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Bioengineering

Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

El presente protocolo describe un método no basado en emulsiones para la fabricación de microgeles de quitosano-genipina. El tamaño de estos microgeles se puede controlar con precisión, y pueden mostrar hinchazón dependiente del pH, degradarse in vivo y cargarse con moléculas terapéuticas que se liberan con el tiempo de manera sostenida, lo que las hace altamente relevantes para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Abstract

Los microgeles de quitosano son de gran interés en la ingeniería de tejidos debido a su amplia gama de aplicaciones, bajo costo e inmunogenicidad. Sin embargo, los microgeles de quitosano se fabrican comúnmente utilizando métodos de emulsión que requieren enjuagues con solventes orgánicos, que son tóxicos y dañinos para el medio ambiente. El presente protocolo presenta un método rápido, no citotóxico y no basado en emulsiones para fabricar microgeles de quitosano-genipina sin la necesidad de enjuagues con disolventes orgánicos. Los microgeles descritos aquí se pueden fabricar con un control de tamaño preciso. Exhiben una liberación sostenida de biomoléculas, lo que las hace altamente relevantes para la ingeniería de tejidos, biomateriales y medicina regenerativa. El quitosano se reticula con la genipina para formar una red de hidrogel, luego se pasa a través de un filtro de jeringa para producir los microgeles. Los microgeles se pueden filtrar para crear una variedad de tamaños, y muestran hinchazón dependiente del pH y se degradan con el tiempo enzimáticamente. Estos microgeles se han empleado en un modelo de lesión de la placa de crecimiento de ratas y se demostró que promueven una mayor reparación del tejido del cartílago y muestran una degradación completa a los 28 días in vivo. Debido a su bajo costo, alta conveniencia y facilidad de fabricación con materiales citocompatibles, estos microgeles de quitosano presentan una tecnología emocionante y única en ingeniería de tejidos.

Introduction

La placa de crecimiento, también conocida como physis, es la estructura del cartílago ubicada al final de los huesos largos que media el crecimiento en los niños. Si la placa de crecimiento se lesiona, se puede formar tejido de reparación conocido como "barra ósea", que interrumpe el crecimiento normal y puede causar defectos de crecimiento o deformidades angulares. Los datos epidemiológicos han demostrado que entre el 15% y el 30% de todas las lesiones esqueléticas infantiles están relacionadas con la placa de crecimiento. La formación de barras óseas ocurre en hasta el 30% de estas lesiones, lo que hace que las lesiones de la placa de crecimiento y su tratamiento asociado sean un problema de manifestación clínica significativa 1,2,3,4. Cuando se produce la formación de barras óseas, la vía de tratamiento más común consiste en reseccionar la barra ósea e insertar un material interposicional, como silicio o tejido adiposo5. Sin embargo, los pacientes que se someten a cirugía de resección de barra ósea a menudo tienen un mal pronóstico para la recuperación completa, ya que actualmente no existe un tratamiento que pueda reparar completamente una placa de crecimiento lesionada 6,7,8. A la luz de estas deficiencias, existe una necesidad crítica de estrategias efectivas para tratar las lesiones de la placa de crecimiento, tanto para prevenir la formación de una barra ósea como para regenerar el tejido sano del cartílago físico.

Las micropartículas de hidrogel, o microgeles, han ganado interés recientemente como andamios inyectables que pueden proporcionar una liberación sostenida de terapias9. Debido a su alta capacidad de adaptación y biocompatibilidad, los microgeles también son adecuados para el factor bioactivo o la encapsulación celular. Los microgeles pueden estar hechos de diversos materiales, que van desde polímeros sintéticos, como el polietilenglicol (PEG), hasta polímeros naturales como el alginato o el quitosano 10,11,12. Se ha demostrado que el quitosano tiene varios efectos beneficiosos para la ingeniería de tejidos, como su capacidad para desestabilizar la membrana externa de las bacterias gramnegativas, ofreciendo así una actividad antimicrobiana inherente1 3,14. Además, el quitosano es rentable, interactivo con las células y se modifica fácilmente utilizando su estructura que contiene aminas. Los microgeles a base de quitosano prometen una estrategia de biomaterial para la administración de fármacos y la señalización de materiales que pueden promover la regeneración de tejidos al tiempo que previenen la infección bacteriana. Sin embargo, los microgeles de quitosano a menudo se fabrican con una amplia gama de técnicas que requieren equipos especiales, técnicas de emulsión o enjuagues con solventes citotóxicos. Por ejemplo, algunos estudios han fabricado microgeles de quitosano con métodos basados en emulsiones, pero estos protocolos requieren enjuagues con disolventes y reticulantes citotóxicos, lo que podría negar su traducción a entornos clínicos15,16. Otros estudios han utilizado enfoques de microfluídica o electropulverización para fabricar microgeles de quitosano, que requieren equipo especial, preparación y capacitación17,18. Los microgeles de quitosano también se hacen comúnmente con un proceso de reticulación en solución de quitosano; sin embargo, este método depende en gran medida de la viscosidad de la solución, la concentración del polímero y el caudal, lo que dificulta el control del tamaño y la dispersión de los microgeles19,20. Por el contrario, el método para la fabricación de microgeles descrito en este documento no requiere equipos especializados ni enjuagues con solventes, lo que hace que estos microgeles sean viables para la fabricación en casi cualquier laboratorio o entorno. Por lo tanto, estos microgeles representan biomateriales altamente relevantes para un vehículo de administración de medicamentos rápido, rentable y fácil de producir para muchas aplicaciones.

