Biology

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להכין תאי יונקים לניתוח פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות ספקטרומטריית מסה באמצעות ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית, עם אפשרויות לפיפטציה ידנית ואוטומטית כאחד.

Abstract

ניתוח פרוטאומיקה חד-תאית דורש שיטות רגישות, מדויקות מבחינה כמותית, נגישות וחזקות. כדי לעמוד בדרישות אלה, פרוטוקול פרוטאומיקה חד-תאית (SCoPE2) פותח כשיטת דור שני לכימות מאות עד אלפי חלבונים מדגימות מוגבלות, עד לרמה של תא בודד. ניסויים בשיטה זו השיגו כימות של יותר מ-3,000 חלבונים על פני 1,500 תאי יונקים בודדים (500-1,000 חלבונים לתא) ב-10 ימים של זמן ספקטרומטר מסה. SCoPE2 ממנף מחזור הקפאה של חום עבור תזה של תאים, מייתר את הצורך בניקוי של תאים בודדים וכתוצאה מכך מפחית את אובדן הדגימה, תוך זירוז הכנת הדגימה ופישוט האוטומציה שלה. בנוסף, השיטה משתמשת בנשא איזוברי, המסייע בזיהוי חלבונים ומפחית את אובדן הדגימה.

פרוטוקול וידאו זה מספק הנחיות מפורטות כדי לאפשר אימוץ של ניתוח אוטומטי של חלבונים חד-תאיים באמצעות ציוד וריאגנטים בלבד הנגישים באופן נרחב. אנו מדגימים שלבים קריטיים בהליך של הכנת תאים בודדים לאנליזה פרוטאומית, החל מקציר ועד הזרקה ועד לניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS/MS). בנוסף, הצופים מונחים דרך עקרונות התכנון הניסויי עם המוביל האיזוברי, בקרת איכות הן עבור נשא איזוברי והן עבור תכשירים חד-תאיים, ותוצאות מייצגות תוך דיון במגבלות הגישה.

Introduction

אנליזה חד-תאית נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור את רמת ההטרוגניות במערכות ביולוגיות שאחרת לא ניתן היה להבחין בה על ידי מדידות בתפזורת ^1,2,3. למגוון תאי כזה יכולות להיות השלכות תפקודיות שיכולות לקדם את ההבנה של תהליכים ביולוגיים אינטגרליים, החל מעמידות לטיפול בתאים סרטניים ^4,5,6 ועד להטרוגניות בין תאים בסוכרת 7,8,9,10. מחקרים רבים התמקדו במדידת חומצות גרעין בתאים בודדים, על ידי מדידת רמות גנטיות או שעתוק ואפשרו סיווג של סוגי תאים ומצבים. עם זאת, התקדמות כזו במרחב חומצות הגרעין אינה יכולה למלא את פער הידע של ויסות¹¹ שלאחר שעתוק, מה שמניע את הצורך במדידות חלבונים בעלות תפוקה גבוהה דומה בתאים בודדים^12,13,14,15.

פיתחנו את SCoPE2^16,17 כדי לענות על הדרישה לפרוטאומיקה חד-תאית קפדנית וחזקה של מערכות יונקים. זוהי שיטה מרובבת, המאפשרת תפוקה מוגברת על ידי תיוג וניתוח תאים רבים במקביל¹⁸, בניגוד ל-mthods נטולי תוויות המנתחים תא אחד בכל פעם^19,20^. מתודולוגיית הכנת הדגימה, גישת ספקטרומטריית המסות ושלבי ניתוח הנתונים הבאים מאפשרים כימות מדויק של מאות עד אלפי חלבונים לתא בודד. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספקטרומטריית מסה של תאים בודדים באמצעות הנשא האיזוברי²¹, דגימה קטנה בתפזורת של תאים (בדרך כלל 25-200) הדומה ביולוגית לאוכלוסיית התאים הבודדים המעניינת. חומר נשא זה מוכפל בקבוצה עם ערוץ ייחוס של אותו חומר ותאים בודדים באמצעות שימוש בתגי מסה טנדם (תוויות TMT). תעלת הנשא מפחיתה את אובדן הדגימה לאזורי פנים ומספקת את שברי עמוד השדרה של היונים לזיהוי פפטידי מוצלח. ערוץ הייחוס, אשר מוכן בתפזורת ולאחר מכן מדולל עד 5-10 תאים מקבילים עבור כל קבוצה של תא בודד, מסייע לשלוט על השתנות טכנית בניתוח. באופן ספציפי, ההתייחסות מאפשרת נורמליזציה של השתנות הנגרמת על ידי השפעות הקשורות ל- LC-MS/MS, כגון דגימת יונים ויעילות יינון. בדרך כלל, תעלות הייחוס והתעלות המובילות נעשות מאותה אוכלוסיית תאים.

