Summary
La tecnica peel-blot è un metodo di preparazione della griglia crio-EM che consente la separazione di campioni biologici multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione del campione e facilitare l'elaborazione delle immagini.
Abstract
La tecnica di preparazione della griglia crio-EM peel-blot è un metodo di back-injection significativamente modificato con l'obiettivo di ottenere una riduzione degli strati di campioni multistrato. Questa rimozione degli strati prima del congelamento a tuffo può aiutare a ridurre lo spessore del campione a un livello adatto alla raccolta di dati crio-EM, migliorando la planarità del campione e facilitando l'elaborazione delle immagini. La tecnica peel-blot consente la separazione di membrane multilamellari in singoli strati, di cristalli 2D stratificati in singoli cristalli e di strutture impilate simili a fogli di proteine solubili da separare allo stesso modo in singoli strati. L'elevato spessore del campione di questi tipi di campioni pone spesso problemi insormontabili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione di immagini crio-EM, specialmente quando lo stadio del microscopio deve essere inclinato per la raccolta dei dati. Inoltre, le griglie di alte concentrazioni di uno qualsiasi di questi campioni possono essere preparate per una raccolta efficiente dei dati poiché la concentrazione del campione prima della preparazione della griglia può essere aumentata e la tecnica peel-blot regolata per ottenere una distribuzione densa di campione a strato singolo.
Introduction
La tecnica peel-blot è stata sviluppata per separare cristalli bidimensionali impilati di proteine di membrana in singoli strati per ottenere campioni adeguatamente sottili per la raccolta di dati crio-EM 2D e 3D e facilitare l'elaborazione delle immagini1. Il protocollo è adatto allo stesso modo per altri tipi di campioni multilamellari e per ottenere elevate concentrazioni di campioni di entrambi i tipi di campioni sulla griglia senza aumentare lo spessore in Z.
La riduzione degli strati di campione a uno strato si ottiene applicando una combinazione di pressione capillare e forze di taglio in un protocollo che estende e modifica sostanzialmente il metodo di back-injection2. Una prima fase di blotting si traduce in uno stretto sandwiching e aderenza al film di carbonio e una barra della griglia su entrambi i lati del campione multistrato durante la blotting su submicron piuttosto che la dimensione dei pori della carta da filtro di 20-25 μm nel metodo di back-injection. La separazione, o peeling, di un singolo strato avviene forzando la separazione degli strati a sandwich una volta che la griglia viene premuta verticalmente su una goccia di trealosio, forzando il film di carbonio lontano dalla barra della griglia (Figura 1). Il riposizionamento del film di carbonio lontano dal punto di contatto originale con la barra della griglia avviene nella fase successiva, quando la griglia viene nuovamente cancellata su carta da filtro submicron. Il numero di iterazioni di questi passaggi può essere ottimizzato per campioni specifici. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per aumentare le concentrazioni del campione evitando l'aggregazione in Z. A causa della dipendenza dall'aderenza alla barra della griglia e al film di carbonio, nonché della separazione forzata, questo approccio potrebbe non essere adatto per molecole altamente fragili come alcune proteine delicate e / o instabili e complessi proteici.
La tecnica peel-blot non richiede attrezzature specializzate né costose forniture. L'applicabilità a campioni specifici richiederà, tuttavia, un'attenta considerazione dei parametri biologici. La decisione è più facile per i cristalli 2D poiché è necessaria una pellicola di carbonio per garantire la planarità, ma la manipolazione tramite la tecnica peel-blot può influire sull'integrità biologica del campione o sull'ordine cristallino. L'idoneità della tecnica peel-blot a singole particelle è limitata e può essere testata per quelle che richiedono pellicola di carbonio e sono stabili alla manipolazione. I campioni con interazioni biologiche critiche tra gli strati potrebbero non essere adatti per la caratterizzazione con l'aiuto della tecnica peel-blot a causa dell'interruzione di tali interazioni.
La tecnica peel-blot ("peel-blot") viene ottimizzata più rapidamente testando e vagliando con macchie negative o campioni non colorati da TEM a temperatura ambiente. Una volta identificato il numero ottimale di iterazioni peel-blot, è possibile determinare il tempo necessario per controllare lo spessore prima della vetrificazione.
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Protocol
1. Fasi di preparazione per la tecnica peel-blot
Nota : la preparazione richiede che i seguenti elementi siano posizionati adiacenti l'uno all'altro.
- Impilare due pezzi di carta da filtro da 20-25 μm (vedi Tabella dei materiali).
- Posizionare un film di paraffina lungo ~ 8 cm x 10 cm adiacente alla carta da filtro con la carta rivolta verso l'alto.
- Posizionare un pezzo di carta da filtro submicron sopra altri due pezzi di carta da filtro #4 (Figura 1-1).
