Summary
Qui, abbiamo sviluppato un modello organ-on-a-chip di cellule muscolari lisce dell'aorta umana per replicare il ceppo biomeccanico in vivo delle cellule muscolari lisce nella parete aortica umana.
Abstract
Tecniche convenzionali di coltura cellulare bidimensionale e modelli animali sono stati utilizzati nello studio dell'aneurisma e della dissezione dell'aorta toracica umana (TAAD). Tuttavia, il TAAD umano a volte non può essere caratterizzato da modelli animali. C'è un apparente divario di specie tra gli studi clinici sull'uomo e gli esperimenti sugli animali che può ostacolare la scoperta di farmaci terapeutici. Al contrario, il modello di coltura cellulare convenzionale non è in grado di simulare stimoli biomeccanici in vivo . A tal fine, le tecniche di microfabbricazione e microfluidica si sono sviluppate notevolmente negli ultimi anni, fornendo nuove tecniche per stabilire modelli organoidi-on-a-chip che replicano il microambiente biomeccanico. In questo studio, è stato sviluppato un modello di organ-on-a-chip (HASMC-OOC) di cellule muscolari lisce dell'aorta umana per simulare i parametri fisiopatologici della biomeccanica aortica, compresa l'ampiezza e la frequenza della tensione ciclica sperimentata dalle cellule muscolari lisce aortiche umane (HASMC) che svolgono un ruolo vitale nella TAAD. In questo modello, la morfologia degli HASMC è diventata di forma allungata, allineata perpendicolarmente alla direzione della deformazione e ha presentato un fenotipo più contrattile in condizioni di deformazione rispetto alle condizioni convenzionali statiche. Ciò era coerente con l'orientamento e il fenotipo cellulare nelle pareti aortiche umane native. Inoltre, utilizzando TAAD (BAV-TAAD) correlati alla valvola aortica bicuspide e HASMC primari derivati dal paziente TAAD (TAV-TAAD) correlati alla valvola aortica tricuspide, abbiamo stabilito modelli di malattia BAV-TAAD e TAV-TAAD, che replicano le caratteristiche HASMC in TAAD. Il modello HASMC-OOC fornisce una nuova piattaforma in vitro complementare ai modelli animali per esplorare ulteriormente la patogenesi della TAAD e scoprire bersagli terapeutici.
Introduction
L'aneurisma e la dissezione dell'aorta toracica (TAAD) sono una dilatazione localizzata o delaminazione della parete aortica associata ad elevata morbilità e mortalità1. Le cellule muscolari lisce aortiche umane (HASMC) svolgono un ruolo vitale nella patogenesi della TAAD. Gli HASMC non sono cellule differenziate terminalmente e gli HASMC mantengono un'elevata plasticità, consentendo loro di cambiare fenotipo in risposta a stimoli diversi2. Gli HASMC sono principalmente sottoposti a tensione ritmica di trazione in vivo, e questo è uno dei fattori chiave che regolano i cambiamenti morfologici della muscolatura liscia, la differenziazione e le funzioni fisiologiche 3,4. Pertanto, il ruolo della deformazione ciclica nello studio degli HASMC non può essere ignorato. Tuttavia, le colture cellulari 2D convenzionali non possono replicare la stimolazione biomeccanica del ceppo ciclico sperimentato dagli HASMC in vivo. Inoltre, la costruzione di un modello TAAD animale non è adatta per alcuni tipi di TAAD, come il TAAD correlato alla valvola aortica bicuspide (BAV). Inoltre, il divario di specie tra studi clinici sull'uomo e esperimenti sugli animali non può essere ignorato. Ostacola la traduzione farmaceutica nella pratica clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di sistemi più complessi e fisiologici per simulare l'ambiente biomeccanico in vivo nella ricerca delle malattie aortiche.