פרוטוקול הכנה לדוגמה זה הוא שיטת דור שני הנשענת על SCoPE-MS²² על ידי שיפורים סינרגטיים מרובים. השיפורים כוללים שיטת תזה תאית המונעת ניקוי דגימה, שהוא שלב נפוץ בתכשירי פרוטאומיקה לטרשת נפוצה. הוא משתמש ב-mPOP (הכנת דגימת פרוטאומית מינימלית)²³, שהיא שיטת הקפאה של חום. שיטה זו אפשרה תסיסה של תאים בודדים בנפחים קטנים יותר ובלוחות מרובי תאים במקום בבקבוקונים, מה שאפשר קצב תפוקה ואוטומציה גבוהים יותר על ידי מחזורים תרמיים. בסך הכל, שיטה זו הורידה את העלות לתא בודד והגדילה את הדיוק הכמותי בהשוואה ל- SCoPE-MS ^16,24.

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין תאים בודדים לניתוח פרוטאומי, כולל כיצד להכין את הנשא ואת ערוצי הייחוס באמצעות תוויות איזובריות TMTpro 18-plex. תאים של יונקים שנמצאים בתרחיף חד-תאי ושניתן לבודד אותם לצלחות של 384 בארות הם ככל הנראה מקובלים על פרוטוקול זה. כמו כן נכללות תוצאות מייצגות של ערכות מוצלחות של תאים בודדים, המציגות מספר חלקות בקרת איכות שנוצרו על ידי אפליקציית R Shiny, DO-MS²⁵. כלי תוכנה אחרים שפורסמו^26,27 והנחיות ניסיוניות ^17,21 שיפרו את אימוץ פרוטוקול זה. אנו מקווים שמדריך חזותי זה יסייע עוד יותר לחוקרים לבצע ניסויים בפרוטאומיקה חד-תאית.

Protocol

הערה: בפרוטוקול זה, טמפרטורת החדר (RT) היא 18-22 °C.