Al modular la composición de un microgel y las características del material, los investigadores pueden obtener un control preciso sobre el microambiente celular, dirigiendo así el comportamiento celular de una manera dependiente del material. Los microgeles pueden emplearse solos o combinarse con sistemas de biomateriales a granel para impartir funcionalidades específicas, como la liberación prolongada de factores bioactivos o la señalización especial precisa para células nativas o exógenas. Los biomateriales y los microgeles han surgido como vías de tratamiento atractivas para las lesiones de las placas de crecimiento. Se ha dedicado un esfuerzo significativo al desarrollo de biomateriales a base de alginato y quitosano para tratar las lesiones de la placa de crecimiento 21,22,23,24,25. Debido a la naturaleza temporal dinámica de la osificación de la placa de crecimiento y el alargamiento óseo, el mecanismo de formación de barras óseas no se entiende completamente. Por lo tanto, se han desarrollado varios modelos animales para dilucidar mejor los mecanismos de osificación endocondral y formación de barras óseas, como en ratas, conejos y ovejas 26,27,28. Uno de estos modelos es un modelo de lesión de placa de crecimiento de rata, que utiliza un defecto de perforación en la tibia de la rata para producir una barra ósea de una manera predecible y reproducible e imita las lesiones humanas en las tres zonas de la placa de crecimiento29,30. Varias estrategias basadas en biomateriales para tratar las lesiones de la placa de crecimiento se han probado utilizando este modelo. Además, se han desarrollado dos métodos diferentes para fabricar microgeles de quitosano, que pueden ser utilizados como un sistema de biomaterial inyectable que libera terapias de manera sostenida10,31. Estos microgeles se han empleado en un modelo de lesión física de rata, y mostraron una mejor regeneración del cartílago31 al liberar SDF-1a y TGF-b3. Las técnicas proporcionadas en este protocolo describen los métodos desarrollados para fabricar estos microgeles de quitosano, que luego se pueden emplear en una amplia variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, estudios recientes han utilizado microgeles de quitosano termo o magentos sensibles para aplicaciones de administración de fármacos oncológicos controlados32,33.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado en Denver. Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de 6 semanas de edad para el presente estudio. El modelo de lesión de la placa de crecimiento de la rata se creó a raíz de un informe publicado previamente30.

1. Preparación del polímero de quitosano

  1. Obtener quitosano purificado y liofilizado de bajo peso molecular (LMW) de fuentes disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales).
  2. Agregue 495 ml de agua de doble destilación (ddH2O) y una barra de agitación a un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 5 g de quitosano (Paso 1.1.) y mezclar bien.
    NOTA: El quitosano solo es escasamente soluble en una solución acuosa a pH fisiológico, por lo que el quitosano no se disolverá fácilmente en este paso.
  3. Agregue 5 ml de ácido acético glacial a la solución de quitosano preparada anteriormente.
  4. Revuelva cubierto a 300 rpm durante 18 h con el vaso de precipitados en un baño de agua a 50 °C.
  5. Utilizando un matraz y un embudo de Büchner, filtre la solución de quitosano a través de tamaños decrecientes de papel de filtro: 22 μm, 8 μm y 2,7 μm (ver Tabla de materiales).
  6. Agregue la solución de quitosano filtrada a los tubos de diálisis de celulosa (consulte la Tabla de materiales) y deje dializar en ddH2O a temperatura ambiente durante 4 días, cambiando el ddH2O todos los días.
    NOTA: Use agua ultrapura ddH2O para el último cambio.
  7. Transfiera la solución de quitosano dializado a un vaso de precipitados y ajuste el pH a 8.0 usando 1 M de NaOH.
  8. Alícuota el quitosano en tubos de centrífuga y centrífuga a 4000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  9. Decantar el sobrenadante a una corriente de residuos y resuspendir el quitosano en ddH2O, repitiendo 2x.
  10. Congelar y luego liofilizar la bolita de quitosano.
    1. Cada día, retire el producto liofilizado y registre la masa.
      NOTA: Cuando la masa del producto liofilizado ya no cambia, el producto se seca completamente y se puede almacenar a -20 °C hasta que esté listo para su uso.

