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Bioengineering

ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आकार-नियंत्रित और इमल्शन-मुक्त चिटोसन-जेनिपिन माइक्रोगेल का निर्माण

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल चिटोसन-जेनिपिन माइक्रोगेल के निर्माण के लिए एक गैर-पायस-आधारित विधि का वर्णन करता है। इन माइक्रोगेल के आकार को ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है, और वे पीएच-निर्भर सूजन प्रदर्शित कर सकते हैं, विवो में नीचा दिखा सकते हैं, और चिकित्सीय अणुओं से भरे हुए हैं जो समय के साथ निरंतर तरीके से जारी होते हैं, जिससे उन्हें ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक प्रासंगिक बना दिया जाता है।

Abstract

चिटोसन माइक्रोगेल अपने अनुप्रयोगों की विस्तृत श्रृंखला, कम लागत और इम्युनोजेनेसिटी के कारण ऊतक इंजीनियरिंग में महत्वपूर्ण रुचि रखते हैं। हालांकि, चिटोसन माइक्रोगेल आमतौर पर पायस विधियों का उपयोग करके गढ़े जाते हैं जिनके लिए कार्बनिक विलायक कुल्ला की आवश्यकता होती है, जो पर्यावरण के लिए विषाक्त और हानिकारक होते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल कार्बनिक विलायक रिंस की आवश्यकता के बिना चिटोसन-जेनिपिन माइक्रोगेल बनाने के लिए एक तेजी से, गैर-साइटोटॉक्सिक, गैर-पायस-आधारित विधि प्रस्तुत करता है। यहां वर्णित माइक्रोगेल को सटीक आकार नियंत्रण के साथ गढ़ा जा सकता है। वे बायोमोलेक्यूल्स की निरंतर रिहाई का प्रदर्शन करते हैं, जिससे उन्हें ऊतक इंजीनियरिंग, बायोमटेरियल्स और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए अत्यधिक प्रासंगिक बना दिया जाता है। चिटोसन को हाइड्रोगेल नेटवर्क बनाने के लिए जेनिपिन के साथ क्रॉसलिंक किया जाता है, फिर माइक्रोगेल का उत्पादन करने के लिए एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित किया जाता है। माइक्रोगेल को आकारों की एक श्रृंखला बनाने के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है, और वे पीएच-निर्भर सूजन दिखाते हैं और समय के साथ एंजाइमेटिक रूप से नीचा दिखाते हैं। इन माइक्रोगेल को चूहे के विकास प्लेट चोट मॉडल में नियोजित किया गया है और बढ़ी हुई उपास्थि ऊतक की मरम्मत को बढ़ावा देने और विवो में 28 दिनों में पूर्ण गिरावट दिखाने के लिए प्रदर्शित किया गया था। उनकी कम लागत, उच्च सुविधा और साइटोकॉम्पैटिबल सामग्री के साथ निर्माण में आसानी के कारण, ये चिटोसन माइक्रोगेल ऊतक इंजीनियरिंग में एक रोमांचक और अनूठी तकनीक पेश करते हैं।

Introduction

विकास प्लेट, जिसे फिसिस के रूप में भी जाना जाता है, लंबी हड्डियों के अंत में स्थित उपास्थि संरचना है जो बच्चों में विकास की मध्यस्थता करती है। यदि विकास प्लेट घायल हो जाती है, तो "बोनी बार" के रूप में जाना जाने वाला मरम्मत ऊतक बन सकता है, जो सामान्य विकास को बाधित करता है और विकास दोष या कोणीय विकृति का कारण बन सकता है। महामारी विज्ञान के आंकड़ों से पता चला है कि सभी बचपन के कंकाल की चोटों का 15% -30% विकास प्लेट से संबंधित है। बोनी बार गठन इन चोटों के 30% तक होता है, जिससे विकास प्लेट की चोटें और उनके संबंधित उपचार एक महत्वपूर्ण नैदानिक अभिव्यक्ति मुद्दा 1,2,3,4 हो जाते हैं। जब बोनी बार गठन होता है, तो सबसे आम उपचार एवेन्यू में बोनी बार को लकीर करना और एक इंटरपोजिशनल सामग्री डालना शामिल होता है, जैसे कि सिलिकॉन या वसा ऊतक5। हालांकि, बोनी बार लकीर सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों में अक्सर पूर्ण वसूली के लिए एक खराब रोग का निदान होता है, क्योंकि वर्तमान में कोई उपचार नहीं है जो घायल विकास प्लेट 6,7,8 की पूरी तरह से मरम्मत कर सकता है। इन कमियों के प्रकाश में, विकास प्लेट की चोटों के इलाज के लिए प्रभावी रणनीतियों की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है, दोनों एक बोनी बार के गठन को रोकने और स्वस्थ शारीरिक उपास्थि ऊतक को पुनर्जीवित करने में।