1. ייצור נשאות וחומרי ייחוס

בידוד תאים
1. אסוף תאים מעניינים לתוך תרחיף תאים ב- PBS 1x קר כקרח.
  הערה: במידת האפשר, יש להכין את הנשא ואת חומר הייחוס מאוכלוסיית התאים שנבחרו להיחקר ברמת התא הבודד. מספר דומה של תאים מתנאי הניסוי השונים (כגון תאי חיסון מגורה ולא מגורה) צריכים להוות את הנשא ואת ההתייחסות. במצבים בהם לא ניתן לקצור מספר גדול מספיק של תאים אלה, יש לבחור אוכלוסיית תאים מתאימה על סמך דמיון ביולוגי.
2. באמצעות המוציטומטר או אמצעים אחרים של ספירת תאים (כגון FACS), לספור את מספר התאים בהשעיה.
3. סובבו והפעילו מחדש 22,000 תאים מכל סוג תא ב-11 μL של מים ברמת HPLC, בנפרד לתוך צינורות PCR (צינורות PCR סטנדרטיים של 250 μL).
  הערה: מספר התאים המומלצים כאן מספיקים לנשאים והפניות למספר הקבוצות שניתן להכין מצלחת של 384 בארות מלאה בתאים בודדים. ניתן לשנות את גודל קלט התא בשלב זה ואת כמויות הריאגנטים בצעדים הבאים באופן פרופורציונלי עבור מספר גדול יותר של ערכות. מהירות ההסתחררות תלויה בשיטות תרבית התאים של המעבדה. ספין דאון טיפוסי: 300 × גרם למשך 5 דקות.
4. מעבירים את הדגימות למקפיא של -80°C למשך 30 דקות לפחות.
  נקודת השהיה: דגימות יכולות להישאר קפואות במשך מספר חודשים ללא השלכות על נתונים של תא בודד.
תזה תאית
1. מחממים את צינור ה-PCR עם התאים ל-90°C למשך 10 דקות (כאשר מכסה המחזור התרמי מוגדר ל-105°C), ולאחר מכן מניחים לצינורות להתקרר ל-12°C מיד לאחר מחזור החימום.
2. מערבבים את הצינור לזמן קצר, ואז מסתובבים מטה בסיבוב צינור PCR ב-RT כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור.
3. בסוניק אמבט מים, סוניקו את הצינורות במשך 5 דקות, ואז הניחו אותם על קרח ב- RT.
עיכול טריפסין
1. הוסף 2.2 μL של תערובת האב (ראה טבלה 1 עבור הרכיבים) לכל צינור דגימה בעודו על קרח.
  אזהרה: טריפסין עלול לגרום לגירוי בעור, בדרכי הנשימה ובעיניים. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי. ידית מתחת למכסה אדים כימיים.
2. מערבלים את הצינורות לזמן קצר כדי לערבב ולהסתחרר בספינר צינור PCR עליון ב-RT כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית כל צינור.
3. מחממים את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות (כאשר מכסה המחזור התרמי נקבע על 52 מעלות צלזיוס).
תגובת תיוג TMT
1. סובבו את הדגימות לאחר העיכול בספינר צינור PCR ב-RT.
2. חלקו כל דגימה לשני נפחים שווים של 6.6 μL כל אחד, כך שכל צינור מכיל 11,000 תאים.
3. לצינורות המיועדים למנשא, הוסף 3.3 μL של תווית TMT 126 שעברה החייאה בריכוז של 85 mM.
4. לצינורות המיועדים לייחוס, הוסף 3.3 μL של תווית TMT 127N שעברה החייאה בריכוז של 85 mM.
5. מערבבים את הצינורות לזמן קצר ומסתובבים מטה בסיבוב צינור PCR ב-RT כדי לאסוף את הנוזל בתחתית.
6. השאירו את הצינורות ב-RT למשך שעה אחת.
מרווה של תגובת תיוג TMT
1. יש להוסיף 1.65 μL של 0.5% הידרוקסילאמין לכל צינור.
  אזהרה: הידרוקסילאמין עלול לגרום לגירוי בעור. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי.
2. מערבבים את הצינורות לזמן קצר ומסתובבים מטה בסיבוב צינור PCR ב-RT כדי לאסוף את הנוזל בתחתית.
3. השאירו את הצינורות ב- RT למשך 30 דקות.
שילוב של ספק והפניה
1. אם דגימות שיהוו את המוביל סומנו בנפרד, ערבבו אותן ביחסים שווים.
2. אם דגימות שיהוו את ההפניה סומנו בנפרד, ערבבו אותן ביחסים שווים.
3. מערבבים את המוביל ואת הייחוס כך שהריכוז הסופי של המוביל הוא 100-200 תאים/μL, וריכוז הייחוס הוא 5-10 תאים/μL.
4. הערך את איכות הנשא וחומרי העזר לפני שילובם עם ערכות של תאים בודדים.
  הערה: בקרת האיכות של המוביל וחומר העזר יכולה להתבצע במגוון שיטות, אך מומלץ להשתמש בתוכנת DO-MS, הזמינה בשעה^{do-ms.slavovlab.net 17}. מדידות קריטיות של איכות כוללות שיעור אי-בהירות (<25%, מדד המחושב כמספר הפפטידים שזוהו בביטחון עם ביקוע שהוחמץ חלקי מספר הפפטידים שזוהו בביטחון בסך הכל) ויעילות הסימון (>99%, מדד המחושב כמספר אתרי התוויה, כלומר הפפטיד N-terminus ו- Lysine, עם תווית מחולקת במספר הכולל של אתרי התיוג).
  נקודת השהיה: ניתן לאחסן את המנשא וחומרי העזר בטמפרטורה של -80°C עד לדרישה.

רכיב	ריכוז תערובת	ריכוז סופי לכל צינור
טריפסין גולד	50 ננוגרם/מיקרון	8.33 ננוגרם/מיקרון
TEAB, pH = 8.5	500 מ"מ	83.33 מ"מ
בנזונאז נוקלאז	1.2 יחידות	0.2 יחידות

טבלה 1: כמות מגיבה של תערובת מאסטר. הריכוזים הסופיים של ריאגנטים הדרושים לעיכול טריפסין מפורטים.