2. Fabricación de hidrogel de quitosano

  1. Agregue 2 ml de ácido acético al 6% y 120 mg de quitosano purificado (Paso 1) a una jeringa Luer-lock de 10 ml para formar una solución de quitosano al 6% p/v.
  2. Conecte la jeringa Luer-lock a otra jeringa idéntica usando un conector Luer-lock hembra-hembra y mezcle la solución hacia adelante y hacia atrás durante 30 s, o hasta que el quitosano se haya disuelto completamente en el ácido acético.
  3. Antes de la reticulación, agregue cualquier agente terapéutico o bioactivo a la solución de quitosano (si es necesario). Para el presente estudio, se agregaron 200 ng de SDF-1a y TGF-b3 (ver Tabla de Materiales) a los microgeles.
    NOTA: SDF-1a y TGF-b3 son agentes bioactivos relevantes para la regeneración del tejido de la placa de crecimiento. SDF-1a promueve la migración de células madre mesenquimales al sitio del defecto, y TGF-b3 sirve como un factor condrogénico para inducir la diferenciación de estas células madre a lo largo del linaje condrogénico31.
    NOTA: Mezcle el quitosano nuevamente entre las jeringas para incorporar completamente la terapéutica.
  4. Preparar 100 mM de solución reticulante madre de geniapina (ver Tabla de Materiales) en etanol al 100%.
  5. Añadir 100 μL de la solución de genipina preparada (Paso 2.4.) a la jeringa que contiene quitosano, y mezclar de nuevo de un lado a otro entre las jeringas durante 30 s.
  6. Extruir la mezcla de la jeringa en una placa de Petri de 35 mm, cubrirla con una película de parafina e incubarla a 37 °C durante la noche en una atmósfera humidificada.
    NOTA: La solución se volverá azul oscuro, lo que indica que se ha producido la reacción de reticulación entre el quitosano y la genipina, lo que lleva a la formación de microgel de quitosano.
  7. Filtre el microgel de quitosano preparado siguiendo los pasos a continuación.
    1. Rompe suavemente el hidrogel en trozos más pequeños usando una espátula.
      NOTA: Las piezas deben ser lo suficientemente pequeñas como para ser transferidas a la parte posterior de una jeringa de 10 ml, ~ 1-2 cm de diámetro.
    2. Coloque un filtro del tamaño de malla deseado en la parte posterior de una jeringa limpia de 10 ml.
      NOTA: El rango de tamaño típico para microgeles está entre 50-200 μm.
    3. Transfiera las piezas de gel rotas a la jeringa equipada con el filtro y agregue 6 ml de ddH2O.
      NOTA: El gel de quitosano se hinchará significativamente en el medio acuoso, por lo que se espera un gran cambio en el volumen del gel.
    4. Conecte la jeringa a través de un conector Luer-lock a otra jeringa limpia de 10 ml.
    5. Forzar la mezcla de gel + agua a través de la jeringa con el filtro para crear microgeles con un diámetro máximo especificado.
      1. Después de la primera filtración, abra la parte posterior de la jeringa que contiene el filtro y extruya la mezcla de nuevo en esta jeringa.
      2. Reemplace la parte posterior de la jeringa y fuerce la mezcla a través del filtro nuevamente.
      3. Repita la filtración 5-6x o hasta que haya poca resistencia a través del filtro.
  8. Enjuague y purifique los microgeles filtrados.
    1. Transfiera la mezcla de gel filtrado a un tubo cónico de 50 ml, lleve el volumen total hasta 20 ml con ddH2O y luego vórtice la mezcla para garantizar una dispersión homogénea.
    2. Centrifugar los microgeles a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente y decantar la fase acuosa superior.
    3. Resuspender los microgeles en 10 ml de etanol al 70%, vórtice, y colocar bajo luz UV durante 1 h para esterilizar.
    4. Centrifugar los microgeles a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el etanol y enjuagar 3x con ddH2O.

