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Bioengineering

महाधमनी दीवार में बायोमेकेनिकल स्ट्रेन को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल का निर्माण

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64122
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Institutes of Biomedical Sciences and the Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, Shanghai Medical College, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हमने मानव महाधमनी दीवार में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के विवो बायोमेकेनिकल तनाव को दोहराने के लिए एक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल विकसित किया।

Abstract

मानव वक्ष महाधमनी धमनीविस्फार और विच्छेदन (टीएएडी) के अध्ययन में पारंपरिक दो-आयामी सेल संस्कृति तकनीकों और पशु मॉडल का उपयोग किया गया है। हालांकि, मानव टीएएडी को कभी-कभी पशु मॉडल द्वारा विशेषता नहीं दी जा सकती है। नैदानिक मानव अध्ययन और पशु प्रयोगों के बीच एक स्पष्ट प्रजाति अंतर है जो चिकित्सीय दवाओं की खोज में बाधा डाल सकता है। इसके विपरीत, पारंपरिक सेल संस्कृति मॉडल विवो बायोमेकेनिकल उत्तेजनाओं में अनुकरण करने में असमर्थ है। इसके लिए, माइक्रोफैब्रिकेशन और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीकों ने हाल के वर्षों में बहुत विकसित किया है, जो बायोमेकेनिकल माइक्रोएन्वायरमेंट को दोहराने वाले ऑर्गेनोइड्स-ऑन-ए-चिप मॉडल स्थापित करने के लिए नई तकनीक प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में, एक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अंग-ऑन-ए-चिप (एचएएसएमसी-ओओसी) मॉडल को महाधमनी बायोमैकेनिक्स के पैथोफिजियोलॉजिकल मापदंडों को अनुकरण करने के लिए विकसित किया गया था, जिसमें मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एचएएसएमसी) द्वारा अनुभव किए गए चक्रीय तनाव के आयाम और आवृत्ति शामिल हैं जो टीएएडी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस मॉडल में, एचएएसएमसी की आकृति विज्ञान आकार में लम्बी हो गई, तनाव दिशा के लंबवत संरेखित हुई, और स्थिर पारंपरिक परिस्थितियों की तुलना में तनाव स्थितियों के तहत अधिक सिकुड़ा हुआ फेनोटाइप प्रस्तुत किया। यह देशी मानव महाधमनी दीवारों में सेल अभिविन्यास और फेनोटाइप के अनुरूप था। इसके अतिरिक्त, बाइसपिड महाधमनी वाल्व से संबंधित टीएएडी (बीएवी-टीएएडी) और ट्राइकसपिड महाधमनी वाल्व से संबंधित टीएएडी (टीएवी-टीएएडी) रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी का उपयोग करते हुए, हमने बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोग मॉडल स्थापित किए, जो टीएएडी में एचएएसएमसी विशेषताओं को दोहराते हैं। एचएएसएमसी-ओओसी मॉडल एक नया इन विट्रो प्लेटफॉर्म प्रदान करता है जो टीएएडी के रोगजनन की खोज और चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज के लिए पशु मॉडल का पूरक है।

Introduction

वक्ष महाधमनी धमनीविस्फार और विच्छेदन (टीएएडी) महाधमनी दीवार का एक स्थानीय फैलाव या डिलेमिनेशन है जो उच्च रुग्णताऔर मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है। मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एचएएसएमसी) टीएएडी के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एचएएसएमसी टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाएं नहीं हैं, और एचएएसएमसी उच्च प्लास्टिसिटी बनाए रखते हैं, जिससे उन्हें विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में फेनोटाइप ्स को स्विच करने की अनुमति मिलतीहै। एचएएसएमसी मुख्य रूप से विवो में लयबद्ध तन्यता तनाव के अधीन हैं, और यह चिकनी मांसपेशी रूपात्मक परिवर्तन, भेदभाव और शारीरिक कार्यों को विनियमित करने वाले प्रमुख कारकों में से एक है। इसलिए, एचएएसएमसी के अध्ययन में चक्रीय तनाव की भूमिका को नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है। हालांकि, पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृतियां विवो में एचएएसएमसी द्वारा अनुभव किए गए चक्रीय तनाव के बायोमेकेनिकल उत्तेजना को दोहरा नहीं सकती हैं। इसके अतिरिक्त, एक पशु टीएएडी मॉडल का निर्माण कुछ प्रकार के टीएएडी के लिए उपयुक्त नहीं है, जैसे कि बाइसपिड महाधमनी वाल्व (बीएवी) से संबंधित टीएएडी। इसके अलावा, नैदानिक मानव अध्ययन और पशु प्रयोगों के बीच प्रजातियों के अंतर को नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है। यह नैदानिक अभ्यास में दवा अनुवाद में बाधा डालता है। इस प्रकार, महाधमनी रोगों के अनुसंधान में विवो बायोमेकेनिकल वातावरण में अनुकरण करने के लिए अधिक जटिल और शारीरिक प्रणालियों की तत्काल आवश्यकता है।