हाइड्रोजेल माइक्रोपार्टिकल्स, या माइक्रोगेल, ने हाल ही में इंजेक्शन योग्य मचानों के रूप में रुचि प्राप्त की है जो चिकित्सीय9 की निरंतर रिहाई प्रदान कर सकते हैं। उनकी उच्च ट्यूनेबिलिटी और जैव-अनुकूलता के कारण, माइक्रोगेल बायोएक्टिव कारक या सेल एनकैप्सुलेशन के लिए भी अच्छी तरह से अनुकूल हैं। माइक्रोगेल विभिन्न सामग्रियों से बने हो सकते हैं, सिंथेटिक पॉलिमर, जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) से लेकर प्राकृतिक पॉलिमर जैसे अल्जीनेट या चिटोसन10,11,12 तक। चिटोसन को ऊतक इंजीनियरिंग के लिए कई लाभकारी प्रभाव दिखाए गए हैं, जैसे कि ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली को अस्थिर करने की इसकी क्षमता, जिससे अंतर्निहित रोगाणुरोधी गतिविधि1 3,14 की पेशकश होती है। इसके अतिरिक्त, चिटोसन लागत प्रभावी, सेल-इंटरैक्टिव है, और इसकी अमाइन युक्त संरचना का उपयोग करके आसानी से संशोधित किया गया है। चिटोसन-आधारित माइक्रोगेल दवा वितरण और सामग्री सिग्नलिंग के लिए एक बायोमैटेरियल रणनीति का वादा करते हैं जो जीवाणु संक्रमण को रोकने के दौरान ऊतक पुनर्जनन को बढ़ावा दे सकते हैं। हालांकि, चिटोसन माइक्रोगेल अक्सर तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ गढ़े जाते हैं जिनके लिए विशेष उपकरण, पायस तकनीक, या साइटोटॉक्सिक विलायक कुल्ला की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, कुछ अध्ययनों ने पायस-आधारित विधियों के साथ चिटोसन माइक्रोगेल का निर्माण किया है, लेकिन इन प्रोटोकॉल को विलायक कुल्ला और साइटोटॉक्सिक क्रॉसलिंकर्स की आवश्यकता होती है, संभावित रूप से नैदानिक सेटिंग्स15,16 में उनके अनुवाद को अस्वीकार करते हैं। अन्य अध्ययनों ने चिटोसन माइक्रोगेल बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स या इलेक्ट्रोस्प्रे दृष्टिकोण का उपयोग किया है, जिसके लिए विशेष उपकरण, तैयारी और प्रशिक्षण17,18 की आवश्यकता होती है। चिटोसन माइक्रोगेल भी आमतौर पर चिटोसन समाधान में क्रॉसलिंकर की ड्रॉपवाइज प्रक्रिया के साथ बनाए जाते हैं; हालांकि, यह विधि समाधान चिपचिपाहट, बहुलक एकाग्रता और प्रवाह दर पर अत्यधिक निर्भर है, जिससे माइक्रोगेल19,20 के आकार और फैलाव को नियंत्रित करना मुश्किल हो जाता है। इसके विपरीत, यहां वर्णित माइक्रोगेल फैब्रिकेशन की विधि के लिए कोई विशेषज्ञ उपकरण या विलायक कुल्ला की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे ये माइक्रोगेल लगभग किसी भी प्रयोगशाला या सेटिंग में निर्माण के लिए व्यवहार्य हो जाते हैं। इसलिए, ये माइक्रोगेल कई अनुप्रयोगों के लिए एक त्वरित, लागत प्रभावी और आसानी से उत्पादन करने वाले दवा वितरण वाहन के लिए अत्यधिक प्रासंगिक बायोमैटेरियल्स का प्रतिनिधित्व करते हैं।