3. Preparación de microgeles para aplicaciones in vitro o in vivo

NOTA: Para el presente estudio, la regeneración del cartílago en las lesiones de la placa de crecimiento se estudió en un modelo de rata. Para más detalles, véase la referencia31.

  1. Resuspend los gránulos de microgel 1:1 en ddH2O. Los microgeles se pueden almacenar hasta por 1 mes suspendidos en ddH2O a 4 °C. Si se utiliza un agente bioactivo, los microgeles deben usarse inmediatamente.
  2. Cree el sitio de la lesión en el animal siguiendo un informe publicado previamente30.
  3. Enjuague el sitio de la lesión con solución salina y mantenga al animal sin tratar (para el estudio de control) o inyecte solo los microgeles de quitosano o los microgeles cargados con los agentes bioactivos (Paso 3.2.).
  4. Cierre la herida en el animal y administre analgésicos postquirúrgicos30.
  5. En los días 7 o 28 después de la cirugía, sacrificar a la rata por sobredosis de CO2 , extirpar las extremidades y realizar histología para evaluar la reparación del tejido en el sitio de la lesión31.

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Representative Results

La fabricación exitosa de microgeles de quitosano se basa en la reacción de reticulación entre la genipina y el quitosano, involucrando específicamente las aminas en las cadenas de polímeros de quitosano. A diferencia de otras técnicas de fabricación de microgel, este método no requiere emulsiones ni enjuagues con disolvente y se puede realizar rápida y fácilmente con equipos de bajo costo. Un indicador distintivo para la fabricación exitosa de microgel es el cambio de color distintivo de blanquecino a azul oscuro después de que el quitosano y la genipina se hayan mezclado. La reacción de reticulación entre la genipina y los compuestos que contienen amina, como el quitosano u otras proteínas, ha sido bien caracterizada en la literatura34. En resumen, el mecanismo de reticulación se considera un ataque nucleófilo por los grupos amino del quitosano, en el que la genipina actúa como un dialdehído con productos de condensaciónestables 35. Las cadenas cortas de genipina condensada y estable actúan como puentes de reticulación entre los polímeros de quitosano. La reacción de reticulación hace que la solución se vuelva de color azul oscuro, probablemente debido a la polimerización inducida por radicales de oxígeno y la deshidrogenación de compuestos intermedios, que sigue a la reacción de apertura de anillo del ataque nucleófilo36.

Una vez que los microgeles han sido filtrados y resuspendidos en una dilución de agua 1: 1, se pueden emplear fácilmente en diversas aplicaciones de biomateriales. Recientemente se ha publicado un trabajo utilizando estos microgeles de quitosano sin emulsiones para promover la regeneración del cartílago en lesiones de placas de crecimiento. Los microgeles se fabricaron como se describe en este documento y se mantuvieron vacíos o cargados con SDF-1a y TGF-b3, que son agentes bioactivos que son relevantes en la regeneración del tejido de la placa de crecimiento, con SDF-1a promoviendo la migración de células madre mesenquimales al sitio del defecto y TGF-b3 sirviendo como un factor condrogénico para inducir la diferenciación de estas células madre a lo largo del linaje condrógeno37, 38. La tasa de liberación de las proteínas se cuantificó in vitro a través de ELISA, y la liberación de estas moléculas se mantuvo en el tiempo31. Luego, los microgeles se inyectaron en una lesión de la placa de crecimiento en un modelo de rata in vivo , y los microgeles inyectados evitaron la formación temprana de barras óseas in vivo31. Estos microgeles de quitosano inyectables, rentables y fáciles de producir podrían emplearse fácilmente en muchas aplicaciones de biomateriales.