2. הכנת מדגם SCoPE2

בידוד תאים
1. השלם מים ברמת HPLC עם 25 fmol לכל פפטיד לכל μL של תמיסת פפטיד סינתטית.
  הערה: תמיסת פפטיד Waters MassPrep היא דוגמה למה שניתן להשתמש בו. הוא מורכב משבעה פפטידים שאינם מייננים היטב. זהו היבט מרכזי של פתרון זה: פפטידים אלה אינם מפריעים לכמות ספקטרומטריית מסה מדויקת של תאים בודדים. כל תערובת מטוהרת מאוד של כמה פפטידים שלא סביר שיהיו בדגימות המעניינות תהיה מתאימה.
2. הוסף 1 μL של תערובת זו לכל באר של צלחת 384 באר באמצעות רובוט חלוקת נוזלים או פיפטה ידנית.
3. אטמו את הצלחת וסובבו אותה כלפי מטה בספינר של צלחת עליונה ב-RT כדי לאסוף את הנוזל בתחתית.
  נקודת השהיה: ניתן לאחסן צלחות עם תמיסה זו בטמפרטורה של -80°C עד הצורך.
4. השג השעיה של תאים לא מתוקנים המפורקים.
  הערה: האופן המדויק שבו מתקבל השעיית התא מבוסס על סוג התא המעניין. להלן דוגמאות רחבות:
  1. תאי תרחיף: סובבו את התאים לכדור, והסירו את מדיום תרבית התאים.
  2. תאים דבקים: להסיר את התאים מן המנה או בקבוקון באמצעות טריפסיניזציה או גירוד. לאחר מכן, סובבו אותם כלפי מטה כדי להסיר את מדיום תרבית התאים.
5. שטפו את מתלה התא פעמיים עם PBS קר כקרח אחד. השאירו את התאים תלויים ב-PBS אחד לאחר השטיפה השנייה.
6. אם הצלחת בעלת 384 הבארות הוקפאה, הפשירו אותה ב-RT. סובבו אותה כלפי מטה כדי לוודא שכל הנוזלים נמצאים בתחתית הבארות.
7. השתמש במיון תאים או באמצעים זמינים אחרים, כגון בחירה ידנית ידנית, כדי להפיץ תאים בודדים לבארות המתאימות.
  הערה: הוסף תאים בודדים לבארות תוך השארת חלק מהבארות ריקות לצורך בקרות שליליות וחיוביות (ראה דיון). בעת שימוש בציטומטריה של זרימה, השתמש בקצב הזרימה הנמוך ביותר האפשרי עבור ציטומטר הזרימה. קצב זרימה נמוך יותר נחשב עדין יותר לטיפול בתאים. בנוסף, גודל הזרבובית צריך להיות מתאים לשימוש עם התאים המעניינים. מומלץ לשתף פעולה עם מתקן ציטומטריה של זרימה.
8. הוסף בקרות חיוביות של 2-5 תאים מקבילים lysate לבארות נבחרות pipetted באופן ידני או עם רובוטים לטיפול בנוזלים.
9. אטמו וסובבו את הצלחת עם תאים ממוינים בספינר של צלחת עליונה ב-RT כדי לאסוף את הנוזל בתחתית. מקפיאים את הצלחת בטמפרטורה של -80°C בהקדם האפשרי.
  נקודת השהיה: ניתן לאחסן צלחות עם תאים בודדים ממוינים בטמפרטורה של -80°C עד לצורך.
תזה תאית
1. קח את צלחת 384-well עם תאים בודדים ממוינים ולשים אותו לתוך cycler תרמי מהר ככל האפשר.
2. מחממים את הצלחת ל-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (כשטמפרטורת המכסה מוגדרת ל-105 מעלות צלזיוס), ואז מניחים לצלחת להתקרר ל-12 מעלות צלזיוס.
3. סובבו את הצלחת לזמן קצר בספינר של צלחת ספסל ב-RT.
4. בסוניק אמבט מים, סוניקו את הצלחת במשך 5 דקות ב- RT, ואז הניחו אותה על קרח.
עיכול טריפסין
1. הכינו 100 מיקרוליטר של תערובת האב (ראו טבלה 1 לרכיבים) לכל צלחת 384 בארות.
2. לכל באר של צלחת 384 באר, הוסף 0.2 μL של תערובת האב מוכן בשלב 2.3.1 באמצעות מטפל בנוזל.
  הערה: השתמש בנפחים גדולים יותר אם נעשה שימוש בצנרת ידנית, וודא שהריכוזים הסופיים של הריאגנטים עדיין זהים לכל באר.
3. אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך 5 שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל ב-RT.
4. מחממים את צלחת ה-384 בטמפרטורה של 37°C (כאשר טמפרטורת המכסה מוגדרת ל-52°C) למשך 3 שעות.
תגובת תיוג TMT
1. הוציאו את מלאי 85 ה-mM של תוויות TMT (128N עד 135N) מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C. יש לחמם את הצינורות לטמפרטורת החדר לפני פתיחתם.