एक माइक्रोगेल की संरचना और भौतिक विशेषताओं को संशोधित करके, शोधकर्ता सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट पर सटीक नियंत्रण प्राप्त कर सकते हैं, इस प्रकार सामग्री-निर्भर तरीके से सेल व्यवहार को निर्देशित कर सकते हैं। माइक्रोगेल को अपने दम पर नियोजित किया जा सकता है या विशिष्ट कार्यात्मकताओं को प्रदान करने के लिए थोक बायोमैटेरियल सिस्टम के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि बायोएक्टिव कारकों की विस्तारित रिहाई या देशी या बहिर्जात कोशिकाओं के लिए सटीक विशेष सिग्नलिंग। बायोमटेरियल्स और माइक्रोगेल विकास प्लेट की चोटों के लिए आकर्षक उपचार के रास्ते के रूप में उभरे हैं। विकास प्लेट चोटों21,22,23,24,25 के इलाज के लिए एल्गिनेट और चिटोसन-आधारित बायोमैटेरियल्स विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास समर्पित किया गया है। विकास प्लेट ओसिफिकेशन और हड्डी बढ़ाव की गतिशील अस्थायी प्रकृति के कारण, बोनी बार गठन का तंत्र पूरी तरह से समझा नहीं गया है। इसलिए, एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन और बोनी बार गठन के तंत्र को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने के लिए कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं, जैसे कि चूहों, खरगोशों और भेड़26,27,28 में। ऐसा ही एक मॉडल एक चूहे की वृद्धि प्लेट चोट मॉडल है, जो चूहे टिबिया में एक ड्रिल-होल दोष का उपयोग करता है ताकि अनुमानित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से बोनी बार का उत्पादन किया जा सके और विकास प्लेट 29,30 के सभी तीन क्षेत्रों में मानव चोटों की नकल की जासके। विकास प्लेट की चोटों के इलाज के लिए कई बायोमटेरियल-आधारित रणनीतियों का परीक्षण इस मॉडल का उपयोग करके किया गया है। इसके अतिरिक्त, चिटोसन माइक्रोगेल बनाने के लिए दो अलग-अलग तरीकों को विकसित किया गया है, जिसका उपयोग एक इंजेक्शन योग्य बायोमैटेरियल सिस्टम के रूप में किया जा सकता है जो निरंतर तरीके सेचिकित्सीय 10,31 जारी करता है। इन माइक्रोगेल को चूहे के शारीरिक चोट मॉडल में नियोजित किया गया है, और उन्होंने एसडीएफ -1 ए और टीजीएफ-बी3 जारी करते समय बेहतर उपास्थि पुनर्जनन 31 दिखाया। इस प्रोटोकॉल में प्रदान की गई तकनीकें इन चिटोसन माइक्रोगेल को बनाने के लिए विकसित विधियों का वर्णन करती हैं, जिन्हें तब विभिन्न प्रकार के ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में नियोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हाल के अध्ययनों ने नियंत्रित ऑन्कोलॉजिकल ड्रग डिलीवरी अनुप्रयोगों32,33 के लिए थर्मो- या मैजेंटो-उत्तरदायी चिटोसन माइक्रोगेल का उपयोग किया है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को कोलोराडो डेनवर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 6 सप्ताह के पुरुष स्प्राग-डॉली चूहों का उपयोग किया गया था। चूहे की वृद्धि प्लेट चोट मॉडल पहले प्रकाशित रिपोर्ट30 के बाद बनाया गया था।

1. चिटोसन बहुलक की तैयारी

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों से शुद्ध और लायोफिलाइज्ड कम आणविक भार (एलएमडब्ल्यू) चिटोसन प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. डबल-डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीएच2ओ) के 495 एमएल और 1 एल बीकर में एक हलचल बार जोड़ें। 5 ग्राम चिटोसन (चरण 1.1.) जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: चिटोसन केवल शारीरिक पीएच पर एक जलीय समाधान में संयम से घुलनशील है, इसलिए चिटोसन इस चरण में आसानी से भंग नहीं होगा।
  3. उपरोक्त तैयार चिटोसन समाधान में ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 5 एमएल जोड़ें।
  4. 50 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित पानी के स्नान में बीकर सेट के साथ 18 घंटे के लिए 300 आरपीएम पर कवर किया गया हिलाओ।
  5. बुचनर फ्लास्क और फ़नल का उपयोग करके, फ़िल्टर पेपर के घटते आकार के माध्यम से चिटोसन समाधान को फ़िल्टर करें: 22 μm, 8 μm, और 2.7 μm ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. सेलूलोज डायलिसिस टयूबिंग में फ़िल्टर किए गए चिटोसन समाधान को जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और 4 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर डीडीएच2ओ में डायलिज़ करने की अनुमति दें, हर दिन डीडीएच2ओ को बदल दें।
    नोट: अंतिम परिवर्तन के लिए अल्ट्राप्योर डीडीएच2ओ पानी का उपयोग करें।
  7. डायलाइज़्ड चिटोसन समाधान को बीकर में स्थानांतरित करें और 1 एम नाओएच का उपयोग करके पीएच को 8.0 में समायोजित करें।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में चिटोसन को विभाज्य।
  9. सतह पर तैरनेवाला को एक अपशिष्ट धारा में डिकैंट करें और डीडीएच2ओ में चिटोसन को फिर से निलंबित करें, 2 एक्स दोहराएं।
  10. फ्रीज करें और फिर चिटोसन गोली को लायोफिलाइज़ करें।
    1. प्रत्येक दिन, लायोफिलाइज्ड उत्पाद को हटा दें और द्रव्यमान रिकॉर्ड करें।
      नोट: जब लायोफिलाइज्ड उत्पाद का द्रव्यमान अब नहीं बदल रहा है, तो उत्पाद पूरी तरह से सूख जाता है और उपयोग के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. चिटोसन हाइड्रोजेल का निर्माण