Gli esperimenti sugli animali utilizzati nella ricerca biomedica e nello sviluppo di farmaci sono costosi, dispendiosi in termini di tempo ed eticamente discutibili. Inoltre, i risultati degli studi sugli animali spesso non riescono a prevedere i risultati ottenuti nelle sperimentazioni cliniche sull'uomo 5,6. La mancanza di modelli preclinici umani e l'alto tasso di fallimento negli studi clinici hanno portato a pochi farmaci efficaci per la clinica, il che ha aumentato i costi dell'assistenza sanitaria7. Pertanto, è urgente trovare altri modelli sperimentali per integrare i modelli animali. Le tecniche di microfabbricazione e microfluidica si sono sviluppate notevolmente negli ultimi anni, fornendo nuove tecniche per stabilire modelli organoidi-on-a-chip che rimediano agli inconvenienti delle tradizionali tecniche di coltura cellulare 2D e stabiliscono un modello in vitro più realistico, a basso costo ed efficiente per studi fisiologici e sviluppo di farmaci. Utilizzando dispositivi microfluidici, gli organi su chip vengono stabiliti per coltivare cellule viventi in camere di dimensioni micrometriche con stimoli diversi per replicare le funzioni chiave di un tessuto o organo. Il sistema è costituito da microcanali microfluidici singoli o multipli, con un tipo di cellula coltivata in una camera perfusa che replica le funzioni di un tipo di tessuto o diversi tipi di cellule coltivate su membrane porose per ricreare interfacce tra diversi tessuti. Gli organoidi a base microfluidica combinati con cellule derivate dal paziente hanno il vantaggio unico di colmare la grande differenza di specie tra modelli di malattie muniche e umane e superare gli svantaggi della tradizionale coltura cellulare 2D per la ricerca sui meccanismi della malattia e la scoperta di farmaci. Con il rapido sviluppo della microfluidica negli ultimi anni, i ricercatori hanno compreso l'utilità di modelli in vitro organ-on-a-chip (OOC) che replicano complessi parametri biologici in vivo 8. Questi organoidi microfluidici simulano ambienti biomeccanici in vitro, come la deformazione ciclica, lo sforzo di taglio e la pressione del liquido, fornendo un ambiente di coltura cellulare tridimensionale (3D). Ad oggi, sono stati stabiliti diversi modelli OOC per simulare stimoli biomeccanici in organi come il polmone9, il rene 10, il fegato11, l'intestino 12 e il cuore 13, ma questi non sono stati ampiamente applicati allo studio della malattia dell'aorta umana.
In questo studio, presentiamo un modello di organo su chip (HASMC-OOC) di cellule muscolari lisce dell'aorta umana in grado di controllare le forze e i ritmi meccanici biomimetici applicati agli HASMC primari derivati dal paziente TAAD. Il chip è costituito da piastre spesse a tre strati di polidimetilsilossano (PDMS) incise con canali e due membrane PDMS altamente flessibili commercializzate. Gli HASMC sono coltivati sulle membrane PDMS. Il canale al centro del chip è riempito con un terreno di coltura per la coltura cellulare. I canali superiore e inferiore del chip sono collegati a un sistema di alimentazione a pressione del vuoto in grado di controllare il ritmo e la frequenza della deformazione meccanica di trazione delle membrane PDMS. La deformazione ritmica sperimentata dagli HASMC può essere simulata in HASMC-OOC, replicando il microambiente biomeccanico di tessuti o organi non funzionalmente realizzabili con i sistemi di coltura 2D convenzionali. Con il vantaggio dell'imaging ad alta risoluzione e in tempo reale e del microambiente biomeccanico, le attività biochimiche, genetiche e metaboliche delle cellule viventi possono essere studiate per lo sviluppo dei tessuti, la fisiologia degli organi, l'eziologia della malattia, i meccanismi molecolari e l'identificazione dei biomarcatori, le malattie cardiovascolari e le malattie aortiche. In combinazione con cellule tessuto-specifiche e pazienti, questo sistema può essere utilizzato per lo screening farmacologico, la medicina personalizzata e i test di tossicità. Questo modello HASMC-OOC fornisce una nuova piattaforma in vitro per lo studio della patogenesi della malattia aortica.
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Protocol
Campioni di aorta umana sono stati utilizzati per l'isolamento primario di HASMC sotto l'approvazione dell'ospedale Zhongshan, del comitato etico dell'Università di Fudan (NO. B2020-158). Sono stati raccolti campioni aortici da pazienti sottoposti a chirurgia dell'aorta ascendente presso l'ospedale Zhongshan, Università di Fudan. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti prima della partecipazione.