2. לדלל את התוויות ל 22 mM באצטוניטריל נטול מים.
  אזהרה: אצטוניטריל הוא נוזל דליק. הוא עלול לגרות את העור, העיניים, דרכי הנשימה ומערכת העצבים המרכזית. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי. ידית מתחת למכסה אדים כימיים.
3. באמצעות אסטרטגיית תיוג זו, הוסף 0.5 μL של תוויות TMT מדוללות לכל באר של צלחת 384 באר. השתמש ברובוט לחלוקת נוזלים (אם אתה משתמש במטפל בנוזלים, הקפד להשתמש בציוד נלווה המתאים לממיסים אורגניים) או בפיפטה ידנית.
  הערה: ראה טבלה 2 עבור אסטרטגיית התיוג. ראה טבלה 3 לקבלת פריסת לוח לדוגמה.
4. אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך 5 שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל ב-RT.
5. תנו לתגובת התיוג להמשיך ב-RT למשך שעה אחת.
מרווה של תגובת תיוג TMT
1. לכל באר של צלחת 384 הבאר, יש להוסיף 0.2 μL של 0.5% הידרוקסילאמין (מדולל במים ברמת HPLC) באמצעות מטפל בנוזל.
  הערה: השתמש בנפחים גדולים יותר אם נעשה שימוש בצנרת ידנית, וודא שהריכוזים הסופיים של הריאגנטים עדיין זהים לכל באר.
2. אוטמים את הצלחת, מערבלים במשך 5 שניות, ומסתובבים מטה בספינר של צלחת ספסל ב-RT.
3. שמור את הצלחת ב- RT למשך 30 דקות.
הכנה לניתוח LC-MS/MS: שילוב של תאים בודדים ובארות בקרה עם חומר נשא/ייחוס
1. הסר את המנשא/חומר הייחוס המשולב מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C.
2. עבור כל קבוצה, פיפטה 1 μL של נושאת וחומר ייחוס לתוך הבאר הראשונה כי יהיה חלק קבוצה אחת. פיפטה את הנפח המלא של הבאר הראשונה לבאר שלאחר מכן. המשך להעביר את הנפח המלא מתא אחד למשנהו עד שכל הבארות שייכללו בסט אחד ישולבו בבאר הסופית.
  הערה: הנשא וחומר הייחוס צריכים להיות בריכוז של שווה ערך ל-200 ו-5 תאים, בהתאמה, אך כפי שפורט קודם^{לכן 21}, כמויות אלה עשויות להשתנות. כל ערכה, כמפורט באסטרטגיית התוויות (ראה טבלה 2), צריכה להכיל נשא, הפניה ועד 12 או 14 דגימות של תא בודד או בקרה בעת שימוש ב- TMTpro-16 או TMTpro-18plex, בהתאמה (ראה שלב 2.4.3).
3. עבור כל ערכה, יש להוסיף 5 μL של 50% אצטוניטריל (מדולל במים ברמת HPLC) לבאר החד-תאית הראשונה שתיכלל בכל ערכה. פיפט את הנפח המלא מהבאר הראשונה לבאר שלאחר מכן. המשך להעביר את הנפח המלא מתא אחד למשנהו עד שכל הבארות שייכללו בסט אחד ישולבו בבאר הסופית.
  הערה: שלב שטיפה זה יכול לסייע בהתאוששות לדוגמה מהבארות.
4. העבירו כל סט לתוספות הזכוכית האוטומטיות הנפרדות שלהם.
  הערה: ניתן לשלב סטים אלה גם לבארות בודדות של צלחת 384 בארות ולהניח ישירות בדגימה האוטומטית להזרקה²⁸.
5. לאחר שכל הסטים משולבים ומונחים בתוספות זכוכית, יבשו את הדגימות.
  נקודת השהיה: ניתן לאחסן סטים יבשים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך שבוע לפחות לפני הריצה על ספקטרומטר מסה.
6. לפני ניתוח LC-MS/MS, יש להוסיף 1.2 μL של 0.1% חומצה פורמית (מדוללת במים ברמת HPLC) לכל ערכה כדי להשהות מחדש את הפפטידים המסומנים.
  אזהרה: חומצה פורמית היא נוזל דליק. זה יכול לגרום נזק חמור לעיניים או כוויות בעור. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי. יש לטפל באזור מאוורר היטב.
7. הכניסו את הדוגם האוטומטי לתוך בקבוקוני הדגימה האוטומטית מזכוכית וסגרו כל דגימה עם מכסה.
8. מערבלים כל בקבוקון במשך 5 שניות כדי לוודא שהחידוש הושלם, ואז מסתובבים כלפי מטה בספינר בקבוקון ב-RT.
9. ודא שכל דגימה נמצאת בתחתית ההוספה, ולא ניתזת בצדדים.
10. הניחו את הבקבוקונים במגש הדגימה האוטומטית.
11. עבור כל סט, הזרקת 1 μL לניתוח LC-MS/MS.