  1. वी चिटोसन समाधान बनाने के लिए 10 एमएल लुएर-लॉक सिरिंज में 6% एसिटिक एसिड के 2 एमएल और शुद्ध चिटोसन (चरण 1) के 120 मिलीग्राम जोड़ें।
  2. लुएर-लॉक सिरिंज को मादा-मादा लुएर-लॉक कनेक्टर का उपयोग करके एक और समान सिरिंज से कनेक्ट करें और समाधान को 30 एस के लिए आगे और पीछे मिलाएं, या जब तक कि चिटोसन एसिटिक एसिड में पूरी तरह से भंग न हो जाए।
  3. क्रॉसलिंकिंग से पहले, चिटोसन समाधान (यदि आवश्यक हो) में किसी भी चिकित्सीय या बायोएक्टिव एजेंट को जोड़ें। वर्तमान अध्ययन के लिए, एसडीएफ -1 ए और टीजीएफ-बी 3 के 200 एनजी ( सामग्री की तालिका देखें) को माइक्रोगेल में जोड़ा गया था।
    नोट: एसडीएफ -1 ए और टीजीएफ-बी 3 विकास प्लेट ऊतक पुनर्जनन के लिए प्रासंगिक बायोएक्टिव एजेंट हैं। एसडीएफ -1 ए दोष स्थल पर मेसेंकाइमल स्टेम कोशिकाओं के प्रवास को बढ़ावा देता है, और टीजीएफ-बी 3 चोंड्रोजेनिक वंश31 के नीचे इन स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक चोंड्रोजेनिक कारक के रूप में कार्य करता है।
    नोट: चिकित्सीय को पूरी तरह से शामिल करने के लिए सिरिंज के बीच फिर से चिटोसन मिलाएं।
  4. 100% इथेनॉल में जेनिपिन के स्टॉक क्रॉसलिंकर समाधान के 100 एमएम तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. चिटोसन युक्त सिरिंज में तैयार जेनिपिन समाधान (चरण 2.4.) के 100 μL जोड़ें, और फिर से 30 एस के लिए सिरिंज के बीच आगे और पीछे मिलाएं।
  6. एक 35 मिमी पेट्री डिश पर सिरिंज से मिश्रण को बाहर निकालें, इसे पैराफिन फिल्म के साथ कवर करें, और इसे ह्यूमिडिफाइड वातावरण में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: समाधान गहरे नीले रंग में बदल जाएगा, यह दर्शाता है कि चिटोसन और जेनिपिन के बीच क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया हुई है, जिससे चिटोसन माइक्रोगेल का गठन हुआ है।
  7. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए तैयार चिटोसन माइक्रोगेल को फ़िल्टर करें।
    1. धीरे-धीरे हाइड्रोगेल को एक स्पैटुला का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में तोड़ दें।
      नोट: टुकड़े 10 एमएल सिरिंज के पीछे स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त छोटे होने चाहिए, ~ व्यास में ~ 1-2 सेमी।
    2. एक साफ 10 एमएल सिरिंज के पीछे वांछित जाल आकार का एक फिल्टर रखें।
      नोट: माइक्रोगेल के लिए विशिष्ट आकार सीमा 50-200 μm के बीच है।
    3. फ़िल्टर के साथ लगाए गए सिरिंज में टूटे हुए जेल के टुकड़ों को स्थानांतरित करें और डीडीएच2ओ के 6 एमएल जोड़ें।
      नोट: चिटोसन जेल जलीय माध्यम में काफी सूजन हो जाएगा, इसलिए जेल की मात्रा में एक बड़ा बदलाव होने की उम्मीद है।
    4. एक लुएर-लॉक कनेक्टर के माध्यम से सिरिंज को एक और साफ 10 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें।
    5. एक निर्दिष्ट अधिकतम व्यास के साथ माइक्रोगेल बनाने के लिए फ़िल्टर के साथ सिरिंज के माध्यम से जेल + पानी के मिश्रण को मजबूर करें।
      1. पहले निस्पंदन के बाद, फ़िल्टर युक्त सिरिंज के पीछे खोलें और मिश्रण को इस सिरिंज में वापस निकाल दें।
      2. सिरिंज के पीछे की जगह और मिश्रण को फिर से फिल्टर के माध्यम से मजबूर करें।
      3. निस्पंदन 5-6x दोहराएं या जब तक फ़िल्टर के माध्यम से थोड़ा प्रतिरोध न हो।
  8. फ़िल्टर किए गए माइक्रोगेल को कुल्ला और शुद्ध करें।
    1. फ़िल्टर्ड जेल मिश्रण को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें,डीडीएच 2ओ के साथ कुल मात्रा को 20 एमएल तक लाएं, और फिर सजातीय फैलाव सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण को भंवर करें।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी पर माइक्रोगेल को अपकेंद्रित्र करें और ऊपरी जलीय चरण को कम करें।
    3. 70% इथेनॉल, भंवर के 10 एमएल में माइक्रोगेल को फिर से निलंबित करें, और 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के तहत निष्फल करने के लिए रखें।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1,000 एक्स जी पर माइक्रोगेल को अपकेंद्रित्र करें, इथेनॉल को त्यागें, और डीडीएच2ओ के साथ 3 एक्स कुल्ला।