बायोमेडिकल अनुसंधान और दवा विकास में उपयोग किए जाने वाले पशु प्रयोग महंगे, समय लेने वाले और नैतिक रूप से संदिग्ध हैं। इसके अलावा, जानवरों के अध्ययन के परिणाम अक्सर मानव नैदानिकपरीक्षणों 5,6 में प्राप्त परिणामों की भविष्यवाणी करने में विफल रहते हैं। मानव प्रीक्लिनिकल मॉडल की कमी और नैदानिक परीक्षणों में उच्च विफलता दर के परिणामस्वरूप क्लिनिक के लिए कुछ प्रभावी दवाएं हैं, जिससे स्वास्थ्यदेखभाल लागत में वृद्धि हुई है। इस प्रकार, पशु मॉडल के पूरक के लिए अन्य प्रयोगात्मक मॉडल ढूंढना जरूरी है। माइक्रोफैब्रिकेशन और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीकें हाल के वर्षों में बहुत विकसित हुई हैं, जो ऑर्गेनोइड्स-ऑन-ए-चिप मॉडल स्थापित करने के लिए नई तकनीकें प्रदान करती हैं जो पारंपरिक 2 डी सेल कल्चर तकनीकों की कमियों को दूर करती हैं और शारीरिक अध्ययन और दवा विकास के लिए अधिक यथार्थवादी, कम लागत और कुशल इन विट्रो मॉडल स्थापित करती हैं। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके, ऊतक या अंग के प्रमुख कार्यों को दोहराने के लिए विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ माइक्रोमीटर के आकार के कक्षों में जीवित कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए ऑर्गन-ऑन-चिप्स स्थापित किए जाते हैं। प्रणाली में एकल या एकाधिक माइक्रोफ्लुइडिक माइक्रोचैनल होते हैं, जिसमें या तो एक प्रकार की कोशिका को एक संक्रमित कक्ष में सुसंस्कृत किया जाता है, जो एक ऊतक प्रकार के प्रतिकृति कार्यों को दोहराता है या विभिन्न ऊतकों के बीच इंटरफेस को फिर से बनाने के लिए छिद्रपूर्ण झिल्ली पर सुसंस्कृत विभिन्न सेल प्रकार होता है। रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ संयुक्त माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित ऑर्गेनोइड्स में माउस और मानव रोग मॉडल के बीच बड़ी प्रजातियों के अंतर को पाटने और रोग तंत्र अनुसंधान और दवा की खोज के लिए पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति के नुकसान पर काबू पाने का अनूठा लाभ है। पिछले कुछ वर्षों में माइक्रोफ्लुइडिक्स के तेजी से विकास के साथ, शोधकर्ताओं ने विवो जैविक मापदंडों 8 में जटिल प्रतिकृति बनाने वाले इन विट्रो ऑर्गन-ऑन-ए-चिप (ओओसी) मॉडल की उपयोगिता का एहसास कियाहै। ये माइक्रोफ्लुइडिक ऑर्गेनोइड्स इन विट्रो बायोमैकेनिकल वातावरण का अनुकरण करते हैं, जैसे कि चक्रीय तनाव, कतरनी तनाव और तरल दबाव, जो तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति वातावरण प्रदान करते हैं। आज तक, फेफड़े9, गुर्दे 10, यकृत 11, आंत12 और हृदय13 जैसे अंगों में बायोमेकेनिकल उत्तेजनाओं को अनुकरण करने के लिए कई ओओसी मॉडल स्थापित किए गए हैं, लेकिन इन्हें मानव महाधमनी रोग के अध्ययन के लिए व्यापक रूप से लागू नहीं किया गया है।

इस अध्ययन में, हम एक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अंग-ऑन-ए-चिप (एचएएसएमसी-ओओसी) मॉडल प्रस्तुत करते हैं जो टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी पर लागू बायोमिमेटिक यांत्रिक बलों और लय को नियंत्रित कर सकता है। चिप में पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) की तीन-स्तरीय मोटी प्लेटें होती हैं, जिन्हें चैनलों के साथ उकेरा जाता है और दो व्यावसायिक अत्यधिक लचीली पीडीएमएस झिल्ली होती हैं। एचएएसएमसी को पीडीएमएस झिल्ली पर सुसंस्कृत किया जाता है। चिप के बीच में चैनल सेल संस्कृति के लिए एक संस्कृति माध्यम से भरा हुआ है। चिप के शीर्ष और निचले चैनल एक वैक्यूम दबाव आपूर्ति प्रणाली से जुड़े होते हैं जो पीडीएमएस झिल्ली के यांत्रिक तन्यता तनाव की लय और आवृत्ति को नियंत्रित कर सकते हैं। एचएएसएमसी द्वारा अनुभव किए गए लयबद्ध तनाव को एचएएसएमसी-ओओसी में अनुकरण किया जा सकता है, जो ऊतक या अंग के बायोमेकेनिकल माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करता है जो पारंपरिक 2 डी संस्कृति प्रणालियों के साथ कार्यात्मक रूप से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन, रीयल-टाइम इमेजिंग और बायोमेकेनिकल माइक्रोएन्वायरमेंट के लाभ के साथ, जीवित कोशिकाओं की जैव रासायनिक, आनुवंशिक और चयापचय गतिविधियों का अध्ययन ऊतक विकास, अंग शरीर विज्ञान, रोग एटियलजि, आणविक तंत्र और बायोमार्कर पहचान, हृदय रोग और महाधमनी रोग के लिए किया जा सकता है। ऊतक-विशिष्ट और रोगी कोशिकाओं के साथ संयुक्त, इस प्रणाली का उपयोग दवा स्क्रीनिंग, व्यक्तिगत चिकित्सा और विषाक्तता परीक्षण के लिए किया जा सकता है। यह एचएएसएमसी-ओओसी मॉडल महाधमनी रोग के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक नया इन विट्रो प्लेटफॉर्म प्रदान करता है।

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Protocol

झोंगशान अस्पताल, फुदान विश्वविद्यालय आचार समिति (एनओ) के अनुमोदन के तहत प्राथमिक एचएएसएमसी अलगाव के लिए मानव महाधमनी नमूनों का उपयोग किया गया था। बी 2020-158)। फुदान विश्वविद्यालय के झोंगशान अस्पताल में आरोही महाधमनी सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से महाधमनी के नमूने एकत्र किए गए थे। भागीदारी से पहले सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. प्राथमिक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अलगाव