תווית	126	127N	127ג	128N	128ג	129N	129ג	130N	130ג	....	135N
סוג לדוגמה	נושאת	הפניה	ריק	ריק	SC/בקרה	SC/בקרה	SC/בקרה	SC/בקרה	SC/בקרה	....	SC/בקרה

טבלה 2: דוגמה SCoPE2 TMTpro-18Plex ערכת תיוג. המוביל וההפניה מסומנים בדרך כלל בשתי תוויות TMT הראשונות. לאחר מכן, מדלגים על שתי התוויות הבאות עקב זיהום איזוטופי פוטנציאלי שיהפוך את הכמות לפחות מדויקת. התוויות האחרות שנותרו מיועדות לתאים בודדים או לפקדים.

128ג

129N

129ג

130N

130ג

131N

131ג

132N

132ג

133N

133ג

134N

128ג

129N

129ג

130N

130ג

131N

131ג

132N

132ג

133N

133ג

134N

נ"ז

אני

נ"ז

טבלה 3: פריסת לוח לדוגמה לתיוג באמצעות TMTpro-16plex. באמצעות תבנית צלחת 384 בארות (או כל תבנית צלחת אחרת), חשוב לסדר באופן אקראי את הבארות שאליהן ממוינים התאים. פריסת צלחת שונה תשמש עבור TMTpro-18plex.

Representative Results

תוצאות חיוביות מהפרוטוקול כרוכות באימות כי מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול בוצעו בהצלחה; אלה כוללים את הכנת הנשא, בידוד תא בודד, תזה, עיכול, תיוג ברקוד, ואופטימיזציה של פרמטרים MS. עלילות DO-MS מאפשרות הערכה קלה של השלמת כל שלב קריטי בפרוטוקול. נשא מוכן בהצלחה, אשר בדרך כלל מתאים 25 ו 200 תאים בכמות (לכל קבוצה), הוא מתעכל היטב מסומן היטב. חלקות מ- DO-MS מאפשרות לכמת את עוצמת המדגם (כדי להעריך את הכמות), את יעילות העיכול (באופן אידיאלי <25% miscleavages) ואת יעילות הסימון (חייב להיות >99%). באופן קריטי ביותר, דגימות נשאיות שאינן מסומנות לחלוטין עשויות לאפשר את התגובה הצולבת עם הברקודים המיועדים לתאים בודדים ולהוסיף אות מופרך לכימות של פפטידים חד-תאיים.

בארות בקרה שליליות כוללות את כל הריאגנטים הניסיוניים אך חסרות תא. זה מאפשר לא רק להעריך רעשי רקע אלא גם את יעילות בידוד התאים על ידי מתן אות מייצג של באר ריקה. דו"ח DO-MS מציע מגרשים להערכת האות הנמדד של באר הבקרה לצד הבארות החד-תאיות כדי לקבוע את הצלחת בידוד התאים ורעשי הרקע. בנוסף, ניתן להעריך את איכות הכמות באמצעות צינור SCoPE2 (זמין ב- GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) או חבילת SCP Bioconductor²⁹.

יעילות העיכול והתיוג של התאים הבודדים עשויה שלא להיבדק ישירות כמו אצל הנשא, אך DO-MS שוב מספקת עלילות המאפשרות להעריך את יעילות העיכול והתווית. על ידי הכללת בקרה של 100-200 תאים לצד הכנת התאים הבודדים (כלומר, קבלת כל אותן תוספות מגיבים), ניתן להעריך את יעילות העיכול והתיוג עבור בקרה זו, ולהניח שהם משותפים לתאים הבודדים שהוכנו לצדם. עיכול לקוי יצוין על ידי יחס גבוה של עוצמת הפפטידים השגויים למקביליהם השסועים לחלוטין (איור 1).

גורם נוסף שיש לקחת בחשבון בקבוצות הוא שבריר הנתונים החסרים ועוצמת יון הדיווח החציונית בכל ערוץ TMT (איור 2). כאשר תאים בודדים מוכנים בהצלחה, כמות הנתונים החסרים לכל תא ובקרה חיובית נמוכה בהרבה מאשר בדגימות בקרה שלילית. כמו כן, העוצמה החציונית של מבשרים גבוהה בהרבה בתאים בודדים ובבקרות חיוביות מאשר בבקרות שליליות. האופטימיזציה של פרמטרים של טרשת נפוצה נדונה בהרחבה במקומות אחרים²¹, וניתן לקבוע פרמטרים אופטימליים באמצעות כלים כגון DO-MS או SCP Companion^25,27.