3. इन विट्रो या विवो अनुप्रयोगों में के लिए माइक्रोगेल की तैयारी

नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, विकास प्लेट की चोटों में उपास्थि पुनर्जनन का अध्ययन चूहे मॉडल में किया गया था। विवरण के लिए, संदर्भ31 देखें।

  1. माइक्रोगेल छर्रों को डीडीएच2ओ में माइक्रोगेल छर्रों 1: 1 को फिर से निलंबित करें माइक्रोगेल को 4 डिग्री सेल्सियस पर डीडीएच2ओ में निलंबित 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि एक बायोएक्टिव एजेंट का उपयोग किया जाता है, तो माइक्रोगेल का उपयोग तुरंत किया जाना चाहिए।
  2. पहले प्रकाशित रिपोर्ट30 के बाद जानवर में चोट साइट बनाएं।
  3. खारा के साथ चोट साइट फ्लश और या तो पशु अनुपचारित रखें (नियंत्रण अध्ययन के लिए) या केवल चिटोसन माइक्रोगेल या बायोएक्टिव एजेंटों (चरण 3.2.) के साथ लोड किए गए माइक्रोगेल को इंजेक्ट करें।
  4. जानवर में घाव को बंद करें और पोस्ट-सर्जिकल एनाल्जेसिक30 का प्रशासन करें।
  5. सर्जरी के बाद 7 या 28 दिनों में, सीओ2 ओवरडोज द्वारा चूहे को euthanize, अंगों आबकारी और चोट स्थल31 पर ऊतक की मरम्मत का आकलन करने के लिए ऊतक विज्ञान प्रदर्शन।

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Representative Results

चिटोसन माइक्रोगेल का सफल निर्माण जेनिपिन और चिटोसन के बीच क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है, जिसमें विशेष रूप से चिटोसन बहुलक श्रृंखलाओं पर अमाइन शामिल होते हैं। अन्य माइक्रोगेल फैब्रिकेशन तकनीकों के विपरीत, इस विधि को इमल्शन या विलायक कुल्ला की आवश्यकता नहीं होती है और सस्ती उपकरणों के साथ जल्दी और आसानी से आयोजित किया जा सकता है। सफल माइक्रोगेल फैब्रिकेशन के लिए एक हॉलमार्क संकेतक चिटोसन और जेनिपिन को मिश्रित करने के बाद ऑफ-व्हाइट से गहरे नीले रंग में अलग-अलग रंग परिवर्तन है। जेनिपिन और अमीन युक्त यौगिकों, जैसे कि चिटोसन या अन्य प्रोटीन के बीच क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया, साहित्य34 में अच्छी तरह से विशेषता है। संक्षेप में, क्रॉसलिंकिंग तंत्र को चिटोसन के अमीनो समूहों द्वारा न्यूक्लियोफिलिक हमला माना जाता है, जिसमें जेनिपिन स्थिर संक्षेपण उत्पादों35 के साथ एक डाइएल्डिहाइड के रूप में कार्य करता है। स्थिर, संघनित जेनिपिन की छोटी श्रृंखलाएं चिटोसन पॉलिमर के बीच क्रॉसलिंकिंग पुलों के रूप में कार्य करती हैं। क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया समाधान को गहरे नीले रंग में बदलने का कारण बनती है, संभवतः ऑक्सीजन कट्टरपंथी-प्रेरित बहुलकीकरण और मध्यवर्ती यौगिकों के डिहाइड्रोजनीकरण के कारण, जो न्यूक्लियोफिलिक हमले36 से अंगूठी खोलने की प्रतिक्रिया का अनुसरण करती है।

एक बार जब माइक्रोगेल को फ़िल्टर किया जाता है और 1: 1 पानी के कमजोर पड़ने में फिर से निलंबित कर दिया जाता है, तो उन्हें विभिन्न बायोमटेरियल अनुप्रयोगों में आसानी से नियोजित किया जा सकता है। विकास प्लेट की चोटों में उपास्थि पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए हाल ही में इन पायस मुक्त चिटोसन माइक्रोगेल का उपयोग करके काम प्रकाशित किया गया है। माइक्रोगेल को यहां वर्णित के रूप में गढ़ा गया था और या तो खाली रखा गया था या एसडीएफ -1 ए और टीजीएफ-बी 3 के साथ लोड किया गया था, जो बायोएक्टिव एजेंट हैं जो विकास प्लेट ऊतक पुनर्जनन में प्रासंगिक हैं, एसडीएफ -1 ए के साथ मेसेंकाइमल स्टेम कोशिकाओं के माइग्रेशन को बढ़ावा देने के लिए दोष स्थल और टीजीएफ-बी 3 एक चोंड्रोजेनिक कारक के रूप में सेवा करते हैं ताकि चोंड्रोजेनिक वंश37 के नीचे इन स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित किया जा सके, 38. प्रोटीन की रिहाई दर एलिसा के माध्यम से इन विट्रो में मात्रा निर्धारित की गई थी, और इन अणुओं की रिहाई समय31 के साथ निरंतर थी। फिर, माइक्रोगेल को इन विवो चूहे मॉडल में विकास प्लेट की चोट में इंजेक्ट किया गया था, और इंजेक्शन वाले माइक्रोगेल ने विवो31 में शुरुआती बोनी बार गठन को रोका। इन इंजेक्शन, लागत प्रभावी, और सरल-से-उत्पादन चिटोसन माइक्रोगेल को आसानी से कई बायोमैटेरियल अनुप्रयोगों में नियोजित किया जा सकता है।

