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Préparation protéomique unicellulaire pour l’analyse par spectrométrie de masse par lyse de la chaleur glaciale et support isobare

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802
Automatic Translation
*1, 1,2,3, *1
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University
* These authors contributed equally

Summary

Dans ce protocole, nous décrivons comment préparer des cellules de mammifères pour l’analyse protéomique unicellulaire par spectrométrie de masse à l’aide de réactifs et d’équipements disponibles dans le commerce, avec des options pour le pipetage manuel et automatique.

Abstract

L’analyse protéomique unicellulaire nécessite des méthodes sensibles, quantitativement précises, largement accessibles et robustes. Pour répondre à ces exigences, le protocole SCoPE2 (Single-Cell ProtEomics) a été développé comme une méthode de deuxième génération pour quantifier des centaines à des milliers de protéines à partir d’échantillons limités, jusqu’au niveau d’une seule cellule. Les expériences utilisant cette méthode ont permis de quantifier plus de 3 000 protéines sur 1 500 cellules de mammifères uniques (500 à 1 000 protéines par cellule) en 10 jours d’instrument de spectromètre de masse. SCoPE2 tire parti d’un cycle de congélation-chaleur pour la lyse cellulaire, évitant ainsi le besoin de nettoyer les cellules individuelles et, par conséquent, réduisant les pertes d’échantillons, tout en accélérant la préparation des échantillons et en simplifiant leur automatisation. De plus, la méthode utilise un support isobare, ce qui facilite l’identification des protéines et réduit les pertes d’échantillons.

Ce protocole vidéo fournit des conseils détaillés pour permettre l’adoption de l’analyse automatisée des protéines unicellulaires en utilisant uniquement des équipements et des réactifs largement accessibles. Nous démontrons les étapes critiques de la procédure de préparation des cellules individuelles pour l’analyse protéomique, de la récolte à l’injection en passant par l’analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). De plus, les spectateurs sont guidés à travers les principes de la conception expérimentale avec le support isobare, le contrôle de la qualité pour les préparations de support isobare et de cellule unique, et des résultats représentatifs avec une discussion sur les limites de l’approche.

Introduction

L’analyse unicellulaire est largement utilisée pour étudier le niveau d’hétérogénéité au sein des systèmes biologiques qui serait autrement indiscernable par des mesures en vrac 1,2,3. Une telle diversité cellulaire peut avoir des conséquences fonctionnelles qui peuvent approfondir la compréhension des processus biologiques intégraux, de la résistance thérapeutique des cellules cancéreuses 4,5,6 à l’hétérogénéité de cellule à cellule dans le diabète 7,8,9,10. De nombreuses recherches se sont concentrées sur la mesure des acides nucléiques dans des cellules individuelles, en mesurant les niveaux génétiques ou transcriptomiques et ont permis la classification des types et des états cellulaires. De tels progrès dans le domaine des acides nucléiques, cependant, ne peuvent pas combler le manque de connaissances sur la régulation post-transcriptionnelle11, ce qui rend nécessaire des mesures protéiques à haut débit similaire dans des cellules individuelles12,13,14,15.

Nous avons développé SCoPE216,17 pour répondre à la demande de protéomique unicellulaire rigoureuse et robuste des systèmes de mammifères. Il s’agit d’une méthode multiplexée, permettant d’augmenter le débit en marquant et en analysant de nombreuses cellules en parallèle18, contrairement aux mthods sans marquage qui analysent une cellule à la fois19,20. La méthodologie de préparation des échantillons, l’approche de spectrométrie de masse et les étapes ultérieures d’analyse des données permettent une quantification précise de centaines à des milliers de protéines par cellule. Cette méthode rend possible l’analyse par spectrométrie de masse de cellules individuelles grâce au support isobare21, un petit échantillon global de cellules (généralement 25-200) biologiquement similaire à la population unicellulaire d’intérêt. Ce matériau porteur est multiplexé dans un ensemble avec un canal de référence du même matériau et des cellules uniques grâce à l’utilisation d’étiquettes de masse en tandem (étiquettes TMT). Le canal porteur réduit la perte d’échantillon sur les surfaces et fournit les fragments de squelette ionique pour une identification réussie des peptides. Le canal de référence, qui est préparé en vrac puis dilué jusqu’à 5-10 équivalents de cellules pour chaque ensemble de cellules individuelles, aide à contrôler la variabilité technique de l’analyse. Plus précisément, la référence permet la normalisation de la variabilité causée par les effets liés à la LC-MS/MS, tels que l’échantillonnage ionique et l’efficacité de l’ionisation. Habituellement, les canaux de référence et de support sont fabriqués à partir de la même population cellulaire.