- Posizionare la pinza anti-capillare con la gamba piegata rivolta verso l'alto e la gamba dritta rivolta verso il basso. Quindi, selezionare una griglia a 600 maglie con il lato liscio / lucido verso l'alto. Posizionare la pinza su una piastra di Petri o su un'altra superficie rialzata per evitare il contatto della griglia pulita con altri oggetti.
- Rimuovere la carta dal film di paraffina e tirare i lati (~ 5 mm) per creare un piccolo bordo. Pipettare due gocce da 150 μL di soluzione di trealosio al 4% ~1-2 cm da un lato corto del film di paraffina e ~1 cm di distanza sul film di paraffina.
- Su una panca separata o sul pavimento, versare azoto liquido in un piccolo contenitore di polistirene espanso (vedi Tabella dei materiali).
ATTENZIONE: Ricevere una formazione per una corretta manipolazione utilizzando guanti e una visiera per evitare il morso di gelo. - Posizionare un piccolo contenitore griglia crio-EM nell'azoto liquido e coprire il contenitore in polistirene espanso con salviette prive di lanugine.
2. Posizionamento del film di carbonio sulla griglia
- Utilizzare la pinza Dumont #5 (vedi Tabella dei materiali) per far galleggiare il film di carbonio dalla mica toccando un lato della mica con una leggera angolazione verso il basso (~ 20 ° -40 °) su una delle gocce di soluzione di trealosio e lentamente lasciare che la tensione dell'acqua si sollevi dal film di carbonio spostando la mica verso il basso. Rilasciare la mica una volta che il film di carbonio galleggia sulla superficie della goccia.
- Ispezionare visivamente il film di carbonio per evitare l'uso di carbonio con danni sotto forma di fratture.
- Inserire la griglia tenuta dalla pinza anti-capillare con un angolo (~20°-30°) in una goccia di trealosio in una posizione adiacente e quindi centrata sotto il film di carbonio. Raccogliere il film di carbonio (Figura 1-2).
- Mantenere la griglia nello stesso orientamento e abbassarla lentamente sulla superficie della seconda goccia di trealosio senza rompere la tensione superficiale della goccia per rimuovere la pellicola di carbonio non necessaria che potrebbe essersi avvolta attorno al bordo della griglia sul lato ruvido.
3. Separazione di cristalli 2D multistrato in singoli strati
- Ruotare le pinze anti-capillari (vedi Tabella dei materiali) e posizionarle su una piastra di Petri con il lato in carbonio della griglia rivolto verso il basso (Figura 1-3).
- Pipettare 1,3 μL del campione nel leggero menisco del trealosio sulla parte superiore della griglia. Pipettare la soluzione ~ 8-10 volte per mescolare e distribuire il trealosio e il campione su entrambi i lati della griglia.
- Durante l'incubazione della soluzione per 1 minuto, pipettare una o più gocce da 1,7 μL di soluzione di trealosio sul film di paraffina.
- Ruotare la griglia nella sua posizione originale con il film di carbonio rivolto verso l'alto.
- Utilizzare la pinza anti-capillare per premere la griglia sulla carta da filtro submicronica (Figura 1-4). Una volta che la soluzione è stata assorbita dalla carta da filtro e il film di carbone è piatto, attendere 3 secondi prima di sollevare la griglia e spostarla verticalmente sulla goccia da 1,7 μL della soluzione di trealosio (Figura 1-5).
NOTA: ripetere questo passaggio più volte per campioni altamente impilati o la griglia viene preparata per la vetrificazione nei passaggi successivi. - Asciugare la griglia sui due pezzi di carta da filtro, quindi sollevare la griglia dalla carta da filtro (Figura 1-6). Dopo circa 13 secondi, a seconda dell'umidità e del tampone del campione, immergere la griglia nell'azoto liquido nel piccolo contenitore di polistirolo e posizionare la griglia nel contenitore della griglia crio-EM o trasferirla direttamente per lo screening crio-EM o la raccolta dei dati.
NOTA: Per ottimizzare rapidamente il protocollo, colorare negativamente la griglia bucciata in questa fase piuttosto che immergerla nell'azoto liquido. Colorare negativamente il campione applicando 3 μL di acetato di uranile all'1% alla griglia, incubare la griglia per 30 s e asciugarla con un pezzo strappato di carta da filtro da 20-25 μm pore. Le griglie di cristalli 2D vetrificati in trealosio, tannino o glucosio vengono regolarmente immerse a mano per la vetrificazione poiché trealosio, tannino e glucosio impediscono la formazione di ghiaccio cristallino alle velocità utilizzate per l'immersione manuale2.