Aunque este proceso para la fabricación de microgeles se ha optimizado para una configuración y aplicaciones simples, aún podrían surgir varios problemas que los investigadores deben tener en cuenta. La mezcla insuficiente del polímero y los componentes de reticulación es la causa más probable de diferentes resultados durante la fabricación. El quitosano sólido debe mezclarse vigorosamente entre las jeringas, y la solución de quitosano resultante debe ser completamente homogénea antes de agregar el reticulante de genipina. Si la solución no es homogénea, los trozos sólidos de quitosano que quedan en la solución formarán grumos, y se producirá una reticulación desigual, lo que impedirá un filtrado efectivo y dará como resultado microgeles polidispersados con diámetros significativamente variables. Otro factor importante a considerar durante la fabricación es evitar la evaporación durante el período de reticulación, que debe evitarse con película de parafina u otras técnicas de captura de evaporación. Si el hidrogel de quitosano se seca, no se hinchará durante los enjuagues con agua y no se filtrará a través de la jeringa. Por último, los microgeles deben suspenderse en exceso de agua durante el proceso de filtración y almacenarse en agua a 4 °C cuando no estén en uso. Los microgeles no son extruibles o inyectables a menos que estén suspendidos en al menos una dilución 1:1 de agua.

La Figura 1 muestra una amplia visión general del proceso de fabricación de microgel. El mismo proceso se representa nuevamente en la Figura 2, que muestra fotografías del proceso, enfatizando las etapas del protocolo que son difíciles de entender solo a partir del texto. Por ejemplo, la Figura 2D muestra cómo se inserta un filtro de malla de alambre en la jeringa de 10 ml. Una vez completamente asentado contra la parte superior de la jeringa, este filtro de malla de alambre permite una filtración rápida y conveniente de los microgeles de quitosano sin equipos especializados ni solventes. Del mismo modo, la Figura 2E muestra el flujo de gel de quitosano hidratado a través del filtro de malla, que es la base para la fabricación de microgel. La Figura 3 fue adaptada de nuestra publicación anterior sobre estos microgeles y muestra su comportamiento de hinchazón dependiente del pH y las diferencias en el tamaño de los microgeles dependiendo del tamaño de los poros del filtro de malla. Se pueden pedir diferentes tamaños de malla al fabricante, lo que permite un control conveniente sobre el tamaño de los microgeles. Este control preciso sobre el tamaño del microgel es muy importante cuando se diseñan sistemas de administración de fármacos con tasas de liberación de carga terapéutica bien definidas. Trabajos previos en microgeles también mostraron que se degradan significativamente en presencia de lisozima a las 2-4 semanas31. Finalmente, la Figura 4 muestra imágenes histológicas31 en un modelo de lesión de placa de crecimiento de ratas tratadas con los microgeles de quitosano cargados con SDF-1a y TGF-b3.

Figure 1
Figura 1: Descripción general esquemática de la fabricación de microgel de quitosano. La figura fue creada usando biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fotografías del proceso de fabricación de microgel. (A) Solución de quitosano en jeringas conectadas mediante cerradura Luer. (B) Extrusión de gel de quitosano en una placa de Petri de 35 mm. (C) Recuperación del gel de quitosano después de la reticulación del cambio de color de blanquecino a azul oscuro. (D) Vista de arriba hacia abajo dentro de la jeringa que muestra el tamiz de malla de alambre instalado contra la boquilla de la jeringa. (E) El gel de quitosano se presionó a través de un filtro de malla para producir microgeles. (F) Los microgeles se almacenaron en una dilución 1:1 de ddH2O en un tubo cónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comportamiento de hinchazón dependiente del pH de los microgeles. (A) Gráfico de distribución normal del diámetro de Feret que muestra el comportamiento de hinchazón de los microgeles en respuesta a los cambios de pH. (B) Imágenes fluorescentes de microgeles fabricados con malla No. 200 (imagen superior: microgeles de tamaño <75 μm) y malla No. 100 (imagen inferior: microgeles de tamaño 75-150 μm). La figura se reimprime con permiso de la referencia31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes histológicas en un modelo de lesión de placa de crecimiento de rata tratada con los microgeles de quitosano cargados con SDF-1a y TGF-b3. Imágenes histológicas 10x que muestran tejido de reparación de placa de crecimiento de tejido intacto (A) y (E), no tratado (B) y (F), microgel tratado (C) y (G), microgel + SDF-1a tratado (D) y (H), y microgel + TGF-b3 tratado (I ) extremidades. Ningún animal del día 7 fue tratado con microgel + TGFb3. La hematoxilina azul alciana (ABH) tiñe el hueso de naranja a rojo, el tejido fibroso de rosa y el cartílago de azul. El microgel aparece como un tejido fibroso de color rojo oscuro. Barras de escala = 500 μm. La figura se reimprime con permiso de la referencia31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los microgeles han sido ampliamente investigados en los últimos años debido a su alto nivel de aplicabilidad para diversos fines, como la administración de fármacos o la encapsulación celular9. La facilidad de fabricación de construcciones de biomateriales a microescala es de gran relevancia en la ingeniería de tejidos, ya que permite a los investigadores desarrollar estrategias basadas en hidrogel en un tamaño y escala de tiempo específicos. Sin embargo, la mayoría de los métodos para fabricar microgeles de quitosano requieren costosos equipos y reactivos, emulsiones o enjuagues con disolventes citotóxicos, lo que impide su traducción al uso clínico 15,16,17,18,19,20. Estos microgeles sobresalen en términos de su importante conveniencia de fabricación, sin requerir técnicas de emulsión o enjuagues con solventes. Además, estos microgeles conservan las propiedades ideales para una construcción de ingeniería tisular, como la hinchazón dependiente del pH y la carga de fármacos, el comportamiento de degradación sintonizado y la liberación sostenida de terapias.