यद्यपि माइक्रोगेल फैब्रिकेशन के लिए इस प्रक्रिया को सरल सेटअप और अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया गया है, फिर भी कई समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं जो शोधकर्ताओं को सावधान रहना चाहिए। बहुलक और क्रॉसलिंकिंग घटकों का अपर्याप्त मिश्रण निर्माण के दौरान विभिन्न परिणामों का सबसे संभावित कारण है। ठोस चिटोसन को सिरिंज के बीच सख्ती से मिलाया जाना चाहिए, और परिणामस्वरूप चिटोसन समाधान जेनिपिन क्रॉसलिंकर को जोड़ने से पहले पूरी तरह से समरूप होना चाहिए। यदि समाधान समरूप नहीं है, तो समाधान में शेष ठोस चिटोसन टुकड़े गांठ बनाएंगे, और असमान क्रॉसलिंकिंग होगी, प्रभावी फ़िल्टरिंग को रोकदेगा और जिसके परिणामस्वरूप पॉली-छितरी हुई माइक्रोगेल काफी अलग-अलग व्यास के साथ होगी। फैब्रिकेशन के दौरान विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक क्रॉसलिंकिंग अवधि के दौरान वाष्पीकरण से बचना है, जिसे पैराफिन फिल्म या अन्य वाष्पीकरण-फँसाने वाली तकनीकों के साथ रोका जाना चाहिए। यदि चिटोसन हाइड्रोगेल सूख जाता है, तो यह पानी के कुल्ला के दौरान सूजन नहीं करेगा, और यह सिरिंज के माध्यम से फ़िल्टर नहीं करेगा। अंत में, माइक्रोगेल को निस्पंदन प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त पानी में निलंबित किया जाना चाहिए और उपयोग में नहीं होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी में संग्रहीत किया जाना चाहिए। माइक्रोगेल एक्सट्रूडेबल या इंजेक्शन योग्य नहीं हैं जब तक कि पानी के कम से कम 1: 1 कमजोर पड़ने में निलंबित नहीं किया जाता है।

चित्रा 1 माइक्रोगेल निर्माण प्रक्रिया का एक व्यापक सिंहावलोकन दिखाता है। उसी प्रक्रिया को चित्रा 2 में फिर से चित्रित किया गया है, जो प्रक्रिया की तस्वीरों को दिखाता है, प्रोटोकॉल चरणों पर जोर देता है जो अकेले पाठ से समझना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, चित्रा 2 डी से पता चलता है कि 10 एमएल सिरिंज में एक तार जाल फ़िल्टर कैसे डाला जाता है। एक बार सिरिंज के शीर्ष के खिलाफ पूरी तरह से बैठे होने के बाद, यह तार जाल फ़िल्टर विशेषज्ञ उपकरण या सॉल्वैंट्स के बिना चिटोसन माइक्रोगेल के त्वरित और सुविधाजनक निस्पंदन की अनुमति देता है। इसी तरह, चित्रा 2 ई जाल फिल्टर के माध्यम से हाइड्रेटेड चिटोसन जेल के प्रवाह को दर्शाता है, जो माइक्रोगेल फैब्रिकेशन का आधार है। चित्रा 3 इन माइक्रोगेल पर हमारे पिछले प्रकाशन से अनुकूलित किया गया था और उनके पीएच-निर्भर सूजन व्यवहार और जाल फिल्टर के छिद्र आकार पर निर्भर माइक्रोगेल के आकार में अंतर दिखाता है। निर्माता से विभिन्न जाल आकारों का आदेश दिया जा सकता है, जो माइक्रोगेल के आकार पर सुविधाजनक नियंत्रण की अनुमति देता है। माइक्रोगेल आकार पर यह सटीक नियंत्रण अत्यधिक महत्वपूर्ण है जब अच्छी तरह से परिभाषित चिकित्सीय लोड रिलीज दरों के साथ दवा वितरण प्रणालियों को डिजाइन किया जाता है। माइक्रोगेल पर पिछले काम से यह भी पता चला है कि वे 2-4 सप्ताह31 में लाइसोजाइम की उपस्थिति में काफी गिरावट करते हैं। अंत में, चित्रा 4 एसडीएफ -1 ए और टीजीएफ-बी3 के साथ लोड किए गए चिटोसन माइक्रोगेल के साथ इलाज किए गए चूहे के विकास प्लेट चोट मॉडल में हिस्टोलॉजी छवियों 31 को दर्शाता है।