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Representative Results
Un esperimento di successo peel-blot si tradurrà in singoli strati di campioni a concentrazioni spesso elevate. È prevedibile che alcune regioni nella maggior parte dei quadrati della griglia conterranno ancora più livelli, specialmente a un numero inferiore di iterazioni delle fasi peel-blot. La maggior parte dei quadrati della griglia, tuttavia, conterrà estese regioni di singoli strati come osservato per i cristalli 2D di leucotriene C4 sintasi umana (Figura 2) e liposomi (aggiunti nel passaggio 3.2, Figura 3). Potrebbe essere necessario testare ulteriori fasi peel-blot per i campioni che non mostrano la riduzione desiderata degli strati.
L'indicazione più importante del successo di un esperimento peel-blot sarà la qualità dei dati e l'integrità biologica osservate dopo la raccolta di dati crio-EM ad alta risoluzione e l'elaborazione delle immagini. L'interpretazione dei dati dovrà includere un'attenta considerazione dei potenziali danni o distorsioni nelle regioni di contatto tra i livelli.
Le regioni della griglia EM in cui si è verificato peel blotting mostrano tipicamente una maggiore concentrazione di campione rispetto alle regioni in cui non si è verificato. Questo apparente effetto di concentrazione è causato dall'aderenza del campione multilamellare sia al film di carbonio che alle superfici della barra griglia, seguito da un'ulteriore aderenza a entrambe le superfici durante la preparazione peel-blot mentre si separano ripetutamente, si riposizionano leggermente e di nuovo entrano in contatto. Il risultato è che i diversi strati del campione multilamellare originale sono distribuiti su un'area laterale più ampia (Figura 3 e Figura 4). Queste regioni possono anche contenere cristalli o membrane 2D più grandi. Entrambi i fenomeni sono facilmente osservabili e confrontabili in aree in cui una "zona di peeling" è adiacente a un'area non interessata dalla fase peel-blot (Figura 3). Le immagini nelle figure 2-4 sono state raccolte in condizioni di basse dosi ad una tensione accelerata di 120 kV con un microscopio elettronico a trasmissione (vedi Tabella dei materiali).
Figura 1: Rappresentazione schematica della tecnica peel-blot. Le prime due fasi (1-2 e 1-3) e l'ultima fase (1-6) della tecnica peel-blot si basano sul metodo di back-injection 2 e le fasi intermedie seguono il protocollo peel-blot (modificato da Johnson et al.1). Nella fase 1, (A) due pezzi di carta da filtro da 20-25 μm sono impilati, (B) adiacenti a un pezzo di pellicola di paraffina con due gocce di soluzione di trealosio e (C) un pezzo di carta da filtro submicronica su due ulteriori pezzi di carta da filtro. Nella fase 2, (A) il film di carbonio viene fatto galleggiare sulla prima goccia di trealosio e (B) raccolto con una pinza anti-capillare, dopo di che viene toccato sulla superficie della seconda goccia (non mostrata) senza rompere la tensione superficiale per rimuovere il film di carbonio in eccesso dalla periferia. Nella fase 3, (A) le pinze che tengono la griglia sono ruotate di 180° (il lato della pellicola di carbonio della griglia è ora rivolto verso il basso) e (B) il campione viene pipettato nel menisco del trealosio. Nella fase 4, la griglia è stata ruotata di nuovo all'orientamento originale con il film di carbonio rivolto verso l'alto e il campione viene lentamente abbassato sulla carta da filtro submicron. La griglia viene sollevata e al punto 5 abbassata verticalmente su una goccia da 1,7 μL di soluzione di trealosio. I passaggi 4 e 5 sono indicati come "peel-blotting" e possono essere iterati tre o più volte, a seconda della quantità di impilamento. Potrebbe essere necessario ottimizzare il numero di iterazioni per campioni diversi. Nella fase 6, (A) il campione viene tamponato su due strati di carta da filtro da 20-25 μm di dimensioni dei pori, prima che (B) venga immerso a mano in azoto liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Un campione di cristallo 2Dsottoposto al metodo peel-blot. La regione a sinistra della freccia è stata in gran parte ridotta a cristalli 2D a strato singolo in una regione di contatto tra il film di carbonio e la barra della griglia che è stata sbucciata e poi spostata, mentre la regione a destra della freccia non era in una regione interessata dalla macchia di buccia. Le regioni bucciate possono essere facilmente selezionate e sono osservate sulla maggior parte della griglia. I cristalli 2D mostrati sono cristalli 2D impilati e monostrato di leucotriene C4 sintasi umana. La barra della scala corrisponde a 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Liposomi sottoposti al peel-blot. Il peel-blot può essere applicato con successo per interrompere i bordi dei liposomi e delle vescicole collassati per ottenere regioni con grandi strati fosfolipidi per lo più monostrati, come osservato nella metà inferiore dell'immagine. La metà superiore non era in una zona di contatto tra la barra della griglia e il film di carbonio e quindi contiene