Summary
Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2), impliquées dans l’inflammation de type 2, participent principalement à la réponse à l’infection par les helminthes, aux maladies allergiques, à l’homéostasie métabolique et à la réparation des tissus. Dans cette étude, une procédure pour isoler les ILC2 de la muqueuse nasale murine et détecter l’expression de CD226 est démontrée.
Abstract
Avec de nombreuses recherches sur les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) publiées au fil des ans, les ILC2 sont largement connues pour être impliquées dans la régulation de divers processus pathologiques, y compris l’immunité anti-helminthes, la réparation des tissus, la thermogenèse et les maladies auto-immunes telles que l’asthme et la rhinite allergique (AR). Les ILC2 résident en permanence dans les tissus périphériques tels que la peau, l’intestin, les poumons et les fosses nasales; Cependant, il existe peu d’informations sur leurs fonctions exactes dans l’immunité de la muqueuse nasale. CD226 est une molécule costimulatrice activatrice, principalement exprimée sur les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules T et les monocytes inflammatoires. Cependant, on ne sait pas si les ILC2 expriment CD226 ou jouent un rôle dans la pathogenèse des maladies liées aux ILC2s. Ici, nous avons établi une méthode pour isoler et identifier les ILC2 de la muqueuse nasale et détecté l’expression de CD226 sur des ILC2 obtenues à partir de souris saines et AR. Nous décrivons ici ce protocole pour l’isolement et l’identification des ILC2 de la muqueuse nasale de souris, ce qui aidera à explorer le mécanisme pathologique interne des troubles immunologiques dans les maladies de la muqueuse nasale.
Introduction
Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2) ont d’abord été découvertes dans les tissus de la cavité péritonéale de souris et leur présence dans le sang et d’autres tissus périphériques tels que les poumons, la peau et les fosses nasales 1,2,3 a été démontrée. En tant que cellules résidentes des tissus, les ILC2 sont principalement maintenues et proliférées localement et fonctionnent comme les premiers gardes répondant aux stimuli nocifs exogènes en produisant de nombreuses cytokines de type 2 et en induisant une immunité de type 2 4,5,6. Les ILC2 peuvent également exercer leurs effets en trafiquant vers les tissus infectés 7,8.
Semblables aux cellules T-helper 2 (Th2), les réseaux régulateurs complexes des ILC2 assurent leur implication significative dans la progression de diverses maladies inflammatoires de type 2, y compris les maladies allergiques des voies respiratoires 8,9. Dans l’asthme, les alarmines dérivées des cellules épithéliales peuvent activer les ILC2, qui favorisent davantage l’inflammation pulmonaire par la sécrétion d’interleukine (IL)-4, IL-5 et IL-1310. Des études cliniques ont également indiqué que les taux d’ILC2 étaient significativement élevés dans les expectorations et le sang des patients souffrant d’asthme sévère, suggérant une association des ILC2 avec la gravité de l’asthme et leur fonction en tant que prédicteur de la progression de l’asthme11.
La rhinite allergique (RA) est une maladie inflammatoire chronique courante qui touche des millions de personnes chaque année, et les traitements efficaces pour cette maladie sont limités12,13. Les ILC2 jouent un rôle crucial dans la physiopathologie de l’AR, que ce soit dans la phase de sensibilisation ou la génération de symptômes et la phased’inflammation 14. Chez les patients atteints d’EI, les taux d’ILC2 dans le sang périphérique ont été signalés comme étant élevés à la fois localement et systémiquement15. Cependant, certains effets et mécanismes sous-jacents des ILC2 sur la physiopathologie et la progression de l’AR nécessitent encore une exploration plus approfondie.