Figure 1
चित्रा 1: चिटोसन माइक्रोगेल फैब्रिकेशन का योजनाबद्ध अवलोकन। यह आंकड़ा biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोगेल फैब्रिकेशन प्रक्रिया की तस्वीरें( ए) लुएर लॉक का उपयोग करके जुड़े सिरिंज में चिटोसन समाधान। (बी) 35 मिमी पेट्री डिश में चिटोसन जेल का एक्सट्रूज़न। (सी) क्रॉसलिंकिंग रंग परिवर्तन के बाद चिटोसन जेल की पुनर्प्राप्ति ऑफ-व्हाइट से गहरे नीले रंग में बदल जाती है। (डी) सिरिंज के अंदर शीर्ष-डाउन दृश्य सिरिंज के नोजल के खिलाफ लगाए गए तार जाल छलनी को दिखा रहा है। (ई) चिटोसन जेल को माइक्रोगेल का उत्पादन करने के लिए एक जाल फिल्टर के माध्यम से दबाया गया था। (एफ) माइक्रोगेल को एक शंक्वाकार ट्यूब में डीडीएच2ओ के 1: 1 कमजोर पड़ने में संग्रहीत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोगेल के पीएच-निर्भर सूजन व्यवहार (ए) पीएच परिवर्तनों के जवाब में माइक्रोगेल के सूजन व्यवहार को दिखाते हुए फेरेट व्यास का सामान्य वितरण ग्राफ। (बी) संख्या 200 जाल (ऊपरी छवि: <75 μm आकार के माइक्रोगेल) और नंबर 100 जाल (निचली छवि: 75-150 μm आकार के माइक्रोगेल) का उपयोग करके गढ़े गए माइक्रोगेल की फ्लोरोसेंट छवियां। यह आंकड़ा संदर्भ31 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक चूहे के विकास प्लेट चोट मॉडल में हिस्टोलॉजी छवियों को एसडीएफ -1 ए और टीजीएफ-बी 3 के साथ लोड किए गए चिटोसन माइक्रोगेल के साथ इलाज किया जाता है। 10 एक्स हिस्टोलॉजिकल छवियां बरकरार (ए) और (ई), अनुपचारित (बी) और (एफ), माइक्रोगेल उपचारित (सी) और (जी), माइक्रोगेल + एसडीएफ -1 ए इलाज (डी) और (एच), और माइक्रोगेल + टीजीएफ-बी 3 का इलाज (आई) के विकास प्लेट मरम्मत ऊतक दिखाते हैं ) अंग। किसी भी दिन 7 जानवरों को माइक्रोगेल + टीजीएफबी 3 के साथ इलाज नहीं किया गया था एल्सियन ब्लू हेमटोक्सिलिन (एबीएच) हड्डी नारंगी को लाल, रेशेदार ऊतक गुलाबी और उपास्थि नीले रंग में दाग देता है। माइक्रोगेल एक गहरे लाल रेशेदार जैसे ऊतक के रूप में दिखाई देता है। स्केल बार = 500 μm। यह आंकड़ा संदर्भ31 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विभिन्न उद्देश्यों के लिए प्रयोज्यता के उच्च स्तर के कारण हाल के वर्षों में माइक्रोगेल पर व्यापक रूप से शोध किया गया है, जैसे कि दवा वितरण या सेल एनकैप्सुलेशन9। सूक्ष्म पैमाने पर बायोमैटेरियल निर्माणों के निर्माण में आसानी ऊतक इंजीनियरिंग में महत्वपूर्ण प्रासंगिकता है, क्योंकि यह शोधकर्ताओं को एक विशिष्ट आकार और समय के पैमाने पर हाइड्रोजेल-आधारित रणनीतियों को विकसित करने की अनुमति देता है। हालांकि, चिटोसन माइक्रोगेल बनाने के लिए अधिकांश तरीकों को महंगे उपकरण और अभिकर्मकों, इमल्शन, या साइटोटॉक्सिक विलायक रिंस की आवश्यकता होती है, जो नैदानिक उपयोग15,16,17,18,19,20 के लिए उनके अनुवाद को रोकता है। ये माइक्रोगेल फैब्रिकेशन की अपनी महत्वपूर्ण सुविधा के संदर्भ में उत्कृष्टता प्राप्त करते हैं, जिसमें कोई पायस तकनीक या विलायक कुल्ला की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, ये माइक्रोगेल ऊतक-इंजीनियर निर्माण के लिए आदर्श गुणों को बनाए रखते हैं, जैसे कि पीएच-निर्भर सूजन और दवा लोडिंग, ट्यून किए गए गिरावट व्यवहार, और चिकित्सीय की निरंतर रिहाई।