  1. आरोही महाधमनी के दाहिने पार्श्व क्षेत्र को बाँझ पीबीएस, 1x-2x के साथ धोएं।
  2. दो नेत्र बलों के साथ ऊतक की इंटिमा और एडवेंटिटिया परतों को हटा दें और कोशिकाओं को काटने के लिए मीडिया परत को बनाए रखें।
  3. मीडिया परत को 10 सेमी कल्चर डिश पर रखें और कैंची के साथ इसे छोटे टुकड़ों (2-3 मिमी) में काट लें। 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त चिकनी मांसपेशी कोशिका संस्कृति माध्यम (एसएमसीएम) के 5 एमएल जोड़ें।
  4. छोटे ऊतक को बाँझ ड्रॉपर के साथ संस्कृति बोतल में ले जाएं, ऊतक को समान रूप से फैलाएं। संस्कृति माध्यम को जितना संभव हो उतना त्याग दें, फिर बोतल को उल्टा करें।
  5. उल्टे कल्चर बोतल में 2 एमएल एसएमसीएम जोड़ें और इसे इनक्यूबेटर (5% सीओ 2) में1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, फिर धीरे-धीरे इसे दाईं ओर घुमाएं और एसएमसीएम का एक और 2 एमएल जोड़ें।
  6. इनक्यूबेशन के 5-7 दिनों के बाद, एसएमसीएम को 4 एमएल ताजा एसएमसीएम के साथ बदलें। आम तौर पर, छिटपुट चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं लगभग 2 सप्ताह में बाहर निकल जाती हैं।
  7. धीरे-धीरे एसएमसीएम को छोड़ दें और माध्यम बदलते समय इसे धीरे-धीरे जोड़ें। माइक्रोस्कोप स्टेशन पर जाते समय संस्कृति की बोतल को धीरे-धीरे परिवहन करें; अन्यथा, ऊतक तैरेंगे, और कोशिकाएं धीरे-धीरे बढ़ेंगी।
  8. जब कोशिकाएं लगभग 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो 2 एमएल पीबीएस के साथ धो लें, 0.25% ट्रिप्सिन के 2 एमएल के साथ पचाएं, और उन्हें 4 एमएल ताजा एसएमसीएम के साथ दो नई कल्चर बोतलों में विभाजित करें।
  9. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (सीएनएन 1, एसएम 22)14 के लिए चार अलग-अलग विशिष्ट मार्करों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के माध्यम से कोशिकाओं की पहचान करें।

2. पीडीएमएस चिप की तैयारी

  1. पीडीएमएस को पॉलीमराइज़ करने के लिए, ए: बी = 10: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू के वजन अनुपात पर बेस (ए घटक) में इलाज एजेंट (बी घटक) जोड़ें और 5 मिनट के लिए कॉम्प्लेक्स को पूरी तरह से मिलाएं; मात्रा अध्ययन की आवश्यकता पर निर्भर करती है।
  2. तैयार पीडीएमएस जेल को वैक्यूम निष्कर्षण टैंक में 30-60 मिनट के लिए रखें और -0.8 एमपीए से नीचे दबाव बनाए रखें।
    नोट: उच्च दबाव से पीडीएमएस जेल के अंदर छोटे बुलबुले का अपर्याप्त निष्कर्षण होगा जो चिप निर्माण के अगले चरण को प्रभावित करेगा।
  3. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, 100 मिमी × 40 मिमी × 8 मिमी बाहरी फ्रेम संरचना और 6 मिमी × 4 मिमी चैनल के × 70 मिमी के साथ मोल्ड डिजाइन करें।
  4. कस्टम एक उच्च परिशुद्धता कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण उत्कीर्णन मशीन का उपयोग करके तीन परतों के मोल्ड बनाते हैं। पॉलीमिथाइल मेथैक्रिलेट (पीएमएमए) प्लेटों का उपयोग करके मोल्डों और माइक्रोचैनलों के फ्रेम को तराशना, और फिर उन्हें दूसरी पीएमएमए प्लेट पर गोंद करें।
  5. तैयार पीडीएमएस जेल को 100 मिमी × 40 मिमी × 6 मिमी बाहरी फ्रेम और 70 मिमी × 6 मिमी × 4 मिमी चैनल के साथ एक मोल्ड पर डालें, और फिर 1-2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर क्रॉस-लिंक करें।
  6. मोल्ड से क्रॉस-लिंक्ड पीडीएमएस स्लैब को छील लें और वाणिज्यिक पीडीएमएस झिल्ली को 100 मिमी × 40 मिमी वर्गों में काट लें।
  7. पीडीएमएस सतह सक्रियण के लिए 5 मिनट के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ तीन तैयार पीडीएमएस स्लैब और दो पीडीएमएस झिल्ली का इलाज करें। निम्नलिखित विशिष्ट सेटिंग्स लागू करें: प्रक्रिया गैस के रूप में कमरे की हवा; -100 kPa पर दबाव सेट; वर्तमान सेट 180--200 एमए है; वोल्टेज 200 वी पर सेट; प्रक्रिया का समय 5 मिनट है।
  8. पीडीएमएस चिप पर हवा और मध्यम माइक्रोचैनल के इनलेट और आउटलेट बनाने के लिए 1 मिमी छेद पंचर का उपयोग करके तीन पीडीएमएस स्लैब पर छिद्र करें।
  9. तीन पीडीएमएस स्लैब और दो पीडीएमएस झिल्ली को क्रम में एक साथ बांधें: एयर चैनल पीडीएमएस स्लैब (शीर्ष परत) - पीडीएमएस झिल्ली - मध्यम चैनल पीडीएमएस स्लैब (मध्य परत) - पीडीएमएस झिल्ली- वायु चैनल पीडीएमएस स्लैब (नीचे की परत)। मध्यम माइक्रोचैनलों के साथ वायु माइक्रोचैनलों को पूरी तरह से ओवरलैप करने के लिए 4x पर स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत इस चरण को करें।
  10. इकट्ठे पीडीएमएस चिप को 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  11. कई 1 मिमी आंतरिक व्यास और 3 सेमी लंबाई लेटेक्स नली तैयार करें। तैयार नली के एक छोर में 1 मिमी बाहरी व्यास और 1 सेमी लंबी स्टेनलेस-स्टील सुई डालें, और फिर पीडीएमएस चिप के हवा और मध्यम माइक्रोचैनल से जुड़ी ट्यूब बनाने के लिए नली के दूसरे छोर में एक लुएर डालें।
  12. तैयार ट्यूबों को पीडीएमएस चिप पर हवा और मध्यम माइक्रोचैनल के आउटलेट और इनलेट्स में डालें।