1. Isolamento primario delle cellule muscolari lisce aortiche umane
- Lavare la regione laterale destra dell'aorta ascendente con PBS sterile, 1x-2x.
- Rimuovere gli strati intimi e avventizi del tessuto con due pinze oftalmiche e mantenere lo strato di media per raccogliere le cellule.
- Posizionare lo strato di supporto su un piatto di coltura di 10 cm e tagliarlo a pezzetti (2-3 mm) con le forbici. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura per cellule muscolari lisce (SMCM) contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
- Spostare il piccolo tessuto nella bottiglia di coltura con un contagocce sterile, distribuendo il tessuto in modo uniforme. Scartare il terreno di coltura il più possibile, quindi capovolgere la bottiglia.
- Aggiungere 2 mL di SMCM nel flacone di coltura invertito e metterlo nell'incubatore (5% CO 2) a 37 °C per 1-2 ore, quindi ruotarlo lentamente verso l'alto e aggiungere altri2 mL di SMCM.
- Dopo 5-7 giorni di incubazione, sostituire l'SMCM con 4 ml di SMCM fresco. Generalmente, le cellule muscolari lisce sporadiche si arrampicano in circa 2 settimane.
- Scartare lentamente l'SMCM e aggiungerlo lentamente quando si cambia il supporto. Trasportare lentamente la bottiglia di coltura quando ci si sposta verso una stazione di microscopio; Altrimenti, i tessuti galleggeranno e le cellule cresceranno lentamente.
- Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, lavare con 2 ml di PBS, digerire con 2 ml di tripsina allo 0,25% e dividerli in due nuovi flaconi di coltura con 4 ml di SMCM fresco.
- Identificare le cellule attraverso un'analisi di immunofluorescenza di quattro diversi marcatori specifici per cellule muscolari lisce (CNN1, SM22)14.
2. Preparazione del chip PDMS
- Per polimerizzare PDMS, aggiungere l'agente di polimerizzazione (componente B) alla base (componente A) con un rapporto di peso di A: B = 10: 1 w / w / p e mescolare completamente il complesso per 5 minuti; Il volume dipende dalla necessità dello studio.
- Posizionare il gel PDMS preparato in un serbatoio di estrazione sottovuoto per 30-60 minuti e mantenere la pressione al di sotto di -0,8 mPa.
NOTA: L'alta pressione porterà a un'estrazione insufficiente di piccole bolle all'interno del gel PDMS che influenzeranno la fase successiva della fabbricazione del chip. - Utilizzando un software CAD (computer-aided design), progettare lo stampo con una struttura esterna del telaio da 100 mm × 40 mm × 8 mm e un canale da 70 mm × 6 mm × 4 mm.
- Su misura realizza gli stampi dei tre strati utilizzando una macchina per incisione a controllo numerico computerizzato ad alta precisione. Ritagliare il telaio degli stampi e dei microcanali utilizzando lastre di polimetilmetacrilato (PMMA), quindi incollarle su un'altra lastra di PMMA.
- Versare il gel PDMS preparato su uno stampo con un telaio esterno da 100 mm × 40 mm × 6 mm e un canale da 70 mm × 6 mm × 4 mm, quindi reticolare a 70 °C per 1-2 ore.
- Staccare le lastre PDMS reticolate dallo stampo e tagliare le membrane PDMS commercializzate in sezioni da 100 mm × 40 mm.
- Trattare le tre lastre PDMS preparate e le due membrane PDMS con plasma di ossigeno per 5 minuti per l'attivazione superficiale PDMS. Applicare le seguenti impostazioni specifiche: aria ambiente come gas di processo; pressione impostata a -100 kPa; corrente impostata su 180--200 Ma; tensione impostata su 200 V; Tempo di elaborazione a 5 min.
- Fori di punzonatura sulle tre lastre PDMS utilizzando un perforatore da 1 mm per rendere l'ingresso e l'uscita dell'aria e microcanali medi sul chip PDMS.
- Incollare tre lastre PDMS e due membrane PDMS insieme nell'ordine: lastra PDMS canale aria (strato superiore) - membrana PDMS - lastra PDMS a canale medio (strato intermedio) - membrana PDMS - lastra PDMS canale aria (strato inferiore). Eseguire questo passaggio al microscopio stereoscopico a 4x per sovrapporre completamente i microcanali dell'aria con i microcanali medi.