इन चिटोसन माइक्रोगेल को बनाने में सबसे महत्वपूर्ण कदम सिरिंज के बीच निस्पंदन है। ये माइक्रोगेल थोक हाइड्रोगेल के रूप में शुरू होते हैं और तार जाल फिल्टर का उपयोग करके एक विशिष्ट आकार सीमा तक फ़िल्टर किए जाते हैं। फ़िल्टरिंग के बिना, माइक्रोगेल की प्रयोज्यता, यांत्रिक गुण और दवा रिलीज विशेषताएं काफी अलग होंगी। फ़िल्टरिंग चरण हाइड्रोगेल के आकार पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है, और यह माइक्रोगेल के उच्च थ्रूपुट फैब्रिकेशन की भी अनुमति देता है जो पीएच-निर्भर सूजन और चिकित्सीय की निरंतर रिहाई का प्रदर्शन करता है।

इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि फ़िल्टरिंग चरण ने पूरी तरह से गोलाकार आकार के साथ हाइड्रोगेल का नेतृत्व नहीं किया, जो कुछ अनुप्रयोगों के लिए विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। इस कारण से, माइक्रोगेल के विशिष्ट आकार को फेरेट व्यास (चित्रा 3) का उपयोग करके वर्णित किया गया था, जो अनियमित आकार के कणों39 को निर्धारित करने के लिए उपयोगी है। यद्यपि माइक्रोगेल की ज्यामिति एक आदर्श क्षेत्र नहीं थी, लेकिन सिरिंज फ़िल्टर के जाल आकार के आधार पर कणों के औसत आकार को नियंत्रित करना आसान था, और, कई अनुप्रयोगों के लिए, पूरी तरह से गोलाकार कणों का होना आवश्यक नहीं है। माइक्रोगेल्स के पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) को कणों की एक बड़ी आबादी (एन = 74) से प्राप्त औसत फेरेट व्यास के लिए फेरेट व्यास के मानक विचलन के वर्ग-अनुपात का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी। समीकरण का उपयोग करके पीडीआई की गणना 0.076 के रूप में की गई थी

पीडीआई = (एस / डी) 2

जहां एस औसत फेरेट व्यास का मानक विचलन है और डी औसत फेरेट व्यास40 है। इस प्रक्रिया के दौरान किए गए फ़िल्टरिंग और अनियमित आकार के कणों के लिए फेरेट व्यास के उपयोग के कारण, इन कणों का पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स काफी कम था, इस हद तक कि उन्हें मोनोडिस्पर्स माना जा सकता था।

भविष्य के अनुसंधान के लिए, इस प्रोटोकॉल में कई संशोधन दिए गए शोध की आवश्यकता को बेहतर ढंग से फिट करने के लिए किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, केवल दो प्रोटीन, एसडीएफ 1-ए और टीजीएफ-बी 3, इन माइक्रोगेल के साथ उनकी नियंत्रित रिहाई के लिए अध्ययन किया गया है। पिछले काम ने इन बायोएक्टिव कारकों की निरंतर रिहाई को इन विट्रो में ~ 30 दिनों तक दिखाया है। हालांकि, अन्य प्रासंगिक चिकित्सीय, जैसे नैनोकणों, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) अणुओं, अन्य जीवविज्ञान, या छोटे अणु दवाओं को भी इस चिटोसन माइक्रोगेल तकनीक के साथ लागू होने पर उनकी रिहाई दर और प्रभावकारिता को मापने के लिए खोजा जा सकता है। एक अन्य चर जिसकी भविष्य में जांच की जा सकती है, वह माइक्रोगेल की आकार सीमा को बदल रहा है, जो सिरिंज फ़िल्टर के जाल आकार को बदलकर किया जाता है। यह माइक्रोगेल से चिकित्सीय की रिहाई दर पर भी महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है, जिससे क्रॉसलिंकिंग के रसायन विज्ञान को बदलने के बिना रिलीज कैनेटीक्स पर सुविधाजनक नियंत्रण की अनुमति मिलती है। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को बड़ी मात्रा में चिटोसन माइक्रोगेल का उत्पादन करने के लिए बड़ी सीरिंज और फिल्टर या वैक्यूम निस्पंदन तकनीकों का उपयोग करके आसानी से बढ़ाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोगों द्वारा पुरस्कार संख्या आर 03 एआर 068087 और आर 21 एआर 071585 के तहत और बोएटचर फाउंडेशन (# 11219) द्वारा एमडीके को समर्थित किया गया था। एनसीएटीएस कोलोराडो सीटीएसए अनुदान संख्या टीएल 1 टीआर 001081 द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 182
ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आकार-नियंत्रित और इमल्शन-मुक्त चिटोसन-जेनिपिन माइक्रोगेल का निर्माण
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Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

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