3. पीडीएमएस चिप सतह उपचार और नसबंदी

  1. 2 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पीडीएमएस चिप के मध्यम माइक्रोचैनल में 80 मिलीग्राम / एमएल माउस कोलेजन के 2 एमएल को इंजेक्ट करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. इनक्यूबेशन के बाद, चैनल से कोलेजन को हटा दें और 2 एमएल सिरिंज के साथ याद करें। कोलेजन-लेपित पीडीएमएस चिप्स को रात भर 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  3. पीडीएमएस चिप्स को यूवी स्टरलाइज़र में 1 घंटे से अधिक समय तक रखें। सेल प्रयोग की तैयारी में एक अल्ट्राक्लीन बेंच पर निष्फल पीडीएमएस चिप्स रखें।

4. पीडीएमएस चिप और सेल स्ट्रेचिंग प्रक्रिया पर सेल सीडिंग

  1. चिकनी मांसपेशी कोशिका माध्यम (एसएमसीएम) का उपयोग करने वाले रोगियों से 37 डिग्री सेल्सियस पर5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त रोगियों से कल्चर 4 x 10 5 प्राथमिक मानव चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एचएएसएमसी)।
  2. जब एचएएसएमसी घनत्व 80% तक पहुंच जाता है, तो एसएमसीएम को छोड़ दें और कोशिकाओं को 2 एमएल पीबीएस से धो लें।
  3. कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के 1 एमएल और 5 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके पचाएं। सुपरनैटेंट को हटा दें और सेल पेलेट को 1 एमएल ताजा एसएमसीएम में फिर से निलंबित करें। 10 सेमी कल्चर डिश पर कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए 8 एमएल एसएमसीएम का उपयोग करें।
  4. साइटोमीटर का उपयोग करके सेल संख्या की गणना करें और 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर कोशिकाओं का उपयोग करें।
  5. धीरे-धीरे कोलेजन-लेपित और निष्फल पीडीएमएस चिप मध्यम माइक्रोचैनल में 2 एमएल पीबीएस डालें और बाद में 2 एमएल सिरिंज का उपयोग करके छोड़ दें।
  6. धीरे-धीरे 2 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पीडीएमएस चिप के मध्यम माइक्रोचैनल में 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल एचएएसएमसी निलंबन के कुल 2 एमएल डालें। फिर, पीडीएमएस चिप के प्रवेश और निकास पर लुएर को बंद करें। पीडीएमएस चिप को 1 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2) में रखें।
  7. पीडीएमएस चिप में पीडीएमएस झिल्ली से कोशिकाओं के जुड़े होने के बाद, लगभग 24 घंटे के बाद, पीडीएमएस चिप पर एयर माइक्रोचैनल के आउटलेट को वैक्यूम कंट्रोलर सिस्टम से कनेक्ट करें। जब कोशिका जुड़ी होती है, तो माइक्रोस्कोप के नीचे एक लम्बी, सामान्य सेलुलर रूप देखा जा सकता है, जो निलंबित गोल कोशिकाओं के विपरीत होता है।
  8. सोलनॉइड वाल्व और वैक्यूम पंप चालू करें। वैक्यूम नियामक खोलें और 0.91% तनाव के लिए 7.18 ± 0.44% तनाव के लिए दबाव स्तर को 10 केपीए और 17.28 ± लिए 15 केपीए तक समायोजित करें।
  9. नियंत्रण प्रणाली के मापदंडों को सेट करने के बाद, पीडीएमएस चिप्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर (5% सीओ2) में रखें और 24 घंटे तक फैलाएं।

5. यांत्रिक नियंत्रण प्रणाली की तैयारी

  1. कई सोलनॉइड वाल्व, वैक्यूम फिल्टर, वैक्यूम नियामक, एक वैक्यूम पंप, एक पेरिस्टाल्टिक पंप, और सोलनॉइड वाल्व को नियंत्रित करने वाला एक प्रोग्रामेबल लॉजिक कंट्रोलर (पीएलसी) तैयार करें।
  2. पीएलसी नियंत्रक को प्रोग्राम करें और ऑन / ऑफ समय अंतराल को 1 हर्ट्ज पर सेट करें। सोलनॉइड वाल्व को प्रोग्राम किए गए नियंत्रक से कनेक्ट करें।
  3. वैक्यूम पंप के इनलेट को वैक्यूम फिल्टर से कनेक्ट करें, और फिर वैक्यूम फिल्टर के आउटलेट को वैक्यूम नियामकों से कनेक्ट करें। वैक्यूम नियामकों के आउटलेट को सोलनॉइड वाल्व से कनेक्ट करें, और अंत में, सोलनॉइड वाल्व के आउटलेट को पीडीएमएस चिप्स के एयर माइक्रोचैनल के आउटलेट से कनेक्ट करें।
  4. पेरीस्टाल्टिक पंप के आउटलेट को पीडीएमएस चिप के मध्यम माइक्रोचैनल के इनलेट से कनेक्ट करें और पेरीस्टाल्टिक पंप के इनलेट को कल्चर मीडियम रिप्लेसमेंट और ड्रग हैंडलिंग के लिए मध्यम माइक्रोचैनल पीडीएमएस चिप के आउटलेट से कनेक्ट करें।
  5. नियामक द्वारा तनाव के आयाम और माइक्रोकंट्रोलर द्वारा तनाव आवृत्ति को समायोजित करें।