- Posizionare il chip PDMS assemblato in un incubatore a 70 °C per 1 ora.
- Preparare diversi tubi in lattice di diametro interno di 1 mm e lunghezza 3 cm. Inserire un ago in acciaio inossidabile di 1 mm di diametro esterno e 1 cm di lunghezza in un'estremità del tubo preparato, quindi inserire un Luer nell'altra estremità del tubo per creare il tubo collegato all'aria e ai microcanali medi del chip PDMS.
- Inserire i tubi preparati nelle uscite e nelle prese dell'aria e dei microcanali medi sul chip PDMS.
3. Trattamento superficiale e sterilizzazione dei trucioli PDMS
- Infondere 2 mL di collagene di topo da 80 mg/mL nel microcanale medio del chip PDMS utilizzando una siringa da 2 mL e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il collagene dal canale e raccogliere con una siringa da 2 ml. Posizionare i chip PDMS rivestiti di collagene in un'incubatrice a 60 °C durante la notte.
- Mettere i chip PDMS in uno sterilizzatore UV per più di 1 ora. Posizionare i chip PDMS sterilizzati su un banco ultraclean in preparazione per l'esperimento cellulare.
4. Semina cellulare sul chip PDMS e processo di allungamento delle cellule
- Coltura 4 x 10 5 cellule muscolari lisce umane primarie (HASMC) da pazienti che utilizzano terreno di coltura liscia (SMCM) contenenti il 2% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina in un incubatore al5 % di CO2 a 37 °C.
- Quando la densità HASMC raggiunge l'80%, scartare l'SMCM e lavare le cellule con 2 ml di PBS.
- Digerire le cellule usando 1 ml di tripsina allo 0,25% per 2 minuti e centrifugare a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di SMCM fresco. Utilizzare 8 ml di SMCM per coltivare le cellule su un piatto di coltura da 10 cm.
- Calcolare il numero di cellule utilizzando un citometro e utilizzare le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 105 cellule / ml.
- Versare lentamente 2 ml di PBS nel microcanale medio del chip PDMS rivestito di collagene e sterilizzato e successivamente scartare utilizzando una siringa da 2 ml.
- Versare lentamente un totale di 2 mL di 2 x 105 celle/mL di sospensione HASMC nel microcanale medio del chip PDMS utilizzando una siringa da 2 ml. Quindi, chiudere il Luer all'ingresso e all'uscita del chip PDMS. Posizionare il chip PDMS in un incubatore (5% CO2) a 37 °C per 1 giorno.
- Dopo che le celle sono state attaccate alla membrana PDMS nel chip PDMS, quasi dopo 24 ore, collegare l'uscita del microcanale dell'aria sul chip PDMS al sistema di controllo del vuoto. Quando la cellula è attaccata, una forma cellulare allungata e normale può essere vista al microscopio, in contrasto con le cellule rotonde sospese.
- Accendere l'elettrovalvola e la pompa per vuoto. Aprire il regolatore del vuoto e regolare il livello di pressione a 10 kPa per una deformazione del 7,18 ± dello 0,44% e 15 kPa per una deformazione del 17,28 ± dello 0,91%.
- Dopo aver impostato i parametri del sistema di controllo, posizionare i chip PDMS in un incubatore (5% CO2) a 37 °C e allungare per 24 ore.
5. Preparazione del sistema di controllo meccanico
- Preparare diverse elettrovalvole, filtri per vuoto, regolatori di vuoto, una pompa per vuoto, una pompa peristaltica e un controllore logico programmabile (PLC) che controlla l'elettrovalvola.
- Programmare il controllore PLC e impostare l'intervallo di accensione/spegnimento su 1 Hz. Collegare le elettrovalvole al controller programmato.
- Collegare l'ingresso della pompa per vuoto ai filtri per vuoto, quindi collegare l'uscita dei filtri per vuoto ai regolatori del vuoto. Collegare l'uscita dei regolatori del vuoto alle elettrovalvole e, infine, collegare l'uscita delle elettrovalvole alle uscite dei microcanali dell'aria dei chip PDMS.