liposomi completi con due doppi strati fosfolipidici. La barra della scala corrisponde a 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'impronta peel-blot. Il quadrato della griglia di una griglia a 400 maglie mostra l'impronta (etichettata "B") della barra della griglia e le regioni risultanti con la pelatura, nonché le regioni (etichettate con "C") che non sono state in contatto con una barra della griglia o sono state sottoposte a un minor numero di iterazioni peel-blot. La barra della scala corrisponde a 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Blotting di una griglia EM preparata mediante back-injection su una carta da filtro submicronica, utilizzando film di carbonio troppo sottile. Le immagini sono singoli fotogrammi di un video (vedi Video 1) scattato a (A) contatto iniziale con la membrana, (B) 1000 ms dopo il contatto e (C) 2000 ms dopo il contatto. La freccia indica i quadrati della griglia in cui la pressione capillare ha rotto il film di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: La griglia viene posizionata sulla carta da filtro submicron per la fase peel-blot. Il film di carbonio viene aspirato lentamente e strettamente sulla griglia nella direzione dal basso a sinistra verso l'alto a destra, che inserisce strettamente il campione tra la barra della griglia e il film di carbonio. Il film di carbonio e quindi i singoli strati di campione vengono spostati in ogni successiva fase peel-blot, consentendo l'ottimizzazione con iterazioni aggiuntive per campioni più altamente stratificati. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il peel-blot è un metodo potente per superare l'impilamento e lo spessore di cristalli 2D multistrato e campioni simili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione delle immagini. Una decisione sull'uso del peel-blot sarà basata sui parametri biologici del campione e richiederà anche una valutazione una volta che sarà disponibile un modello crio-EM 3D. L'importanza biologica dei contatti e la potenziale flessibilità delle regioni di contatto saranno particolarmente importanti in questa valutazione.
Il numero di peel-blot sarà inizialmente stabilito tramite osservazione dopo la preparazione standard della griglia a macchie negative, dove strati o spessori eccessivi richiederanno strategie alternative alla preparazione standard della griglia crio-EM. I cristalli sottili multistrato impilati a registro possono essere utilizzati direttamente per microED3 o fresati FIB nel caso di cristalli più spessi4. La macchia di peel-blot di solito non è necessaria per i cristalli 2D a doppio strato poiché gli strati possono essere elaborati singolarmente o insieme, quando gli strati sono nel registro5. Potrebbe potenzialmente essere utile per esporre entrambi i lati dei cristalli 2D della proteina di membrana a ligandi o inibitori, una volta in soluzione prima del peel-blotting e una volta dopo la fase finale di peel-blotting. Inoltre, la riduzione di cristalli 2D a doppio strato grandi e ben ordinati può consentire la diffrazione elettronica 6,7. Multi-strati, indotti o presenti biologicamente, di cristalli 2D di membrana e proteine solubili saranno gli obiettivi più probabili per il peel-blot, anche se il protocollo può essere applicato a una gamma di campioni e servire a concentrare vari campioni per la crio-EM (Figura 4).
I test iniziali con colorazione negativa ridurranno drasticamente i tempi e i costi per ottimizzare i campioni poiché non sono richiesti congelamento, preparazione di supporti per campioni crio-EM, trasferimento a un crio-EM e uso di un crio-EM. Solo il tempo di asciugatura prima della fase di congelamento dovrà essere ottimizzato separatamente. Il tempo di essiccazione sarà identico o molto simile al tempo utilizzato per asciugare una griglia di back-injection standard dello stesso campione1.
Mentre le griglie a 600 maglie generalmente garantiscono una buona conservazione del film di carbonio, un numero maggiore di iterazioni peel-blot e strati di film di carbonio più sottili può portare a un aumento della rottura del film di carbonio (Figura 5). Cristalli 2D impilati, liposomi e campioni stratificati di grandi matrici di proteine solubili possono essere separati con successo (Figure 2-4).
Il campione viene attentamente valutato dalla crio-EM per garantire che vengano evitati effetti avversi sulla qualità del campione. Ciò può essere ottenuto mediante l'elaborazione delle immagini per confrontare le immagini di cristalli impilati e non impilati. Sia ai fini della valutazione che per raggiungere l'obiettivo di un modello 3D, l'elaborazione delle immagini viene condotta tramite i programmi 2dx disponibili in Focus8,9, che implementa anche approcci a singola particella per affrontare le imperfezioni del reticolo e l'eterogeneità delle proteine con la possibilità di aumentare drasticamente la qualità intrinseca dei cristalli 2D originali10.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Parte di questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