Ce protocole de préparation d’échantillons est une méthode de deuxième génération basée sur SCoPE-MS22 par de multiples améliorations synergiques. Les améliorations comprennent une méthode de lyse cellulaire qui évite le nettoyage des échantillons, qui est une étape courante des préparations protéomiques de SEP. Il utilise mPOP (préparation d’échantillons protéomiques minimal)23, qui est une méthode de lyse par congélation. Cette méthode a permis la lyse de cellules individuelles dans des volumes plus petits et dans des plaques multipuits plutôt que dans des flacons, facilitant un débit plus élevé et l’automatisation par les thermocycleurs. Dans l’ensemble, cette méthode a réduit le coût par cellule unique et augmenté la précision quantitative par rapport à SCoPE-MS16,24.

Ce protocole décrit comment préparer des cellules individuelles pour l’analyse protéomique, y compris comment préparer les canaux porteurs et de référence à l’aide de marqueurs isobares TMTpro 18-plex. Les cellules de mammifères qui sont en suspension unicellulaire et qui peuvent être isolées dans des plaques de 384 puits sont probablement assujetties à ce protocole. Sont également inclus des résultats représentatifs d’ensembles monocellulaires réussis, affichant plusieurs graphiques de contrôle de la qualité générés par une application R Shiny, DO-MS25. D’autres outils logiciels publiés 26,27 et des directives expérimentales 17,21 ont amélioré l’adoption de ce protocole. Nous espérons que ce guide visuel aidera davantage les chercheurs à effectuer des expériences de protéomique unicellulaire.

Protocol

NOTE: Dans ce protocole, la température ambiante (RT) est de 18-22 ° C.

1. Production de supports et de matériaux de référence

  1. Isolement cellulaire
    1. Recueillir les cellules d’intérêt dans des suspensions cellulaires dans 1x PBS glacé.
      NOTA : Si possible, le support et le matériel de référence doivent être préparés à partir de la ou des populations cellulaires choisies pour être étudiées au niveau de la cellule unique. Un nombre similaire de cellules provenant de différentes conditions expérimentales (telles que les cellules immunitaires stimulées et non stimulées) devrait constituer le support et la référence. Dans les situations où un nombre suffisant de ces cellules ne peut pas être récolté, une population cellulaire appropriée doit être sélectionnée en fonction de la similitude biologique.
    2. À l’aide d’un hémocytomètre ou d’un autre moyen de comptage cellulaire (comme le FACS), comptez le nombre de cellules dans la suspension.
    3. Faire tourner et remettre en suspension 22 000 cellules de chaque type de cellule dans 11 μL d’eau de qualité CLHP, séparément dans des tubes PCR (tubes PCR standard de 250 μL).
      NOTE: Le nombre de cellules indiqué ici est suffisant pour les supports et les références pour le nombre d’ensembles qui peuvent être préparés à partir d’une plaque de 384 puits pleine de cellules individuelles. L’entrée de cellule dans cette étape et les quantités de réactifs dans les étapes suivantes peuvent être mises à l’échelle proportionnellement pour un plus grand nombre d’ensembles. La vitesse de rotation dépend des pratiques de culture cellulaire du laboratoire. Un spin down typique : 300 × g pendant 5 min.
    4. Transférer les échantillons dans un congélateur à -80 °C pendant au moins 30 min.
      POINT DE PAUSE: Les échantillons peuvent rester congelés pendant plusieurs mois sans conséquences pour les données d’une seule cellule.
  2. Lyse cellulaire
    1. Chauffer le tube PCR avec les cellules à 90 °C pendant 10 min (avec le couvercle du thermocycleur réglé à 105 °C), puis laisser refroidir les tubes à 12 °C juste après le cycle de chauffage.
    2. Vortex brièvement le tube, puis tournez-le vers le bas dans un tube PCR de paillasse à RT pour recueillir tout le liquide au fond du tube.
    3. Dans un sonicateur au bain-marie, soniquer les tubes pendant 5 min, puis les placer sur de la glace à TA.
  3. Digestion de la trypsine
    1. Ajouter 2,2 μL du mélange principal (voir le tableau 1 pour les composants) à chaque tube à échantillon sur la glace.
      ATTENTION: La trypsine peut causer une irritation de la peau, des voies respiratoires et des yeux. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle. Manipuler sous une hotte chimique.
    2. Vortex brièvement les tubes pour mélanger et faire tourner vers le bas dans un tube PCR de paillasse à RT pour recueillir tout le liquide au fond de chaque tube.
    3. Chauffer les échantillons à 37 °C pendant 3 h (le couvercle du thermocycleur étant réglé à 52 °C).
  4. Réaction de marquage TMT
    1. Faites tourner les échantillons après la digestion dans un tube PCR de paillasse à RT.
    2. Divisez chaque échantillon en deux volumes égaux de 6,6 μL chacun, de sorte que chaque tube contienne 11 000 cellules.
    3. Aux tubes destinés au support, ajouter 3,3 μL de TMT label 126 qui a été remis en suspension à une concentration de 85 mM.
    4. Aux tubes destinés à la référence, ajouter 3,3 μL de TMT label 127N qui a été remis en suspension à une concentration de 85 mM.
    5. Vortex brièvement les tubes et tournez-les vers le bas dans un tube PCR de paillasse à RT pour recueillir le liquide au fond.
    6. Laisser les tubes à TA pendant 1 h.
  5. Trempe de la réaction de marquage TMT
    1. Ajouter 1,65 μL d’hydroxylamine à 0,5 % dans chaque tube.
      ATTENTION : L’hydroxylamine peut provoquer une irritation de la peau. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle.
    2. Vortex brièvement les tubes et tournez-les vers le bas dans un tube PCR de paillasse à RT pour recueillir le liquide au fond.
    3. Laisser les tubes à TA pendant 30 min.
  6. Combinaison du transporteur et de la référence
    1. Si les échantillons qui constitueront le support ont été étiquetés séparément, mélangez-les dans des proportions égales.
    2. Si les échantillons qui constitueront la référence ont été étiquetés séparément, mélangez-les dans des proportions égales.
    3. Mélanger le support et la référence de manière à ce que la concentration finale du support soit de 100 à 200 cellules/μL et que la concentration de référence soit de 5 à 10 cellules/μL.
    4. Évaluer la qualité du support et des matériaux de référence avant de les combiner avec des ensembles de cellules uniques.
      NOTE: Le contrôle de la qualité du support et du matériau de référence peut être effectué par diverses méthodes, mais il est recommandé d’utiliser le logiciel DO-MS, disponible au do-ms.slavovlab.net17. Les mesures critiques de la qualité comprennent le taux de discordage (<25%, une mesure calculée comme le nombre de peptides identifiés avec certitude avec un clivage manqué divisé par le nombre total de peptides identifiés avec confiance) et l’efficacité du marquage (>99%, une mesure calculée comme le nombre de sites de marquage, à savoir le peptide N-terminus et la lysine, avec une étiquette divisée par le nombre total de sites d’étiquetage).
      POINT DE PAUSE: Le support et les matériaux de référence peuvent être stockés à -80 ° C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.
Composant Concentration du mélange Concentration finale par tube
Trypsine Or 50 ng/μL 8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5 500 mM 83,33 mM
Benzonase nucléase 1,2 unités 0,2 unité

Tableau 1 : Quantité de réactif du mélange maître. Les concentrations finales de réactifs nécessaires à la digestion de la trypsine sont énumérées.

2. Préparation de l’échantillon SCoPE2

  1. Isolement cellulaire
    1. Complétez l’eau de qualité CLHP avec 25 fmol par peptide par μL d’une solution peptidique synthétique.
      REMARQUE: La solution peptidique Waters MassPrep est un exemple de ce qui peut être utilisé. Il est composé de sept peptides qui ne s’ionisent pas très bien. C’est un aspect clé de cette solution: ces peptides n’interfèrent pas avec la quantification précise de la spectrométrie de masse des cellules individuelles. Tout mélange hautement purifié de quelques peptides peu susceptibles de se trouver dans les échantillons d’intérêt sera approprié.
    2. Ajouter 1 μL de ce mélange à chaque puits d’une plaque de 384 puits à l’aide d’un robot distributeur de liquide ou d’une pipette manuelle.
    3. Scellez la plaque et faites-la tourner vers le bas dans un essoreuse de plaque de paillasse à RT pour recueillir le liquide au fond.
      POINT DE PAUSE: Les plaques contenant cette solution peuvent être conservées à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires.
    4. Obtenez une suspension de cellules non fixées qui sont désagrégées.
      REMARQUE: La façon exacte dont la suspension cellulaire est obtenue est basée sur le type de cellule d’intérêt. En voici quelques exemples généraux :
      1. Cellules en suspension: faites tourner les cellules en une pastille et retirez le milieu de culture cellulaire.
      2. Cellules adhérentes : retirer les cellules de la capsule ou du flacon par trypsinisation ou grattage. Ensuite, faites-les tourner vers le bas pour retirer le milieu de culture cellulaire.
    5. Lavez la suspension cellulaire deux fois avec 1x PBS glacé. Laissez les cellules en suspension dans 1x PBS après le deuxième lavage.
    6. Si la plaque de 384 puits a été gelée, décongelez-la à RT. Faites-la tourner vers le bas pour vous assurer que tout le liquide est au fond des puits.
    7. Utilisez un trieur de cellules ou d’autres moyens disponibles, tels que la cueillette manuelle, pour distribuer les cellules individuelles dans les puits respectifs.
      NOTE: Ajouter des cellules individuelles aux puits tout en laissant certains puits vides pour les contrôles négatifs et positifs (voir la discussion). Lorsque vous utilisez la cytométrie en flux, utilisez le débit le plus bas possible pour le cytomètre en flux. On pense qu’un débit plus faible est plus doux pour la manipulation des cellules. De plus, la taille de la buse doit être appropriée pour une utilisation avec les cellules d’intérêt. Il est recommandé de collaborer avec une installation de cytométrie en flux.
    8. Ajouter des contrôles positifs de 2 à 5 équivalents cellulaires lysat à des puits sélectionnés pipetés manuellement ou avec des robots de manipulation de liquides.
    9. Scellez et faites tourner la plaque avec des cellules triées dans un essoreuse de plaque de paillasse à RT pour recueillir le liquide au fond. Congeler la plaque à -80 °C dès que possible.
      POINT DE PAUSE: Les plaques avec des cellules individuelles triées peuvent être stockées à -80 ° C jusqu’à ce que nécessaire.
  2. Lyse cellulaire
    1. Prenez la plaque de 384 puits avec les cellules individuelles triées et mettez-la dans le thermocycleur le plus rapidement possible.
    2. Chauffer la plaque à 90 °C pendant 10 min (avec la température du couvercle réglée sur 105 °C), puis laisser refroidir la plaque à 12 °C.
    3. Faites tourner brièvement la plaque dans un spinner de plaque de paillasse chez RT.
    4. Dans un sonicateur au bain-marie, soniquer la plaque pendant 5 minutes à TA, puis la placer sur de la glace.
  3. Digestion de la trypsine
    1. Préparer 100 μL du mélange maître (voir le tableau 1 pour les composants) par plaque de 384 puits.
    2. À chaque puits de la plaque de 384 puits, ajouter 0,2 μL du mélange maître préparé à l’étape 2.3.1 à l’aide d’un manipulateur de liquides.
      REMARQUE : Utilisez de plus grands volumes si vous utilisez un pipetage manuel, en vous assurant que les concentrations finales de réactifs sont toujours les mêmes par puits.
    3. Scellez la plaque, le vortex pendant 5 s et faites tourner vers le bas dans un spinner de plaque de paillasse à RT.
    4. Chauffer la plaque de 384 puits à 37 °C (avec la température du couvercle réglée à 52 °C) pendant 3 h.
  4. Réaction de marquage TMT
    1. Sortez les 85 mM d’étiquettes TMT (128N à 135N) du congélateur à -80 °C. Réchauffez les tubes à température ambiante avant de les ouvrir.
    2. Diluer les étiquettes à 22 mM dans de l’acétonitrile anhydre.
      ATTENTION : L’acétonitrile est un liquide inflammable. Il peut irriter la peau, les yeux, les voies respiratoires et le système nerveux central. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle. Manipuler sous une hotte chimique.
    3. À l’aide de cette stratégie d’étiquetage, ajoutez 0,5 μL d’étiquettes TMT diluées à chaque puits de la plaque de 384 puits. Utilisez soit un robot distributeur de liquide (si vous utilisez un manipulateur de liquide, assurez-vous d’utiliser un équipement associé adapté aux solvants organiques) ou une pipette manuelle.
      REMARQUE : Voir le tableau 2 pour la stratégie d’étiquetage. Voir le tableau 3 pour un exemple de disposition des plaques.
    4. Scellez la plaque, le vortex pendant 5 s et faites tourner vers le bas dans un spinner de plaque de paillasse à RT.
    5. Laisser la réaction d’étiquetage se dérouler à TA pendant 1 h.
  5. Trempe de la réaction de marquage TMT
    1. À chaque puits de la plaque de 384 puits, ajouter 0,2 μL d’hydroxylamine à 0,5 % (diluée dans de l’eau de qualité CLHP) à l’aide d’un manipulateur de liquide.
      REMARQUE : Utilisez de plus grands volumes si vous utilisez un pipetage manuel, en vous assurant que les concentrations finales de réactifs sont toujours les mêmes par puits.
    2. Scellez la plaque, le vortex pendant 5 s et faites tourner vers le bas dans un spinner de plaque de paillasse à RT.
    3. Conserver l’assiette à TA pendant 30 min.
  6. Préparation à l’analyse LC-MS/MS : combinaison de cellules individuelles et de puits témoins avec un support/matériau de référence
    1. Retirer le support combiné/matériau de référence du congélateur à -80 °C.
    2. Pour chaque ensemble, pipeter 1 μL de support et de matériau de référence dans le premier puits qui fera partie d’un seul ensemble. Pipeter le volume complet du premier puits au puits suivant. Continuer à pipeter le volume complet d’une cellule à l’autre jusqu’à ce que tous les puits à inclure dans un seul ensemble aient été combinés dans le puits final.
      NOTA : Le support et le matériau de référence doivent être à une concentration de 200 et 5 équivalents cellules, respectivement, mais comme nous l’avons mentionné précédemment21, ces quantités peuvent varier. Chaque ensemble, tel qu’indiqué dans la stratégie d’étiquetage (voir le tableau 2), doit contenir un porteur, une référence et jusqu’à 12 ou 14 échantillons unicellulaires ou témoins lors de l’utilisation de TMTpro-16plex ou TMTpro-18plex, respectivement (voir l’étape 2.4.3).
    3. Pour chaque ensemble, ajouter 5 μL d’acétonitrile à 50 % (dilué dans de l’eau de qualité CLHP) au premier puits unicellulaire à inclure dans chaque ensemble. Canaliser le volume complet du premier puits au puits suivant. Continuer à pipeter le volume complet d’une cellule à l’autre jusqu’à ce que tous les puits à inclure dans un seul ensemble aient été combinés dans le puits final.
      REMARQUE: Cette étape de lavage peut aider à récupérer les échantillons des puits.
    4. Transférez chaque ensemble dans leurs inserts en verre d’échantillonneur automatique individuels.
      NOTE: Ces ensembles peuvent également être combinés dans des puits uniques d’une plaque de 384 puits et directement placés dans l’échantillonneur automatique pour injection28.
    5. Une fois que tous les ensembles sont combinés et placés dans des inserts en verre, sécher les échantillons.
      POINT DE PAUSE: Les ensembles séchés peuvent être conservés à -80 ° C pendant au moins 1 semaine avant de fonctionner sur un spectromètre de masse.
    6. Avant l’analyse LC-MS/MS, ajouter 1,2 μL d’acide formique à 0,1 % (dilué dans de l’eau de qualité CLHP) à chaque ensemble pour remettre en suspension les peptides marqués.
      ATTENTION : L’acide formique est un liquide inflammable. Il peut causer de graves lésions oculaires ou des brûlures cutanées. Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle. Manipuler dans un endroit bien ventilé.
    7. Placez les inserts d’échantillonneur automatique dans les flacons d’échantillonneur automatique en verre et fermez chaque échantillon avec un bouchon.
    8. Vortex chaque flacon pendant 5 s pour s’assurer que la remise en suspension est complète, puis faire tourner vers le bas dans un filateur de flacon à TA.
    9. Assurez-vous que chaque échantillon se trouve au bas de l’insert plutôt que d’être éclaboussé sur les côtés.
    10. Placez les flacons dans le plateau de l’échantillonneur automatique.
    11. Pour chaque série, injecter 1 μL pour l’analyse LC-MS/MS.
Étiquette 126 127N 127C 128N 128C 129N 129C 130N 130C .... 135N
Type d’échantillon Transporteur Référence Vide Vide SC/Contrôle SC/Contrôle SC/Contrôle SC/Contrôle SC/Contrôle .... SC/Contrôle

Tableau 2 : Exemple de schéma d’étiquetage SCoPE2 TMTpro-18plex. Le support et la référence sont généralement étiquetés dans les deux premières étiquettes TMT. Ensuite, les deux étiquettes suivantes sont ignorées en raison d’une contamination isotopique potentielle qui rendrait la quantification moins précise. Les autres étiquettes restantes concernent des cellules individuelles ou des contrôles.

128C 129N 129C 130N 130C 131N 131C 132N 132C 133N 133C 134N 128C 129N 129C 130N 130C 131N 131C 132N 132C 133N 133C 134N
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Un SC SC - SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC + SC SC SC
B SC + SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC +
C SC - SC - SC SC SC + SC - SC SC SC SC + SC - SC SC SC SC SC SC -
D SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC + SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
E SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC - SC SC
F SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC + SC SC SC + SC SC SC + SC SC
G SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC
H SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC
Je SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
J - SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC
K SC SC SC SC - SC SC SC SC - SC SC + SC - - SC SC SC SC SC SC SC SC
L SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC
M SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC
N + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
O SC SC SC SC + SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
P SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC - SC

Tableau 3 : Exemple de disposition de plaque pour l’étiquetage à l’aide de TMTpro-16plex. En utilisant un format de plaque de 384 puits (ou tout autre format de plaque), il est important de randomiser les puits dans lesquels les cellules sont triées. Une disposition de plaque différente sera utilisée pour TMTpro-18plex.

Representative Results

Les résultats positifs du protocole impliquent la vérification qu’un certain nombre d’étapes critiques du protocole ont été effectuées avec succès; il s’agit notamment de la préparation du support, de l’isolement unicellulaire, de la lyse, de la digestion, du marquage des codes-barres et de l’optimisation des paramètres MS. Les tracés DO-MS permettent d’évaluer facilement l’achèvement de chaque étape critique du protocole. Un support préparé avec succès, qui correspond généralement à 25 et 200 cellules en quantité (par ensemble), est bien digéré et bien étiqueté. Les tracés de DO-MS permettent de quantifier l’intensité de l’échantillon (pour estimer la quantité), l’efficacité de digestion (idéalement <25% de mauvais clivages) et l’efficacité d’étiquetage (doit être de >99%). Plus important encore, les échantillons porteurs qui ne sont pas complètement marqués peuvent permettre la réaction croisée avec les codes à barres destinés aux cellules individuelles et ajouter un signal faux à la quantification des peptides unicellulaires.

Les puits témoins négatifs comprennent tous les réactifs expérimentaux, mais n’ont pas de cellule. Cela permet non seulement d’évaluer le bruit de fond, mais aussi de déterminer l’efficacité de l’isolation des cellules en fournissant un signal représentatif d’un puits vide. Le rapport DO-MS propose des graphiques pour évaluer le signal mesuré du puits témoin à côté des puits unicellulaires afin de déterminer le succès de l’isolement cellulaire et du bruit de fond. De plus, la qualité de la quantification peut être évaluée à l’aide du pipeline SCoPE2 (disponible sur GitHub : github.com/SlavovLab/SCoPE2) ou du package SCP Bioconductor29.

L’efficacité de la digestion et du marquage des cellules individuelles peut ne pas être directement dosée comme avec le support, mais DO-MS fournit à nouveau des parcelles qui permettent d’estimer l’efficacité de la digestion et du marquage. En incluant un contrôle de 100 à 200 cellules en même temps que la préparation des cellules individuelles (c.-à-d. recevant tous les mêmes ajouts de réactifs), l’efficacité de la digestion et du marquage peut être évaluée pour ce contrôle et supposée partagée par les cellules individuelles préparées à côté. Une mauvaise digestion sera indiquée par un rapport élevé de l’intensité des peptides mal clivés à leurs homologues complètement clivés (Figure 1).

Un autre facteur à prendre en compte dans les ensembles est la fraction de données manquantes et l’intensité médiane des ions rapporteurs dans chaque canal TMT (Figure 2). Lorsque des cellules individuelles sont préparées avec succès, la quantité de données manquantes par cellule et contrôle positif est beaucoup plus faible que dans les échantillons témoins négatifs. De même, l’intensité médiane des précurseurs est beaucoup plus élevée dans les cellules individuelles et les témoins positifs que dans les témoins négatifs. L’optimisation des paramètres MS a été largement discutée ailleurs21, et les paramètres optimaux peuvent être déterminés à l’aide d’outils tels que DO-MS ou SCP Companion25,27.

Figure 1
Figure 1 : Contrôle de la qualité de la préparation du support. Tracés DO-MS illustrant (A) l’efficacité du marquage d’un support préparé avec succès sur les sites de marquage avec TMT: l’amine primaire sur la chaîne latérale de la lysine et du peptide N-terminus, et (B) l’efficacité de la digestion des résidus d’acides aminés du clivage tryptique. Abréviation : TMT = étiquette de masse en tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Contrôle de la qualité de la préparation unicellulaire. Graphiques DO-MS représentant (A) la fraction de données manquantes dans les cellules individuelles (C5-10), les témoins (C13,16), le porteur (C1) et la référence (C2), et (B) l’intensité des cellules individuelles et des témoins. Les balises 127C, 128N, 131C, 132N, 133N et 133C, qui correspondent à C3, C4, C11, C12 et C15, ne sont pas utilisées dans cet ensemble particulier. Le témoin positif consiste en du matériel cellulaire transformé en peptides en vrac, puis dilué à un niveau de 2 à 5 cellules/μL avant le marquage. Le contrôle négatif consiste en un puits soumis à toutes les étapes préparatoires utilisées pour les cellules individuelles, mais sans l’ajout d’une seule cellule. Abréviation : TMT = étiquette de masse en tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’une des clés du succès de la préparation et de l’analyse des cellules individuelles par SCoPE2 est la préparation du support et des canaux de référence. La taille de support suggérée est de 100 à 200 cellules; Cependant, le nombre de cellules nécessaires pour une expérience particulière sur une seule cellule peut être déterminé sur la base de principes discutés ailleurs21. Pour la taille suggérée, au moins ~11 275 cellules sont nécessaires par plaque de 384 puits, ce qui permet une référence de 200 cellules porteuse et 5 cellules dans chaque ensemble. Il peut être avantageux d’isoler plus de cellules si les populations cellulaires souhaitées ne sont pas un facteur limitant, d’avoir simplement du matériel supplémentaire en cas d’erreurs (comme cela a été fait dans ce protocole, en isolant 22 000 cellules au lieu de 11 275 cellules). La quantité de support et de référence nécessaire pour le nombre de plaques souhaitées doit être préparée en un seul lot afin de minimiser toute variation d’un lot à l’autre qui peut faire en sorte que l’identification ou la quantification des peptides diffère d’un lot à l’autre.

Avant d’isoler des cellules individuelles dans des puits d’une plaque de 384 puits, il est important de considérer la conception de la disposition des plaques. Dans chaque plaque de 384 puits, il est recommandé de mettre en œuvre des contrôles positifs et négatifs. Les témoins négatifs sont des puits dans lesquels aucune cellule n’est ajoutée, mais subissent les mêmes ajouts de réactifs et procédures que les puits unicellulaires. Les témoins positifs sont des puits dans lesquels du lysat cellulaire dilué à 2-5 cellules / μL est ajouté au lieu de cellules individuelles. Ceci est particulièrement important à mettre en œuvre lorsque les méthodes d’isolement de cellules uniques ne sont pas bien validées. Chaque plaque de 384 puits devrait idéalement avoir une distribution aléatoire de cellules individuelles et de témoins (p. ex., ne pas avoir de témoins négatifs ou positifs dans une seule rangée). Chaque plaque devrait avoir une distribution égale de toutes les populations cellulaires d’intérêt, plutôt que d’isoler un type de cellule dans une plaque et un deuxième type de cellule dans une deuxième plaque. Cela évitera de lier les effets de lot avec les types de cellules d’intérêt. De plus, si plus d’une plaque de 384 puits est nécessaire pour l’analyse, il est conseillé d’isoler les cellules en une seule séance, plutôt que d’étaler l’étape d’isolement sur plusieurs jours, si possible.

La lyse des cellules individuelles et du porteur/référence a lieu dans l’eau par un cycle de congélation-chaleur23. On s’attend à ce que la plupart des protéases aient été dénaturées au cours de cette étape. La trypsine est ensuite ajoutée immédiatement après l’étape de dénaturation à une concentration élevée, de plusieurs ordres de grandeur supérieure à celle des protéases cellulaires les plus abondantes. Par action de masse, la plupart des produits de l’activité de la protéase seront dus à la trypsine.

La réduction/alkylation des résidus de cystéine n’est pas effectuée dans ce protocole avant la digestion de la trypsine. Les peptides contenant de la cystéine représentent environ 10% des peptides tryptiques du protéome humain. Nous observons moins de peptides contenant de la cystéine en utilisant une approche sans réduction/alkylation. Ces étapes utilisent des réactifs incompatibles avec le marquage par TMT (NHS-ester chemistry) immédiatement après la digestion.

Dans cette stratégie d’étiquetage TMT, le support et les références sont étiquetés avec 126 et 127N, respectivement, tandis que les puits unicellulaires et de contrôle sont étiquetés avec 128C à 135N. Les deux marqueurs après la référence, 127C et 128N, ne sont pas utilisés en raison de la contamination croisée isotopique provenant des canaux porteur et de référence, qui sont clairement beaucoup plus abondants en matériel peptidique que les cellules individuelles. Au total, il y a 12 canaux TMT par ensemble qui peuvent être utilisés pour marquer des cellules individuelles ou des puits de contrôle avec TMTpro-16plex, ou 14 canaux TMT par ensemble avec TMTpro-18plex.

Les étapes critiques du protocole pour effectuer des mesures protéomiques unicellulaires à l’aide de ce protocole comprennent la préparation du support, l’isolement unicellulaire, la lyse, la digestion, le marquage par code-barres et les paramètres appropriés de spectrométrie de masse. Ces étapes ont été décrites dans le présent document et ont été détaillées ailleurs 17,21,25. Chaque étape a un tracé correspondant ou un ensemble de tracés en DO-MS qui permettent un contrôle qualité facile. Par exemple, en cas de création réussie du support, des parcelles représentant le nombre de peptides identifiés, l’efficacité du marquage et le pourcentage de taux de mauvais clivage permettent de vérifier sa préparation réussie. Des rapports DO-MS représentatifs sont inclus dans cette publication et peuvent être consultés à http://scope2.slavovlab.net/ pour les données originales16. Ces rapports DO-MS permettent d’évaluer l’optimisation de la méthode dans des directions qui n’ont pas encore été étudiées par les auteurs, telles que des gradients LC plus longs, différentes enzymes de digestion ou des codes à barres chimiques alternatifs.

Actuellement, l’analyse en série des peptides par des algorithmes d’acquisition dépendants des données limite le nombre de peptides pouvant être analysés dans une série de LC d’une longueur raisonnable. Cela est dû en partie aux temps de remplissage plus longs requis pour l’acquisition réussie d’un nombre suffisant d’ions pour une quantification fiable d’une seule cellule21. Une limitation inhérente à l’utilisation du support est le manque d’évaluation directe de l’efficacité de la digestion et du marquage des cellules individuelles. Actuellement, une solution à cette limitation consiste à effectuer un contrôle de la qualité sur un échantillon plus grand traité à côté des cellules individuelles.

Nous avons proposé un certain nombre de possibilités d’améliorer la protéomique unicellulaire, telles que la construction de spectromètres de masse avec plusieurs analyseurs. La méthode actuelle permet de quantifier des milliers de protéines à partir de cellules de mammifères uniques à une vitesse d’environ 100 cellules par jour avec des réactifs et des équipements disponibles dans le commerce. SCoPE2, la deuxième génération de l’approche SCoPE-MS, a considérablement amélioré son prédécesseur en ce qui concerne le nombre de cellules analysables par unité de temps, le nombre de protéines analysables par unité de temps, le temps nécessaire à la préparation des échantillons, l’accessibilité des réactifs et de l’équipement, et le coût global de la préparation et de l’analyse par cellule unique. Les protéines liées à la membrane sont accessibles en utilisant la lyse par lyse par congélation et la digestion de la protéase, comme le montre la comparaison avec la lyse de l’urée23. La méthode identifie de nombreuses protéines du tiers supérieur du protéome par rapport à l’abondance16. Si la protéoforme modifiée se trouve dans le tiers supérieur du protéome et que le peptide modifié se prête à une analyse par spectrométrie de masse (s’ionise bien, présente une différence de masse par rapport au peptide non modifié), il sera plus susceptible de se soumettre à ce protocole. Cette méthode peut être appliquée de manière fructueuse dans les systèmes biologiques où il existe une hétérogénéité significative entre les cellules, comme dans la différenciation, la sénescence ou les réponses immunologiques (phagocytose).

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le prix du programme I-Corps de la NSF de l’automne 2021 (site de la Northeastern University) qui a financé cette publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plate, standard PCR plate Thermo Fisher Scientific AB1384 Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific A955-1 This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 271004-100ML This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils Thermo Fisher Scientific AB0626
Autosampler vial screw thread caps Thermo Fisher Scientific C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) MTC Bio C2595 This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease Sigma Aldrich E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm Thermo Fisher Scientific 60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade Thermo Fisher Scientific 85178 Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm Thermo Fisher Scientific C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol Sigma Aldrich 467804-50ML Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips Formulatrix MCLVPR2 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips Formulatrix MCLVS12 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler Formulatrix Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling Formulatrix 232400
MassPREP peptide mixture Waters 186002337 Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) USA Scientific 2621-0016 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips USA Scientific 1402-3900 If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free Thermo Fisher Scientific AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) Benchmark Scientific Model C2000 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) Biorad 1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg Thermo Fisher Scientific A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 Sigma Aldrich T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade Promega V5280 This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer) VWR Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) VWR 97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific W6-1 All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

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References

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Biologie numéro 190
Préparation protéomique unicellulaire pour l’analyse par spectrométrie de masse par lyse de la chaleur glaciale et support isobare
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Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, … More

Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, H. Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier. J. Vis. Exp. (190), e63802, doi:10.3791/63802 (2022).

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