- Collegare l'uscita della pompa peristaltica all'ingresso del microcanale medio del chip PDMS e l'ingresso della pompa peristaltica all'uscita del chip PDMS a microcanale medio per la sostituzione del terreno di coltura e la manipolazione del farmaco.
- Regolare l'ampiezza della deformazione dal regolatore e la frequenza di deformazione dal microcontrollore.
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Representative Results
Il modello HASMC-OOC è costituito da un sistema di controllo del vuoto, un sistema di circolazione e chip PDMS e il design schematico del modello HASMC-OOC (Figura 1). Il sistema di controllo del vuoto è costituito da una pompa per vuoto, elettrovalvole e un controller PLC. Per agire come sistema circolante, è stata utilizzata una pompa peristaltica per rinfrescare il terreno di coltura cellulare e aggiungere farmaci. Il chip PDMS era composto da due camere a vuoto e una camera centrale riempita con SMCM per la crescita cellulare. Secondo il design della struttura del chip, è stato preparato lo stampo in PMMA e le tre lastre PDMS sono state preparate versando in stampi e reticolando a 70 °C per 2 ore. Dopo il trattamento con plasma, le tre lastre PDMS e le due membrane PDMS sono state legate insieme (Figura 2). Quando i chip PDMS sono stati preparati, gli HASMC sono stati coltivati sulla membrana PDMS nel chip e i chip PDMS sono stati collegati al sistema di controllo del vuoto e al sistema di circolazione. Uno schema dell'intero sistema è mostrato nella figura supplementare 1. I parametri del chip PDMS sono mostrati nella Figura 3A e le proprietà meccaniche della membrana PDMS sono mostrate nella Figura 3B. Per quantificare le deformazioni di trazione della membrana PDMS, abbiamo catturato le deformazioni in tempo reale delle membrane PDMS da una vista in sezione trasversale del modello microfluidico, con pressioni di vuoto di 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa e 30 kPa. Abbiamo anche misurato i cambiamenti di lunghezza per valutare l'entità della deformazione della membrana PDMS in diverse larghezze del canale di coltura di 2 mm, 4 mm e 6 mm (Figura 3C-E). Nel chip PDMS sono stati utilizzati microcanali larghi 6 mm. I risultati hanno mostrato che una pressione del vuoto di 10 kPa ha indotto una deformazione del 7,18 ± dello 0,44% e 15 kPa ha indotto una deformazione del 17,28 ± dello 0,91% (Figura 3E).
Per verificare la vitalità cellulare della linea cellulare HASMC (CRL1999) nel chip PDMS, è stato eseguito un test LIVE/DEAD nei giorni 3 e 5 dopo la coltura delle cellule. I risultati hanno mostrato che la vitalità cellulare era superiore al 90% al giorno 3 e al giorno 5 (Figura 4A). La colorazione con citoscheletro (F-actina) di CRL1999 nel chip PDMS ha mostrato una normale morfologia cellulare e cellule allineate perpendicolarmente al ceppo dopo l'allungamento per 24 ore (Figura 4B-C). La colorazione a immunofluorescenza dei marcatori contrattili SM22 e CNN1 è stata eseguita utilizzando HASMC-OOC dopo 24 ore di sforzo ritmico (Figura 4D-E). Per iniziare, 2 ml di PBS sono stati versati lentamente nel canale e scartati con una siringa da 2 ml. Successivamente, 2 ml di paraformaldeide al 4% (v/v) sono stati versati nel canale e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, 2 ml di Triton X-100 allo 0,2% (v/v) sono stati versati nel canale da una siringa da 2 ml e incubati per 15 minuti a temperatura ambiente. Questo è stato seguito da 2 ml di PBS che sono stati versati lentamente nel canale e scartati da una siringa da 2 ml dopo aver lavato le cellule. Successivamente, 2 ml di albumina sierica bovina al 5% (p/v) sono stati versati lentamente nel canale e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, 1 mL di anticorpo SM22 o CNN1 è stato lentamente versato nel canale e incubato durante la notte a 4 ° C. Dopo l'incubazione, 1 mL di anticorpo secondario anti-coniglio di capra è stato lentamente versato nel canale e incubato per 1 ora a temperatura ambiente. Infine, 1 mL di soluzione DAPI è stato versato lentamente nel canale e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente. I risultati hanno mostrato che l'intensità di fluorescenza di SM22 e CNN1 in condizioni di deformazione era superiore a quella in condizioni statiche (Figura 4F). Rispetto alle condizioni statiche, i geni SM22 e CNN1 negli HASMC erano sovraregolati in condizioni di ceppo (Figura 4G). Questi dati hanno suggerito che CRL1999 si è allineato perpendicolarmente alla direzione del ceppo e che un fenotipo contrattile era più pronunciato in condizioni di deformazione rispetto alla coltura cellulare convenzionale in condizioni statiche.
Utilizzando TAAD (BAV-TAAD) correlati alla valvola aortica bicuspide e HASMC primari derivati dal paziente TAAD (TAV-TAAD) correlati alla valvola aortica tricuspide, abbiamo stabilito modelli di malattia BAV-TAAD e TAV-TAAD. I risultati della colorazione F-actina degli HASMC primari derivati dal paziente BAV-TAAD e TAV-TAAD hanno mostrato una morfologia cellulare normale e cellule allineate perpendicolarmente alla direzione della deformazione dopo lo stiramento per 24 ore (Figura 5A-B). La colorazione con immunofluorescenza ha mostrato che l'espressione di SM22 e CNN1 negli HASMC primari derivati da pazienti BAV-TAAD e TAV-TAAD era più elevata in condizioni di deformazione rispetto a condizioni statiche (Figura 5C-G,I). I livelli di espressione genica di SM22 e CNN1 negli HASMC primari derivati da pazienti BAV-TAAD e TAV-TAAD sono stati sovraregolati in condizioni di deformazione rispetto alle condizioni statiche (Figura 5H,J). Questi risultati negli HASMC primari derivati dal paziente BAV-TAAD e TAV-TAAD nel chip PDMS erano coerenti con i risultati della linea cellulare HASMC CRL1999, indicando che la combinazione di HASMC primari derivati dal paziente e il modello HASMC-OOC replicano le caratteristiche di HASMC in TAAD, che fornisce un modello di malattia in vitro BAV-TAAD e TAV-TAAD per ulteriori indagini sui meccanismi molecolari della malattia e sullo screening dei farmaci.
Figura 1: Progettazione schematica del sistema HASMC-OOC. Il sistema è costituito da un sistema di controllo del vuoto, un sistema di circolazione e chip PDMS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Procedura di preparazione del chip PDMS. Il gel PDMS è stato versato in uno stampo in PMMA e reticolato a 70 °C per 1-2 ore. Quindi, le tre lastre PDMS e due membrane PDMS sono state trattate con plasma per 5 minuti e legate insieme. Infine, i chip PDMS preparati sono stati sterilizzati e una concentrazione di 2 x 105 cellule / mL sospensione HASMC è stata lentamente versata nel microcanale medio del chip PDMS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: I parametri dettagliati e le proprietà meccaniche del chip PDMS. (A) I parametri dettagliati del chip PDMS. La dimensione della lastra PDMS era di 100 mm × 40 mm × 6 mm e la dimensione del microcanale era di 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) I parametri della membrana PDMS commerciale. L'ampiezza di allungamento calcolata della membrana PDMS a diverse pressioni del vuoto per larghezze di microcanali di 2 mm (C), 4 mm (D) e 6 mm (E). I dati mostrano la deviazione standard media ± (SD). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Morfologia cellulare, orientamento e alterazione fenotipica degli HASMC in condizioni di ceppo ciclico. (A) Immagine rappresentativa del saggio LIVE/DEAD al giorno 3 e al giorno 5 dopo la coltura della linea cellulare HASMC (CRL1999) su un chip PDMS. (B) Colorazione F-actina di CRL1999 in condizioni statiche e di deformazione. (C) L'orientamento della cella di CRL1999 in condizioni statiche e di deformazione. Immagine rappresentativa della colorazione con immunofluorescenza di SM22 (D) e CNN1 (E) in CRL1999 in condizioni statiche e di deformazione. (F) L'intensità relativa della colorazione con immunofluorescenza di SM22 e CNN1. (G) Espressione di mRNA SM22 e CNN1 in CRL1999 in condizioni statiche e di deformazione. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, i test t di Student a due code sono stati utilizzati per confrontare i due gruppi. I dati mostrano la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Morfologia cellulare e alterazioni fenotipiche in HASMC-OOC derivate da pazienti BAV-TAAD e TAV-TAAD. Immagine rappresentativa della colorazione F-actina degli HASMC primari derivati da BAV-TAAD (A) e degli HASMC primari derivati da TAAV-TAAD (B) in condizioni statiche e di deformazione. Colorazione con immunofluorescenza SM22 in HASMC primari derivati da BAV-TAAD (C) e HASMC primari derivati da TAV-TAAD (D) in condizioni statiche e di deformazione. Immagine rappresentativa della colorazione a immunofluorescenza di CNN1 in HASMC primari derivati da BAV-TAAD (E) e HASMC primari derivati da TAAV-TAAD (F) in condizioni statiche e di deformazione. (G) L'intensità relativa della colorazione con immunofluorescenza SM22 e CNN1 negli HASMC primari derivati da BAV-TAAD. (H) Espressione di mRNA SM22 e CNN1 in HASMC primari derivati da BAV-TAAD in condizioni statiche e di deformazione. (I) L'intensità relativa della colorazione con immunofluorescenza SM22 e CNN1 negli HASMC primari derivati da TAV-TAAD. (J) Espressione di mRNA SM22 e CNN1 in HASMC primari derivati da TAV-TAAD in condizioni statiche e di deformazione. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, i test t di Student a due code sono stati utilizzati per confrontare i due gruppi. I dati mostrano la media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Istruzioni schematiche della preparazione dell'attrezzatura. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Con il rapido sviluppo della tecnologia microfluidica, negli ultimi anni sono emersi modelli OOC in grado di replicare la funzione biologica e la struttura di uno o più organi in vitro per applicazioni in biologia, medicina e farmacologia15. L'OOC può simulare funzioni chiave del microambiente fisiologico umano, essenziali per esplorare i meccanismi della malattia e promuovere la traduzione preclinica dei farmaci 8,16. Sebbene l'OOC sia ancora nelle fasi iniziali e siano necessari ulteriori input per ottimizzare la progettazione di OOC, negli ultimi anni sono stati compiuti molti progressi17,18. A differenza di altri modelli di coltura cellulare tridimensionale, l'OOC può imitare i parametri biomeccanici del corpo umano che sono essenziali per lo sviluppo dei tessuti e il mantenimento della funzione degli organi. Gli organi e i tessuti del sistema cardiovascolare sono costantemente sottoposti al taglio indotto dal flusso di fluidi e alla tensione ciclica in vivo. Pertanto, gli esperimenti cellulari in vitro del sistema cardiovascolare devono essere eseguiti in una piattaforma sperimentale che fornisca tali parametri biomeccanici per ottenere risultati sperimentali realistici paragonabili a quelli ottenuti da studi in vivo.
In questo studio, abbiamo stabilito un HASMC-OOC in grado di controllare con precisione i parametri del ceppo biomeccanico a cui sono sottoposti gli HASMC. È possibile controllare la velocità del fluido e il taglio del fluido a cui sono sottoposte le cellule, nonché controllare con precisione l'ampiezza, la frequenza e il ritmo di diversi modelli di deformazione ciclica. Tra i molti materiali che sono stati utilizzati nel campo dell'OOC, PDMS è uno dei più adottati 19,20,21. PDMS è trasparente, flessibile, biocompatibile e traspirante, e queste proprietà contribuiscono al suo ampio utilizzo nel campo dei chip microfluidici19. Le variazioni di pressione applicate possono deformare PDMS per ottenere la forza meccanica di contrazione e rilassamento e la permeabilità del PDMS assicura che l'ambiente di coltura cellulare sul chip possa essere coerente con le condizioni di incubazione del 5% di CO2 a 37 °C nell'incubatore. Pertanto, PDMS non solo fornisce una forza meccanica controllata alle cellule, ma fornisce anche un ambiente di coltura adatto alla normale crescita cellulare. I nostri risultati sperimentali mostrano che la morfologia e l'attività delle cellule coltivate nel chip PDMS sono coerenti con le condizioni di coltura 2D, indicando che PDMS è biocompatibile.
In condizioni fisiologiche biomimetiche in vivo , gli HASMC nella parete aortica sono sottoposti allo sforzo ciclico di circa il 9%22. In condizioni patologiche, come ipertensione, dilatazione aortica e aneurisma aortico, gli HASMC sono sottoposti a sforzo ciclico superiore al 16%23. Abbiamo caratterizzato le proprietà di trazione del chip PDMS e i risultati sperimentali mostrano che una pressione del vuoto di 10 kPa ha indotto una deformazione del 7,18 ± 0,44% e 15 kPa ha indotto una deformazione del 17,28 ± dello 0,91%. Inoltre, la frequenza della deformazione e lo sforzo di taglio del fluido possono essere controllati da questo sistema di chip PDMS. Utilizzando gli HASMC primari derivati dal paziente BAV-TAAD e TAV-TAAD, i meccanismi molecolari e lo screening farmacologico di queste malattie aortiche possono essere condotti utilizzando questo modello in vitro HASMC-OOC, che può replicare la patogenesi della malattia di diverse malattie aortiche. Utilizzando questo sistema, abbiamo stabilito un modello di malattia per studiare la patogenesi di BAV-TAAD e abbiamo rivelato che l'attivatore della fusione mitocondriale potrebbe parzialmente salvare la disfunzione mitocondriale nelle cellule malate24.
L'HASMC-OOC è stato progettato sulla base dell'ispirazione e del riferimento di lung-on-a-chip dal lavoro di Ingber9. Il loro dispositivo replicava i movimenti respiratori fisiologici degli alveoli nel polmone e il chip consisteva di tre strati: canali medi superiori e inferiori, una membrana PDMS porosa e due camere a vuoto laterali. Le camere a vuoto laterali possono essere realizzate solo in laboratori specializzati con apparecchiature microfluidiche avanzate. Per consentire l'assemblaggio in condizioni di laboratorio più generali, abbiamo posizionato le camere a vuoto sulla parte superiore e inferiore del chip. Entrambi gli approcci di stretching hanno funzioni simili, quindi la struttura del chip può essere scelta in base alle condizioni di laboratorio e alle esigenze di ricerca in modo cheselezionato. Inoltre, per stabilire strutturalmente la struttura tubolare dell'aorta umana e ottenere più campioni biologici dalle cellule per condurre ulteriori analisi biologiche complesse e saggi sperimentali, abbiamo stabilito un chip PDMS a cinque strati con canali più grandi, che consisteva in un canale medio medio, due membrane PDMS e camere a vuoto superiore e inferiore. Due membrane PDMS e i grandi canali del chip PDMS hanno aumentato l'area di coltura cellulare fino a 8,4 cm2, fornendo campioni sufficienti per l'analisi delle proteine. Le piattaforme precedentemente segnalate si sono concentrate principalmente sullo studio di malattie minori delle arterie, come un'arteria cerebrale, un vaso periferico o altre malattie arteriose25,26. L'aorta è un grande vaso con un diametro di 25-35 mm, e la tunica media dell'aorta è composta principalmente da cellule muscolari lisce soggette ad alta tensione di trazione. La patologia dell'aortopatia è associata al rimodellamento della parete aortica, all'apoptosi delle cellule muscolari lisce e alla commutazione fenotipica, che possono essere regolati dallo stress meccanico. Pertanto, gli HASMC derivati dal paziente e la deformazione di trazione sono componenti essenziali per il successo di HASMC-OOC. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni a questo studio. HASMC-OOC non ha utilizzato cellule vascolari cocolte, tra cui HASMC, cellule endoteliali aortiche e fibroblasti, che potrebbero simulare meglio il microambiente in vivo dell'aorta umana e possono essere utilizzate per studiare l'interazione tra queste cellule. Sebbene gli HASMC sperimentino una tensione ritmica, le cellule sono ancora coltivate su una membrana PDMS piatta che non riesce a imitare la matrice extracellulare. Negli studi futuri, supereremo questi limiti combinando chip microfluidici con la tecnologia di bioprinting 3D.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono che questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Commissione per la scienza e la tecnologia della municipalità di Shanghai (20ZR1411700), della National Natural Science Foundation of China (81771971) e del Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
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