El paso más crítico en la fabricación de estos microgeles de quitosano es la filtración entre jeringas. Estos microgeles comienzan como hidrogel a granel y se filtran a un rango de tamaño específico utilizando filtros de malla de alambre. Sin filtrado, la aplicabilidad de los microgeles, las propiedades mecánicas y las características de liberación del fármaco serían significativamente diferentes. El paso de filtrado permite un control preciso sobre el tamaño de los hidrogeles, y también permite la fabricación de microgeles de alto rendimiento que exhiben hinchazón dependiente del pH y liberación sostenida de terapias.

Una limitación de este proceso es que el paso de filtrado no condujo a hidrogeles con una forma perfectamente esférica, lo que puede ser un factor importante a considerar para algunas aplicaciones. Por esta razón, el tamaño característico de los microgeles se describió utilizando el diámetro de Feret (Figura 3), que es útil para cuantificar partículas de forma irregular39. Aunque la geometría de los microgeles no era una esfera perfecta, el tamaño promedio de las partículas era fácil de controlar en función del tamaño de malla del filtro de la jeringa y, para muchas aplicaciones, no es necesario tener partículas perfectamente esféricas. El índice de polidispersidad (PDI) de los microgeles se cuantificó utilizando la relación cuadrada de la desviación estándar del diámetro de Feret al diámetro medio de Feret obtenido de una gran población de partículas (n = 74). El PDI se calculó como 0,076 utilizando la ecuación

PDI = (s/D)2

donde s es la desviación estándar del diámetro medio de Feret y D es el diámetro medio de Feret40. Debido al filtrado realizado durante este proceso y al uso del diámetro de Feret para partículas de forma irregular, el índice de polidispersidad de estas partículas fue bastante bajo, hasta el punto de que podrían considerarse monodispersas.

Para futuras investigaciones, se podrían hacer varias modificaciones a este protocolo para adaptarse mejor a la necesidad de investigación dada. Por ejemplo, solo dos proteínas, SDF1-a y TGF-b3, han sido estudiadas para su liberación controlada con estos microgeles. Trabajos anteriores han demostrado la liberación sostenida de estos factores bioactivos hasta ~ 30 días in vitro. Sin embargo, también se podrían explorar otras terapias relevantes, como nanopartículas, moléculas interferentes de ARN (ARNi), otros productos biológicos o medicamentos de moléculas pequeñas para cuantificar su tasa de liberación y eficacia cuando se aplican con esta tecnología de microgel de quitosano. Otra variable que podría investigarse en el futuro es cambiar el rango de tamaño de los microgeles, lo que se hace simplemente cambiando el tamaño de malla del filtro de la jeringa. Esto también podría tener un impacto significativo en la tasa de liberación de terapias de los microgeles, lo que permite un control conveniente sobre la cinética de liberación sin alterar la química de la reticulación. Además, este protocolo se puede ampliar fácilmente utilizando jeringas y filtros más grandes o técnicas de filtración al vacío para producir grandes cantidades de microgeles de quitosano.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel del Instituto Nacional de Salud bajo los números de premio R03AR068087 y R21AR071585 y por la Fundación Boettcher (# 11219) a MDK. CBE fue apoyado por NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

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References

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Bioingeniería Número 182
Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos
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Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

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