איור 1: בקרת איכות הכנת נשאים. עלילות DO-MS המתארות (A) יעילות תיוג של נשא שהוכן בהצלחה באתרי תיוג עם TMT: האמין העיקרי בשרשרת הצדדית של ליזין ופפטיד N-terminus, ו-(B) יעילות העיכול בשאריות חומצות אמינו של ביקוע טריפטי. קיצור: TMT = תג מסה טנדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: בקרת איכות של הכנה חד-תאית. עלילות DO-MS המתארות (A) את החלק של הנתונים החסרים בתאים בודדים (C5-10), פקדים (C13,16), נשא (C1) וייחוס (C2), ו-(B) את העוצמה של תאים בודדים ופקדים. תגים 127C, 128N, 131C, 132N, 133N ו- 133C, המתאימים ל- C3, C4, C11, C12 ו- C15, אינם בשימוש בקבוצה מסוימת זו. הבקרה החיובית מורכבת מחומר תאי המעובד לפפטידים בתפזורת, ולאחר מכן מדולל לרמה של 2-5 תאים/μL לפני הסימון. השליטה השלילית מורכבת מבאר הכפופה לכל שלבי ההכנה המשמשים לתאים בודדים, רק ללא תוספת של תא בודד. קיצור: TMT = תג מסה טנדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

אחד המפתחות להכנה מוצלחת וניתוח של תאים בודדים על ידי SCoPE2 הוא הכנת המוביל וערוצי ההתייחסות. גודל הנשא המוצע הוא 100 עד 200 תאים; עם זאת, ניתן לקבוע את מספר התאים הדרושים לניסוי חד-תאי מסוים על סמך עקרונות כפי שנדונו במקום אחר²¹. עבור הגודל המוצע, יש צורך בלפחות ~11,275 תאים לכל צלחת של 384 בארות, מה שמאפשר הפניה של 200 תאים ו-5 תאים בכל קבוצה. זה יכול להיות יתרון לבודד יותר תאים אם אוכלוסיות התאים הרצויות אינן גורם מגביל, פשוט יש חומר נוסף במקרה של טעויות (כפי שנעשה בפרוטוקול זה, בידוד 22,000 תאים במקום 11,275 תאים). יש להכין את כמות הנשא וההתייחסות הדרושה למספר הצלחות הרצויות באצווה אחת כדי למזער כל וריאציה בין אצווה לאצווה שיכולה לגרום לזיהוי פפטידים או לכימות להיות שונים בין אצוות.

לפני בידוד תאים בודדים לתוך בארות של צלחת 384 באר, חשוב לשקול את העיצוב של פריסת צלחת. בתוך כל צלחת 384-well, מומלץ ליישם הן בקרות חיוביות ושליליות. בקרות שליליות הן בארות שבהן לא מוסיפים תאים אלא עוברים את אותן תוספות והליכים מגיבים כמו בארות חד-תאיות. בקרות חיוביות הן בארות שבהן מוסיפים תאים מדוללים ל-2-5 תאים/μL במקום תאים בודדים. זה חשוב במיוחד ליישום כאשר שיטות בידוד של תאים בודדים אינן מאומתות היטב. כל צלחת של 384 בארות צריכה באופן אידיאלי לכלול התפלגות אקראית של תאים בודדים ופקדים (למשל, לא לכלול פקדים שליליים או חיוביים בשורה אחת בלבד). לכל צלחת צריכה להיות חלוקה שווה של כל אוכלוסיות התאים המעניינות, במקום לבודד סוג תא אחד בצלחת אחת וסוג תא שני בצלחת שנייה. זה ימנע קשירת אפקטים אצווה עם סוגי תאים של עניין. בנוסף, אם יש צורך ביותר מצלחת אחת של 384 בארות לניתוח, מומלץ לבודד תאים בפגישה אחת, ולא לפזר את שלב הבידוד על פני מספר ימים, במידת האפשר.

ליזיס של תאים בודדים ושל נשא/ייחוס מתרחש במים באמצעות מחזור חום קפוא²³. הצפי הוא שרוב הפרוטאזות עברו דנטורציה במהלך שלב זה. טריפסין מתווסף מיד לאחר שלב הדנטורציה בריכוז גבוה, בסדרי גודל רבים יותר בריכוז אפילו מאשר אפילו הפרוטאזות התאיות הנפוצות ביותר. על ידי פעולה המונית, רוב המוצרים של פעילות פרוטאז יהיה בשל טריפסין.

הפחתה/אלקילציה של שאריות ציסטאין אינה מבוצעת בפרוטוקול זה לפני עיכול טריפסין. פפטידים המכילים ציסטאין מייצגים כ-10% מהפפטידים הטריפטיים מהפרוטאום האנושי. אנו רואים פחות פפטידים המכילים ציסטאין בגישה ללא הפחתה/אלקילציה. בשלבים אלה נעשה שימוש בריאגנטים שאינם תואמים לתיוג על-ידי TMT (כימיה של אסטר NHS) מיד לאחר העיכול.