CD226 - une glycoprotéine transmembranaire qui sert de molécule costimulatrice - est principalement exprimée sur les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules T et d’autres monocytes inflammatoires16,17. L’interaction de CD226 et de ses ligands (CD155 et/ou CD112) ou concurrent (TIGIT) lui permet de participer aux fonctions biologiques de diverses cellules immunitaires18. La liaison des ligands sur les cellules présentatrices d’antigènes à CD226 sur lymphocyte cytotoxique (CTL) favorise l’activation des deux cellules simultanément, tandis que l’activation de CTL peut être davantage supprimée par TIGIT (immunorécepteur des cellules T avec domaines Ig et ITIM), le concurrent de CD22619,20. Une étude ex vivo humaine a révélé que CD226 et CD155 sur les lymphocytes T régulent l’équilibre entre Th1/Th17 et Th2 en modulant différentiellement les sous-ensemblesTh 21. CD226 peut également arbitrer l’adhérence plaquettaire et l’activité de destruction tumorale NK22,23. Pendant ce temps, CD226 est bien étudié dans la pathogenèse de diverses maladies infectieuses, maladies auto-immunes et tumeurs 18,24,25. À l’heure actuelle, CD226 est devenu un nouveau point positif pour l’immunothérapie. Des études ont montré que les vésicules extracellulaires peuvent inverser l’expression de CD226 sur les cellules NK pour rétablir leur activité cytotoxique et intervenir dans la progression du cancer du poumon26. Une étude récente a révélé un sous-groupe d’ILC du groupe 3 intestinal fœtal caractérisé par une expression élevée de CD226 par séquençage d’ARN unicellulaire27, ce qui indique que CD226 pourrait exercer des rôles dans l’immunité à médiation cellulaire lymphoïde innée.
Nos connaissances sur les ILC2 dans l’inflammation des voies respiratoires sont principalement basées sur des études sur l’asthme; Cependant, on sait peu de choses sur leurs fonctions dans l’immunité de la muqueuse nasale. Ainsi, un protocole a été établi pour isoler et identifier les ILC2 de la muqueuse nasale. L’étude se concentre sur l’expression de CD226 sur les ILC2 dans les tissus nasaux et sa variation entre les souris saines et les souris AR. Cela peut fournir de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents de la régulation médiée par ILC2 dans l’immunité locale et servir de base au développement de nouvelles approches pour le traitement des EI.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux Lignes directrices sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures et protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique de la recherche scientifique de la quatrième Université médicale militaire (n ° 20211008).
1. Etablissement modèle de RA murin
- Hébergez les souris mâles et femelles de type sauvage (WT) C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes et fournissent de l’eau et de l’eau de laboratoire standard.
- Émulsionner 50 μg d’ovalbumine (OVU) dans 0,2 mL de PBS stérile contenant 2 mg d’hydroxyde d’aluminium sur une table propre pour maintenir la stérilité. Les jours 0, 7 et 14, injecter par voie intrapéritonéale à des souris femelles ou mâles 50 μg d’OVULES émulsionnés.
- Les jours 21, 22, 23, 24 et 25, instiller par voie intranasale des souris contenant 50 μg d’OVA dissous dans 30 μL de PBS stérile (15 μL par narine) sous anesthésie par inhalation (2-3% d’isoflurane avec un débit d’oxygène ou 0,5 L / min).
- Euthanasier les souris 24 h après le dernier défi (jour 26).
2. Isolement des cellules mononucléées (MNC) de la muqueuse nasale
- Euthanasier les souris par luxation cervicale sous anesthésie profonde. Trempez la tête des souris dans de l’éthanol à 75% pendant 5 minutes et évitez que l’éthanol ne pénètre dans la narine externe. Placez l’abdomen vers le bas sur la table d’opération.
- Coupez les dents antérieures. À la ligne médiane de la tête, faites une incision et coupez la peau à l’aide de ciseaux.
- Retirez la mâchoire inférieure, coupez tout le nez le long de l’extrémité du palais et placez le mouchoir dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 5 ml de PBS glacé. À l’aide de ciseaux et de forceps, retirez la chair et les muscles adhérant aux os.
- Transférer le nez de la souris dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm contenant 5 ml de PBS glacé. Lavez les os deux fois avec 5 ml de PBS glacé.
- Transférer le nez dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Écraser suffisamment et transférer le nez dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de tampon de digestion préchauffé (milieu RPMI 1640 complété par 1 mg/mL de collagénase IV et 10 U/mL de DNase I).
- Fixez le couvercle et placez le tube verticalement dans un agitateur orbital à 37 °C, avec agitation continue à 120-150 tr/min pendant 40 min.
REMARQUE: Préchauffez le tampon de digestion à 37 ° C pour obtenir l’activité enzymatique la plus élevée. - Ajouter 5 mL de milieu glacé RPMI 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) pour arrêter le processus de digestion.
- Filtrer à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour éliminer les fragments solides.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min, puis jeter délicatement le surnageant.
- Resuspendre la pastille dans un milieu RPMI 1640 glacé et centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Jetez délicatement le surnageant.
- Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 4 mL de milieu à gradient de densité à 40 % (160 μL de PBS 10x + 1,44 mL de solution mère de gradient de densité + 2,4 mL de milieu RPMI 1640).
- Insérez délicatement une pipette Pasteur au fond du tube et ajoutez lentement 2,5 mL de milieu gradient de densité à 80 % (200 μL de 10x PBS + 1,8 mL de solution mère de gradient de densité + 0,5 mL de milieu RPMI 1640).
- Régler le taux d’accélération et de décélération de la centrifugeuse à un niveau inférieur au troisième rapport et la centrifugeuse à 400 x g pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Enlevez la couche supérieure d’impuretés avant de vider les cellules à l’interface pour éviter toute contamination potentielle. Égoutter délicatement la couche de cellules mononucléaires (MNC) à l’interface de média à gradient de densité de 40 %/80 % dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de PBS glacé à l’aide d’une pipette. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois.
3. Coloration de surface pour l’analyse des matériaux destinés à l’alimentation des producteurs
- Récolter les cellules et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendre la pastille de la cellule dans un tampon de coloration (PBS complété par 2% FBS et 0,1%NaN3) et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
ATTENTION : Soyez prudent lors de la préparation du tampon de coloration. Le NaN3 est très toxique et peut endommager les organes s’il est avalé, inhalé ou en contact avec la peau. Évitez également les rejets dans l’environnement. - Remettez les cellules en suspension dans une solution bloquante de 80 μL (anticorps anti-CD16/32 (1:100) dilué dans un tampon de coloration) par tube. Incuber pendant 30 min dans l’obscurité à 4 °C.
- Sans lavage, ajouter 20 μL de la dilution appropriée du cocktail d’anticorps colorant la surface (tableau 1).
- Ajouter 1 μL (par test) de colorant de viabilité fixable 520 (FVD) juste avant d’ajouter le cocktail d’anticorps aux échantillons. Incuber dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Définissez les anticorps d’isotype correspondant et la fluorescence moins un (FMO) comme témoins négatifs.
- Laver les cellules dans 500 μL de tampon de coloration par centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 200 μL de tampon de coloration. Ajouter 50 μL de billes de comptage absolu vortex aux cellules colorées et agiter. Soumettez-les à une analyse de cytométrie en flux (FCM).
REMARQUE : Les données FCM ont été obtenues à l’aide d’un analyseur de cellules spectrales et analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux (FCM).
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Representative Results
Un modèle murin induit par OVA a été développé pour explorer le rôle des ILC2 dans la RA. La construction du modèle murin AR était basée sur des études antérieures avec de légères modifications 28,29,30,31. Une vidéo de 10 minutes a été capturée pour mesurer la fréquence des éternuements et des éternuements nasaux après le dernier défi nasal. Les symptômes allergiques des souris AR induites par les OVULES ont été présentés à la figure 1. La fréquence des frottements nasaux et des éternuements chez les souris AR était significativement plus élevée que dans le groupe témoin.
Ensuite, nous avons décrit une procédure pour isoler les MNC de la muqueuse nasale murine et effectuer leur caractérisation à l’aide de l’analyse FCM. Environ 2-3 x 106 lymphocytes ont été obtenus à partir de chaque nez murin. Les cellules mortes ont été exclues par coloration FVD. La stratégie de déclenchement des ILC2 parmi les cellules isolées était Lin (cellules CD11b, CD11c, CD3 et B220) – CD45+ CD90.2+ KLRG1+. Toutes les portes ont été dessinées en fonction de l’isotype ou du contrôle FMO. En règle générale, ~2 % à 3 % des cellules Lin− CD45+ ont été identifiées dans la muqueuse nasale de souris témoins saines (figure 2). Le nombre absolu d’ILC2 dans la muqueuse nasale murine varie de 2 000 à 4 000.
Nous avons ensuite isolé les ILC2 des souris AR en utilisant la méthode décrite ci-dessus. Il n’y avait pas de différence dans le nombre absolu de lymphocytes entre les souris HC et AR. Les résultats de la FCM ont indiqué que la fraction d’ILC2 chez les souris AR représentait de 9 % à 14 % du nombre total de lymphocytes Lin− CD45+ , ce qui indique une augmentation remarquable du nombre d’ILC2 dans la muqueuse nasale AR par rapport à celle des souris témoins saines (Figure 3).
Nous avons détecté l’expression de CD226 sur les ILC2. En moyenne, 51,9% des ILC2 exprimaient CD226 dans des conditions non immunisées, tandis que le rapport moyen des ILC2 exprimant CD226 était de 54,8% chez les souris AR, ce qui a montré une tendance non significative à augmenter par rapport à celle des souris témoins. En plus de la fréquence cellulaire, le niveau d’expression de CD226 à la surface de la cellule a également été déterminé à l’aide de l’intensité de fluorescence moyenne (ICM) calculée automatiquement par le logiciel d’analyse FCM. Fait intéressant, l’IMF de CD226 a été significativement régulée à la hausse chez les souris AR par rapport aux souris témoins (Figure 4), indiquant une expression élevée de CD226 sur les ILC2 de la muqueuse nasale allergique.
Figure 1 : Modèle d’EI murin induit par les ovova. (A) Le diagramme schématique de l’établissement du modèle de RA murin. La fréquence des frottements nasaux (B) et des éternuements (C) sur une période de 10 minutes. Les valeurs sont présentées sous forme d’écart type moyen ± (ET) (n = 3). Pour comparer les deux groupes, le test t de Student a été effectué; P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie d’établissement de points de contrôle de la FCM pour les ILC2. Les multinationales ont été isolées comme décrit ci-dessus. (A) Le graphique de densité montre la répartition des multinationales isolées le long des axes FSC et SSC. (B) Les singlets ont été fermés sur la base des caractéristiques FSC. (C) Les cellules Lin− ont été définies comme expression négative CD11b, CD11c, CD3 et B220 pour exclure les cellules myéloïdes, les cellules B et les cellules T dans les MNC. Les cellules mortes ont été exclues au moyen d’une coloration par colorant de viabilité fixable (FVD). (D) Les ILC sont caractérisées par Lin− CD45+. (E) Les ILC2 sont fermées par CD90.2+ KLRG1+ parmi les ILC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : ILC2 dans la muqueuse nasale de souris saines et AR. (A) Des images FCM représentatives illustrent les proportions d’ILC2 parmi les ILC de la muqueuse des fosses nasales des groupes témoins sains (HC) et AR. (B) Les proportions d’ILC2 dans les cellules Lin− CD45+ dans les groupes HC et AR. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (n = 3). Le test t de Student a été effectué pour une comparaison entre deux groupes. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expression de CD226 dans les ILC2 de la muqueuse nasale. Les ILC2 ont été caractérisés à l’aide de la stratégie susmentionnée. L’expression de CD226 sur les ILC2 a été évaluée à l’aide de FCM. (A) Histogrammes représentatifs de l’expression de CD226 dans les groupes HC et AR; la zone bleue représente le contrôle FMO CD226. (B,C) Les proportions d’ILC2 CD226-positives et l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) de CD226 dans le groupe HC et le groupe AR. Les valeurs sont exprimées sous la forme de la moyenne ± ET (n = 3). Le test t de Student a été effectué pour la comparaison entre les deux groupes. P < 0,05 a été jugé significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Anticorps | Fluorochrome | Clone | Dilution |
| CD11b | FITC | M1/70 | 1:100 |
| CD11c | FITC | N418 | 1:200 |
| CD226 | PE/Cyanine7 | 10E5 | 1:50 |
| CD3e | FITC | 145-2C11 | 1:100 |
| CD45 | Alexa Fluor 700 | 30-F11 | 1:200 |
| CD45R(B220) | FITC | RA3-6B2 | 1:100 |
| CD90.2 | PE | 30-H12 | 1:100 |
| KLRG1 | APC | 2F1 | 1:160 |
Tableau 1 : Cocktail d’anticorps colorants de surface.
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Discussion
Les ILC2 sont étroitement associées à l’inflammation de type 2 et aux troubles inflammatoires, comme le démontrent un nombre croissant d’études. Les modèles murins et l’observation humaine contribuent à une meilleure compréhension de sa fonction dans les voies respiratoires supérieures. Dans la physiopathologie de l’asthme, les ILC2 sont activées par la lymphopoïétine stromale thymique, l’IL-25 et l’IL-33, qui sont principalement produites par les cellules épithéliales. Ensuite, reflétant les cellules Th2, les ILC2 produisent IL-4, IL-5 et IL-13 pour aggraver l’inflammation de type 232. En outre, différents sous-ensembles d’ILC2 produisent également de l’IL-10 et de l’IL-1733,34,35. L’AR est également un type d’inflammation allergique des voies respiratoires provoquée par les cellules de type 2. La participation des ILC2 à la physiopathologie de l’AR a été démontrée récemment14. Cependant, les mécanismes de régulation potentiels des ILC2 dans le cadre de l’AR restent largement inconnus.
Les preuves indiquent que l’interaction entre différentes ILC2 peut reposer sur les molécules de surface36. Par exemple, les ligands ICOS et ICOS exprimés sur les ILC2 sont nécessaires à leur survie et à leurs fonctions37. En outre, les ILC2 expriment également ICAM-1 et LFA-1, qui exercent des effets importants sur la migration cellulaire et l’interaction cellule-cellule 7,38. De plus, les ILC2 peuvent diaphoner avec d’autres cellules immunitaires à travers ces molécules de surface cellulaire. Par exemple, OX40L est un médiateur dominant pour l’interaction entre les lymphocytes T CD4+ et les ILC2 dans l’inflammation pulmonaire39. Parce que CD226, en tant que molécule costimulatrice transmembranaire, s’exprime sur diverses cellules immunitaires, nous avons également évalué son expression sur les ILC2 dans les tissus nasaux de souris saines et AR dans cette étude.
La modélisation générale des EI induite par les OVUs comprend la sensibilisation systémique intrapéritonéale et la stimulation locale intranasale, qui nécessitent généralement au moins 3 à 4 semaines pour obtenir des résultats de modélisation satisfaisants31. Un autre modèle d’EI d’administration nasale uniquement induite par les OVULES prend un temps similaire à celui de la méthode du modèle général pour atteindre un niveau approximatif d’inflammation de type 2 et de symptômes d’EI40. Cependant, le nombre et la fonction des ILC2 nasales par ces deux méthodes de modélisation AR nécessitent encore des recherches supplémentaires. Nous avons évalué les éternuements et les frottements nasaux pour évaluer les symptômes de l’AR. Bien qu’il serait plus convaincant d’inclure l’évaluation de la rhinorrhée, nous avons constaté qu’il était difficile d’apercevoir la rhinorrhée sans interférer avec le comportement des souris lors de l’évaluation, nous avons donc malheureusement exclu ces critères. En outre, l’évaluation des éternuements et des frottements nasaux pourrait être suffisamment approfondie pour illustrer la gravité des symptômes de RA murins pour de nombreux articles pertinents qui n’utilisaient que ces deux critères41,42,43.
Des études antérieures sur des souris ILC2 nasales ont décrit l’isolement de la muqueuse nasale murine44,45. Leur protocole est le suivant: Brièvement, retirez les tissus mous autour du crâne, ouvrez l’os nasal pour exposer la cavité nasale et grattez le tissu de la muqueuse nasale de la surface du crâne avec une pince. Bien que la majeure partie de la muqueuse isolée ait été utilisée pour la FI, l’IHC ou la qPCR, peu de choses sont rapportées sur l’isolement suivant des cellules mononucléaires (MNC) et l’analyse FCM. Dans cette étude, compte tenu des faibles quantités d’ILC2 situées dans la muqueuse nasale, l’opération a conservé le volume maximal de la muqueuse nasale en digérant tout le nez au lieu de dépouiller la muqueuse de la surface de l’os nasal. Pour optimiser le protocole de digestion, nous avons évalué trois milieux de digestion : 0,5 mg/mL de collagénase IV, 1 mg/mL de collagénase IV et 1 mg/mL de collagénase IV et 10 U/mL de DNase I, et comparé le pourcentage de cellules vivantes et la fréquence lymphocytaire obtenus par ces trois milieux digestifs. La proportion de cellules vivantes acquises par les trois milieux n’a pas de différence (90%-95%); Cependant, les deux premiers types de digestion étaient inadéquats avec une fréquence lymphocytaire plus faible (~5%). Ainsi, 1 mg/mL de collagénase IV et 10 U/mL de DNase I ont été choisis comme milieu de digestion dans cette étude. Cependant, d’autres enzymes telles que la liberase et la dispase qui peuvent remplacer la collagénase n’ont pas été étudiées. Étant donné que le type et la concentration d’enzymes sont essentiels à la viabilité cellulaire et à l’expression des molécules à la surface cellulaire46,47, l’utilisation et le dosage de ces alternatives pendant la digestion du nez nécessitent encore une exploration et une optimisation minutieuses. Nous avons utilisé FVD eFluor 520 pour vérifier la viabilité des cellules, car il peut être détecté à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30 équivalent à FITC, de sorte que nous pouvions exclure les cellules mortes lors de la gation des cellules Lin. D’autres colorants de viabilité cellulaire sont également facultatifs selon des panels d’anticorps spécifiques. De plus, au lieu de la coloration intracellulaire des facteurs de transcription GATA3, qui est habituellement réalisée dans d’autres études liées à l’ILC2, les ILC2 de la présente étude ont été caractérisées sur la base de marqueurs de surface cellulaire tels que Lin (CD11b, CD11c, CD3 et B220), CD45, CD90.2 et KLRG1 dans l’analyse FCM. Parmi eux, KLRG1 exprimé sur ILC2s a été identifié comme un marqueur spécifique des ILC2s tissulaires matures48,49. Bien que CD90.2 soit moins spécifique, il est toujours accepté comme marqueur de surface50 associé à l’ILC2. Dans cette étude, les souris n’ont pas été distinguées par sexe. La recherche a montré que l’abondance et les antigènes de surface cellulaire des ILC pulmonaires chez la souris sont différents selon le sexe, mais la corrélation des ILC2 nasales avec le sexe doit encore être étudiée50. De plus, le protocole ne portait pas sur la proportion d’autres cellules hématopoïétiques. Différents panels d’anticorps FCM aideraient à résoudre ce problème.
Ce protocole décrivait une méthode pour isoler les ILC2 de la muqueuse nasale murine. Les ILC2 isolés peuvent être colorés pour la caractérisation de la MCDA, triés pour la culture cellulaire ou stimulés in vitro pour des analyses plus approfondies. Conformément aux résultats des études précédentes 10,45,51, une accumulation substantielle d’ILC2 a été observée dans la muqueuse nasale de souris AR. Notamment, CD226 a été exprimé sur les ILC2 locaux, et son niveau a considérablement augmenté dans les conditions allergiques. Par conséquent, les résultats de cette étude suggèrent l’implication de CD226 dans l’EI ILC2-dépendant. La question de savoir si les ILC2 chez les patients atteints d’EI expriment CD226 et si l’expression de CD226 sur les ILC2 augmente dans les conditions allergiques devrait être étudiée dans les études futures.
En conclusion, nous avons établi un protocole pour isoler et identifier les ILC2 de la muqueuse nasale et détecté l’expression de molécules d’adhésion en leur sein. Le protocole nécessite une optimisation supplémentaire; Cependant, le manque d’études décrivant systématiquement et minutieusement la procédure d’isolement et de caractérisation des lymphocytes, en particulier des cellules lymphoïdes innées de la muqueuse nasale, fait de ce protocole une référence préliminaire pour les chercheurs explorant l’environnement immunologique nasal local.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
R.Z. a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81871258) et des fonds fournis par la quatrième Université médicale militaire (n ° 2020rcfczr). Y.Z. a été soutenu par le Programme de recherche fondamentale en sciences naturelles du Shaanxi (n ° 2021JM-081).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
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