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Representative Results

एचएएसएमसी-ओओसी मॉडल में एक वैक्यूम कंट्रोल सिस्टम, एक परिसंचारी प्रणाली और पीडीएमएस चिप्स, और एचएएसएमसी-ओओसी मॉडल (चित्रा 1) का योजनाबद्ध डिजाइन शामिल है। वैक्यूम नियंत्रण प्रणाली में एक वैक्यूम पंप, सोलनॉइड वाल्व और एक पीएलसी नियंत्रक होता है। परिसंचारी प्रणाली के रूप में कार्य करने के लिए, सेल कल्चर माध्यम को ताज़ा करने और दवाओं को जोड़ने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग किया गया था। पीडीएमएस चिप सेल विकास के लिए दो वैक्यूम कक्षों और एसएमसीएम से भरे एक मध्य कक्ष से बना था। चिप संरचना के डिजाइन के अनुसार, पीएमएमए मोल्ड तैयार किया गया था, और तीन पीडीएमएस स्लैब को 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड और क्रॉस-लिंकिंग में डालकर तैयार किया गया था। प्लाज्मा के साथ उपचार के बाद, तीन पीडीएमएस स्लैब और दो पीडीएमएस झिल्ली को एक साथ बांध दिया गया (चित्रा 2)। जब पीडीएमएस चिप्स तैयार किए गए थे, तो एचएएसएमसी को चिप में पीडीएमएस झिल्ली पर सुसंस्कृत किया गया था, और पीडीएमएस चिप्स वैक्यूम कंट्रोल सिस्टम और परिसंचारी प्रणाली से जुड़े थे। संपूर्ण प्रणाली का एक योजनाबद्ध पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है। पीडीएमएस चिप पैरामीटर चित्रा 3 ए में दिखाए गए हैं, और पीडीएमएस झिल्ली के यांत्रिक गुणों को चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। पीडीएमएस झिल्ली के तन्यता उपभेदों को निर्धारित करने के लिए, हमने 0 केपीए, 10 केपीए, 15 केपीए, 20 केपीए, 25 केपीए और 30 केपीए के वैक्यूम दबाव के साथ माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल के क्रॉस-सेक्शनल दृश्य से पीडीएमएस झिल्ली के वास्तविक समय के विरूपण को कैप्चर किया। हमने 2 मिमी, 4 मिमी और 6 मिमी (चित्रा 3 सी-ई) की विभिन्न संवर्धन चैनल चौड़ाई में पीडीएमएस झिल्ली के तनाव परिमाण का मूल्यांकन करने के लिए लंबाई में परिवर्तन को भी मापा। पीडीएमएस चिप में 6 मिमी चौड़ाई वाले माइक्रोचैनल का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला है कि 10 केपीए के वैक्यूम दबाव ने 7.18 ± 0.44% तनाव और 15 केपीए ने 17.28 ± 0.91% तनाव को प्रेरित किया (चित्रा 3 ई)।

पीडीएमएस चिप में एचएएसएमसी सेल लाइन (सीआरएल 1999) की सेल व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं को सुसंस्कृत करने के बाद 3 और 5 दिनों पर एक लाइव / डेड परख किया गया था। परिणामों से पता चला कि दिन 3 और दिन 5 (चित्रा 4 ए) में सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक थी। पीडीएमएस चिप में सीआरएल 1999 के साइटोस्केलेटन (एफ-एक्टिन) धुंधला होने से सामान्य कोशिका आकृति विज्ञान और कोशिकाओं को 24 घंटे तक खींचने के बाद तनाव के लंबवत संरेखित किया गया (चित्रा 4 बी-सी)। सिकुड़ा हुआ मार्कर एसएम 22 और सीएनएन 1 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 24 घंटे के लयबद्ध तनाव (चित्रा 4 डी-ई) के बाद एचएएसएमसी-ओओसी का उपयोग करके किया गया था। शुरू करने के लिए, पीबीएस के 2 एमएल को धीरे-धीरे चैनल में डाला गया और 2 एमएल सिरिंज के साथ फेंक दिया गया। इसके बाद, 4% (v/ v) पैराफॉर्मलडिहाइड के 2 एमएल को चैनल में डाला गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद, 0.2% (v/v) ट्राइटन X-100 के 2 एमएल को 2 एमएल सिरिंज द्वारा चैनल में डाला गया और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद पीबीएस के 2 एमएल को धीरे-धीरे चैनल में डाला गया और कोशिकाओं को धोने के बाद 2 एमएल सिरिंज द्वारा फेंक दिया गया। इसके बाद, 5% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 2 एमएल को धीरे-धीरे चैनल में डाला गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। बाद में, एसएम 22 या सीएनएन 1 एंटीबॉडी के 1 एमएल को धीरे-धीरे चैनल में डाला गया और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 एमएल को धीरे-धीरे चैनल में डाला गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। अंत में, 1 एमएल DAPI समाधान को धीरे-धीरे चैनल में डाला गया और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। परिणामों से पता चला है कि तनाव की स्थिति में एसएम 22 और सीएनएन 1 की प्रतिदीप्ति तीव्रता स्थिर परिस्थितियों (चित्रा 4 एफ) की तुलना में अधिक थी। स्थैतिक स्थितियों की तुलना में, एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 जीन तनाव की स्थिति में अनियंत्रित थे (चित्रा 4 जी)। इन आंकड़ों ने सुझाव दिया कि सीआरएल 1999 तनाव की दिशा के लंबवत संरेखित था और स्थिर परिस्थितियों में पारंपरिक सेल संवर्धन की तुलना में तनाव की स्थिति में एक सिकुड़ा हुआ फेनोटाइप अधिक स्पष्ट था।

बाइसपिड महाधमनी वाल्व से संबंधित टीएएडी (बीएवी-टीएएडी) और ट्राइकसपिड महाधमनी वाल्व से संबंधित टीएएडी (टीएवी-टीएएडी) रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी का उपयोग करते हुए, हमने बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोग मॉडल स्थापित किए। बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी के एफ-एक्टिन धुंधला होने के परिणामों ने सामान्य कोशिका आकृति विज्ञान और कोशिकाओं को 24 घंटे तक खींचने के बाद तनाव दिशा के लंबवत संरेखित किया (चित्रा 5 ए-बी)। इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग से पता चला है कि बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 अभिव्यक्ति स्थिर परिस्थितियों की तुलना में तनाव की स्थिति में अधिक थी (चित्रा 5 सी-जी, आई)। बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 के जीन अभिव्यक्ति स्तर स्थिर स्थितियों के विपरीत तनाव की स्थिति में अनियंत्रित थे (चित्रा 5 एच, जे)। पीडीएमएस चिप में बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में ये परिणाम एचएएसएमसी सेल लाइन सीआरएल 1999 के परिणामों के अनुरूप थे, यह दर्शाता है कि रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी और एचएएसएमसी-ओओसी मॉडल का संयोजन टीएएएडी में एचएएसएमसी विशेषताओं को दोहराता है, जो रोग के आणविक तंत्र और दवा स्क्रीनिंग की आगे की जांच के लिए बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी इन विट्रो रोग मॉडल प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एचएएसएमसी-ओओसी प्रणाली का योजनाबद्ध डिजाइन। सिस्टम में एक वैक्यूम कंट्रोल सिस्टम, एक परिसंचारी प्रणाली और पीडीएमएस चिप्स होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीडीएमएस चिप तैयारी प्रक्रिया। पीडीएमएस जेल को पीएमएमए मोल्ड में डाला गया था और 1-2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर क्रॉस-लिंक किया गया था। फिर, तीन पीडीएमएस स्लैब और दो पीडीएमएस झिल्ली को 5 मिनट के लिए प्लाज्मा के साथ इलाज किया गया और एक साथ जोड़ा गया। अंत में, तैयार पीडीएमएस चिप्स को निष्फल कर दिया गया था, और पीडीएमएस चिप के मध्यम माइक्रोचैनल में 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल एचएएसएमसी निलंबन की एकाग्रता धीरे-धीरे डाली गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पीडीएमएस चिप के विस्तृत पैरामीटर और यांत्रिक गुण। (ए) पीडीएमएस चिप के विस्तृत पैरामीटर। पीडीएमएस स्लैब आकार 100 मिमी × 40 मिमी × 6 मिमी था, और माइक्रोचैनल आकार 70 मिमी × 6 मिमी × 4 मिमी था। 2 मिमी (सी), 4 मिमी (डी), और 6 मिमी (ई) की माइक्रोचैनल चौड़ाई के लिए विभिन्न वैक्यूम दबावों पर पीडीएमएस झिल्ली के परिकलित स्ट्रेचिंग आयाम। डेटा औसत ± मानक विचलन (एसडी) दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: चक्रीय तनाव स्थितियों के तहत एचएएसएमसी के सेल आकृति विज्ञान, अभिविन्यास और फेनोटाइप परिवर्तन। (ए) पीडीएमएस चिप पर खेती करने वाले एचएएसएमसी सेल लाइन (सीआरएल 1999) के बाद दिन 3 और दिन 5 पर लाइव / डेड परख की प्रतिनिधि छवि। (ख) स्थिर और तनाव की स्थिति में सीआरएल 1999 का एफ-एक्टिन धुंधला होना। (ग) स्थिर और तनाव स्थितियों के तहत सीआरएल 1999 का सेल ओरिएंटेशन। स्थिर और तनाव स्थितियों के तहत सीआरएल 1999 में एसएम 22 (डी) और सीएनएन 1 (ई) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। (एफ) एसएम 22 और सीएनएन 1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की सापेक्ष तीव्रता। (जी) स्थिर और तनाव स्थितियों के तहत सीआरएल 1999 में एसएम 22 और सीएनएन 1 एमआरएनए अभिव्यक्ति। n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग दो समूहों की तुलना करने के लिए किया गया था। डेटा एसडी ± मतलब दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न एचएएसएमसी-ओओसी में सेल आकृति विज्ञान और फेनोटाइपिक परिवर्तन। स्थिर और तनाव स्थितियों के तहत बीएवी-टीएएडी (ए) -व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी और टीएवी-टीएएडी (बी) -व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी के एफ-एक्टिन धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। स्थैतिक और तनाव स्थितियों के तहत बीएवी-टीएएडी (सी) -व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी और टीएवी-टीएएडी (डी) -व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। बीएवी-टीएएडी (ई)-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी और टीएवी-टीएएडी (एफ) -व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में स्थिर और तनाव स्थितियों के तहत सीएनएन 1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। (छ) बीएवी-टीएएडी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की सापेक्ष तीव्रता। (एच) स्थिर और तनाव स्थितियों के तहत बीएवी-टीएएडी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 एमआरएनए अभिव्यक्ति। (i) टीएवी-टीएएडी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की सापेक्ष तीव्रता। (जे) स्थैतिक और तनाव स्थितियों के तहत टीएवी-टीएएडी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी में एसएम 22 और सीएनएन 1 एमआरएनए अभिव्यक्ति। n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग दो समूहों की तुलना करने के लिए किया गया था। डेटा SD ± मतलब दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: उपकरण तैयारी का योजनाबद्ध निर्देश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के साथ, ओओसी मॉडल जो विट्रो में एक या एक से अधिक अंगों के जैविक कार्य और संरचना को दोहरा सकते हैं, हाल के वर्षों में जीव विज्ञान, चिकित्सा और फार्माकोलॉजी15 में अनुप्रयोगों के लिए उभरे हैं। ओओसी मानव शारीरिक माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रमुख कार्यों का अनुकरण कर सकता है, जो रोग तंत्र की खोज और प्रीक्लिनिकल दवा अनुवाद को बढ़ावा देनेके लिए आवश्यक है। यद्यपि ओओसी अभी भी शुरुआती चरणों में है और ओओसी के डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए अधिक इनपुट की आवश्यकता है, हाल केवर्षों में बहुत प्रगति हुई है। अन्य त्रि-आयामी सेल कल्चर मॉडल के विपरीत, ओओसी मानव शरीर के बायोमेकेनिकल मापदंडों की नकल कर सकता है जो ऊतक विकास और अंग समारोह के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम के अंगों और ऊतकों को लगातार विवो में द्रव प्रवाह-प्रेरित कतरनी और चक्रीय तनाव के अधीन किया जाता है। इसलिए, कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम के इन विट्रो सेलुलर प्रयोगों को एक प्रयोगात्मक मंच में किया जाना चाहिए जो विवो अध्ययनों में प्राप्त यथार्थवादी प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना में यथार्थवादी प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए ऐसे बायोमैकेनिकल पैरामीटर प्रदान करता है।

इस अध्ययन में, हमने एक एचएएसएमसी-ओओसी की स्थापना की जो बायोमेकेनिकल तनाव के मापदंडों को ठीक से नियंत्रित कर सकता है जिसके अधीन एचएएसएमसी हैं। द्रव वेग और द्रव कतरनी को नियंत्रित करना संभव है जिसके अधीन कोशिकाएं हैं, साथ ही चक्रीय तनाव के विभिन्न पैटर्न के आयाम, आवृत्ति और लय को ठीक से नियंत्रित करना संभव है। ओओसी के क्षेत्र में उपयोग की जाने वाली कई सामग्रियों में से, पीडीएमएस सबसे व्यापक रूप से अपनाए गए 19,20,21 में से एक है। पीडीएमएस पारदर्शी, लचीला, जैव-संगत और सांस लेने योग्य है, और ये गुण माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स19 के क्षेत्र में इसके व्यापक उपयोग में योगदान करते हैं। लागू दबाव परिवर्तन संकुचन और विश्राम के यांत्रिक बल को प्राप्त करने के लिए पीडीएमएस को विकृत कर सकते हैं, और पीडीएमएस की पारगम्यता यह सुनिश्चित करती है कि चिप पर सेल कल्चर वातावरण इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 की इनक्यूबेशन स्थितियों के अनुरूप हो सकता है। इसलिए, पीडीएमएस न केवल कोशिकाओं को नियंत्रित यांत्रिक बल प्रदान करता है, बल्कि सामान्य सेल विकास के लिए उपयुक्त संस्कृति वातावरण भी प्रदान करता है। हमारे प्रयोगात्मक परिणाम बताते हैं कि पीडीएमएस चिप में संवर्धित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और गतिविधि 2 डी संस्कृति स्थितियों के अनुरूप है, यह दर्शाता है कि पीडीएमएस जैव संगत है।

विवो शारीरिक स्थितियों में बायोमिमेटिक के तहत, महाधमनी दीवार में एचएएसएमसी लगभग 9% 22 के चक्रीय तनाव के अधीन हैं। पैथोलॉजिकल स्थितियों में, जैसे उच्च रक्तचाप, महाधमनी फैलाव, और महाधमनी धमनीविस्फार, एचएएसएमसी 16% 23 से अधिक चक्रीय तनाव के अधीन हैं। हमने पीडीएमएस चिप के तन्यता गुणों की विशेषता बताई, और प्रयोगात्मक परिणाम बताते हैं कि 10 केपीए के वैक्यूम दबाव ने 7.18 ± 0.44% तनाव और 15 केपीए ने 17.28 ± 0.91% तनाव को प्रेरित किया। इसके अलावा, तनाव और द्रव कतरनी तनाव की आवृत्ति को इस पीडीएमएस चिप प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। बीएवी-टीएएडी और टीएवी-टीएएडी रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक एचएएसएमसी का उपयोग करके, इन महाधमनी रोगों के आणविक तंत्र और दवा स्क्रीनिंग को इस एचएएसएमसी-ओओसी इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है, जो विभिन्न महाधमनी रोगों के रोग रोगजनन को दोहरा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने बीएवी-टीएएडी के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक रोग मॉडल स्थापित किया है और पता चला है कि माइटोकॉन्ड्रियल संलयन उत्प्रेरक रोगग्रस्त कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को आंशिक रूप से बचा सकताहै।

एचएएसएमसी-ओओसी को इंगबर के काम9 से फेफड़े-ऑन-ए-चिप की प्रेरणा और संदर्भ के आधार पर डिजाइन किया गया था। उनके डिवाइस ने फेफड़ों में एल्वियोली के शारीरिक श्वास आंदोलनों को दोहराया, और चिप में तीन परतें शामिल थीं: ऊपरी और निचले मध्यम चैनल, एक छिद्रपूर्ण पीडीएमएस झिल्ली और दो साइड वैक्यूम कक्ष। साइड वैक्यूम कक्ष केवल उन्नत माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के साथ विशेष प्रयोगशालाओं में बनाए जा सकते हैं। अधिक सामान्य प्रयोगशाला स्थितियों में असेंबली को सक्षम करने के लिए, हमने वैक्यूम कक्षों को चिप के शीर्ष और निचले हिस्से में रखा। दोनों स्ट्रेचिंग दृष्टिकोणों में समान कार्य हैं, इसलिए चिप संरचना को प्रयोगशाला की स्थितियों और अनुसंधान आवश्यकताओं के अनुसार चुना जा सकता है ताकि चयन किया जा सके। इसके अलावा, संरचनात्मक रूप से मानव महाधमनी की ट्यूबलर संरचना को स्थापित करने और आगे जटिल जैविक विश्लेषण और प्रयोगात्मक परख के संचालन के लिए कोशिकाओं से अधिक जैविक नमूने प्राप्त करने के लिए, हमने बड़े चैनलों के साथ एक पांच-स्तरीय पीडीएमएस चिप की स्थापना की, जिसमें एक मध्य मध्यम चैनल, दो पीडीएमएस झिल्ली और शीर्ष और नीचे वैक्यूम कक्ष शामिल थे। दो पीडीएमएस झिल्ली और पीडीएमएस चिप के बड़े चैनलों ने सेल कल्चर क्षेत्र को 8.4 सेमी2 तक बढ़ा दिया, जिससे प्रोटीन विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूने प्रदान किए गए। पहले रिपोर्ट किए गए प्लेटफार्ममुख्य रूप से मामूली धमनी रोगों की जांच पर केंद्रित थे, जैसे कि सेरेब्रल धमनी, परिधीय पोत, या अन्य धमनी रोग25,26। महाधमनी 25-35 मिमी के व्यास के साथ एक बड़ा पोत है, और महाधमनी का ट्यूनिका मीडिया मुख्य रूप से उच्च तन्यता तनाव के अधीन चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से बना है। ऑर्टोपैथी की विकृति महाधमनी की दीवार, चिकनी मांसपेशी कोशिका एपोप्टोसिस और फेनोटाइपिक स्विचिंग के रीमॉडेलिंग से जुड़ी है, जिनमें से सभी को यांत्रिक तनाव द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। इस प्रकार, एचएएसएमसी-ओओसी की सफलता के लिए रोगी-व्युत्पन्न एचएएसएमसी और तन्यता तनाव आवश्यक घटक हैं। हालांकि, इस अध्ययन की कुछ सीमाएं हैं। एचएएसएमसी-ओओसी ने एचएएसएमसी, महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स सहित सह-संवहनी कोशिकाओं का उपयोग नहीं किया, जो मानव महाधमनी के विवो माइक्रोएन्वायरमेंट में बेहतर अनुकरण कर सकते हैं और इन कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि एचएएसएमसी लयबद्ध तनाव का अनुभव करते हैं, फिर भी कोशिकाओं को एक सपाट पीडीएमएस झिल्ली पर सुसंस्कृत किया जाता है जो बाह्य मैट्रिक्स की नकल करने में विफल रहता है। भविष्य के अध्ययनों में, हम 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के संयोजन से इन सीमाओं को दूर करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक स्वीकार करते हैं कि इस काम को शंघाई नगर पालिका (20ZR1411700), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81771971), और शंघाई नौकायन कार्यक्रम (22YF1406600) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde Beyotime P0099-100ml Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0408 Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin Beyotime ST025-20g
Calcium AM/PI Invitrogen L3224
Cell culture flask  Corning 430639
CNN1 Abcam  Ab46794
Commercial flexible
PDMS membrane		 Hangzhou Bald Advanced Materials KYQ-200
F-actin Invitrogen R415
FBS Sigma M8318
Hoses Runze Fluid 96410 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth
muscle cell line CRL1999		 ATCC Lot Number:70019189
Image J Imagej.net/fiji/downloads Free Download: https://fiji.sc Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator Thermo Fisher Scientific Ensures that the temperature,
humidity, and light exposure is
exactly the same throughout
experiment.
Luer Runze Fluid RH-M016 Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope Olympus
mouse collagen Sigma C7661
Oxygen plasma  Changzhou Hongming Instrument HM-Plasma5L
Pasteur pipette Biologix 30-0138A1
PBS Beyotime C0221A
Pen-Strep Sigma P4458-100ml Antibiodics used to prevent bacterial
contamination of cells during culture.
peristaltic pump Kamoer F01A-STP-B046
Petri dish Corning 430167
PLC controller Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory BR010-11T8X2M The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
SM22 Abcam  ab14106
SMCM ScienCell Cat 1101
solenoid valve SMC (China) VQZ300
Syringe Becton,Dickinson and Company 300841
Triton-X 100 Beyotime ST795 To penetrate cell membranes
Trizol Invitrogen 10296010 Used for RNA extraction
trypsin Sigma 15400054
vacuum filter SMC (China) ZFC5-6 Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump Kamoer KVP15-KL-S
vacuum regulator AirTAC GVR-200-06
Primers
Primer Name Forward (5’ to 3’) Reverse (5’ to 3’)
SM22 CCGTGGAGATCCCAACTGG CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1 CTCCATTGACTCGAACGACTC CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 185 ऑर्गन-ऑन-ए-चिप ऑर्टोपैथी मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं चक्रीय तनाव सेल फेनोटाइप
महाधमनी दीवार में बायोमेकेनिकल स्ट्रेन को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिका अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल का निर्माण
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