באסטרטגיית תיוג TMT זו, המוביל וההפניות מסומנים ב- 126 ו- 127N, בהתאמה, בעוד שתאים בודדים ובארות בקרה מסומנים ב- 128C עד 135N. שתי התוויות לאחר ההתייחסות, 127C ו- 128N, אינן משמשות בשל זיהום צולב איזוטופי הנובע מהמוביל ותעלות הייחוס, שברור שהן הרבה יותר נפוצות בחומר פפטידי מאשר התאים הבודדים. בסך הכל, ישנם 12 ערוצי TMT לכל קבוצה שניתן להשתמש בהם לתיוג תאים בודדים או בארות בקרה עם TMTpro-16plex, או 14 ערוצי TMT לכל קבוצה עם TMTpro-18plex.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול לביצוע מדידות פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות פרוטוקול זה כוללים הכנת הנשא, בידוד של תא בודד, תזה, עיכול, תיוג ברקוד ופרמטרים מתאימים של ספקטרומטריית מסות. צעדים אלה פורטו במסמך זה ופורטו בהרחבה במקומות אחרים 17,21,25. לכל שלב יש עלילה מתאימה או קבוצה של מגרשים ב- DO-MS המאפשרים בקרת איכות קלה. לדוגמה, במקרה של יצירה מוצלחת של המוביל, חלקות המתארות את מספר הפפטידים שזוהו, יעילות הסימון ואחוז שיעור הטעות מאפשרים אימות של הכנתו המוצלחת. דוחות DO-MS מייצגים כלולים בפרסום זה וניתן לראותם http://scope2.slavovlab.net/ לנתונים המקוריים¹⁶. דוחות DO-MS אלה מאפשרים להעריך אופטימיזציה של השיטה בכיוונים שטרם נחקרו על ידי המחברים, כגון מעברי צבע ארוכים יותר של LC, אנזימי עיכול שונים או ברקודים כימיים חלופיים.

נכון לעכשיו, הניתוח הסדרתי של פפטידים על ידי אלגוריתמי רכישה תלויי נתונים מגביל את מספר הפפטידים שניתן לנתח בריצת LC באורך סביר. זאת, בין היתר, בשל זמני המילוי הארוכים יותר הנדרשים לרכישה מוצלחת של מספיק יונים לכימות אמין של תאים בודדים²¹. מגבלה מובנית לשימוש בנשא היא היעדר הערכה ישירה של יעילות העיכול והתיוג של התאים הבודדים. נכון לעכשיו, אחד הפתרונות למגבלה זו הוא ביצוע בקרת איכות על דגימה גדולה יותר המעובדת לצד התאים הבודדים.

הצענו מספר הזדמנויות לשיפור פרוטאומיקה חד-תאית, כגון בניית ספקטרומטרים של מסה באמצעות אנלייזרים מרובים. השיטה הנוכחית מאפשרת כימות של אלפי חלבונים מתאי יונקים בודדים במהירות של כ-100 תאים ביום עם ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית. SCoPE2, הדור השני של גישת SCoPE-MS, השתפר משמעותית מקודמו ביחס למספר התאים הניתנים לניתוח ליחידת זמן, מספר החלבונים הניתנים לניתוח ליחידת זמן, הזמן הדרוש להכנת הדגימה, נגישות הריאגנטים והציוד, והעלות הכוללת של הכנה וניתוח לתא בודד. חלבונים הקשורים לממברנה נגישים באמצעות תזה של חום קפוא ועיכול פרוטאזות, כפי שמוצג בהשוואה ל- urea lysis²³. השיטה מזהה חלבונים רבים מהשליש העליון של הפרוטאום ביחס לשפע¹⁶. אם הפרוטאופורם המתוקן נמצא בשליש העליון של הפרוטאום, והפפטיד המתוקן מקובל לניתוח ספקטרומטריית מסות (מיינן היטב, יש לו הבדל מסה מפפטיד ללא שינוי), סביר יותר להניח שהוא יהיה מקובל על פרוטוקול זה. שיטה זו עשויה להיות מיושמת באופן פורה במערכות ביולוגיות שבהן יש הטרוגניות משמעותית בין תאים, כגון בהתמיינות, סנסנציה או תגובות אימונולוגיות (כלומר, פאגוציטוזה).

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לפרס תוכנית NSF I-Corps לסתיו 2021 (אתר אוניברסיטת נורת'איסטרן) שמימן פרסום זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .