie celular de las ILC pulmonares en ratones son diferentes en género, pero la correlación de las ILC2 nasales con el género aún necesita ser estudiada50. Además, el protocolo no se centró en la proporción de otras células hematopoyéticas. Diferentes paneles de anticuerpos FCM ayudarían a resolver este problema.
Este protocolo describió un método para aislar ILC2 de la mucosa nasal murina. Las ILC2 aisladas pueden teñirse para la caracterización de FCM, clasificarse para cultivo celular o estimularse in vitro para análisis adicionales. De acuerdo con los hallazgos de los estudios previos 10,45,51, se observó una acumulación sustancial de ILC2s en la mucosa nasal de ratones AR. En particular, CD226 se expresó en ILC2 locales, y su nivel aumentó significativamente aún más en condiciones alérgicas. Por lo tanto, los hallazgos de este estudio sugieren la participación de CD226 en la RA dependiente de ILC2. Si las ILC2 en pacientes con AR expresan CD226 y si la expresión de CD226 en ILC2 aumenta en condiciones alérgicas deben investigarse en estudios futuros.
En conclusión, establecimos un protocolo para aislar e identificar ILC2s de la mucosa nasal y detectamos la expresión de moléculas de adhesión dentro de ellas. El protocolo requiere una mayor optimización; Sin embargo, la falta de estudios que describan sistemática y minuciosamente el procedimiento para aislar y caracterizar linfocitos, particularmente células linfoides innatas en la mucosa nasal, hace de este protocolo una referencia preliminar para los investigadores que exploran el entorno inmunológico nasal local.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
R.Z. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81871258) y fondos proporcionados por la Cuarta Universidad Médica Militar (No.2020rcfczr). Y.Z. fue apoyado por el Programa de Investigación Básica de Ciencias Naturales de Shaanxi (No. 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 3 Suppl 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A.
- Bousquet, J., et al.
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), Basel, Switzerland. 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
