Summary
Her udviklede vi en human aorta glat muskelcelleorgan-på-en-chip-model til at replikere den in vivo biomekaniske stamme af glatte muskelceller i den menneskelige aortavæg.
Abstract
Konventionelle todimensionelle cellekulturteknikker og dyremodeller er blevet anvendt i undersøgelsen af human thoraxaortaaneurisme og dissektion (TAAD). Imidlertid kan menneskelig TAAD undertiden ikke karakteriseres af dyremodeller. Der er en tilsyneladende artskløft mellem kliniske humane undersøgelser og dyreforsøg, der kan hindre opdagelsen af terapeutiske lægemidler. I modsætning hertil er den konventionelle cellekulturmodel ikke i stand til at simulere in vivo biomekaniske stimuli. Til dette formål har mikrofabrikation og mikrofluidiske teknikker udviklet sig meget i de senere år, hvilket giver nye teknikker til etablering af organoider-on-a-chip-modeller, der replikerer det biomekaniske mikromiljø. I denne undersøgelse blev der udviklet en human aorta glat muskelcelleorgan-på-en-chip (HASMC-OOC) model til at simulere de patofysiologiske parametre for aorta biomekanik, herunder amplituden og hyppigheden af cyklisk stamme oplevet af humane aorta glatte muskelceller (HASMC'er), der spiller en afgørende rolle i TAAD. I denne model blev HASMC'ernes morfologi langstrakt i form, justeret vinkelret på belastningsretningen og præsenterede en mere kontraktil fænotype under belastningsforhold end under statiske konventionelle forhold. Dette var i overensstemmelse med celleorienteringen og fænotypen i indfødte menneskelige aortavægge. Derudover etablerede vi BAV-TAAD- og TAV-TAAD-sygdomsmodeller ved hjælp af bicuspid aortaklap-relaterede TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklaprelaterede TAAD (TAV-TAAD) patientafledte primære HASMC'er. HASMC-OOC-modellen giver en ny in vitro-platform , der supplerer dyremodeller til yderligere udforskning af patogenesen af TAAD og opdagelse af terapeutiske mål.
Introduction
Thorax aortaaneurisme og dissektion (TAAD) er en lokaliseret dilatation eller delaminering af aortavæggen, der er forbundet med høj sygelighed og dødelighed1. Humane aorta glatte muskelceller (HASMC'er) spiller en afgørende rolle i patogenesen af TAAD. HASMC'er er ikke terminalt differentierede celler, og HASMC'er bevarer høj plasticitet, så de kan skifte fænotyper som reaktion på forskellige stimuli2. HASMC'er udsættes hovedsageligt for rytmisk trækbelastning in vivo, og dette er en af nøglefaktorerne, der regulerer glatte muskelmorfologiske ændringer, differentiering og fysiologiske funktioner 3,4. Derfor kan cyklisk belastnings rolle i undersøgelsen af HASMC'er ikke ignoreres. Imidlertid kan konventionelle 2D-cellekulturer ikke replikere den biomekaniske stimulering af cyklisk stamme, som HASMC'er oplever in vivo. Derudover er konstruktionen af en TAAD-model til dyr ikke egnet til nogle typer TAAD, såsom bicuspid aortaklap (BAV) -relateret TAAD. Desuden kan artskløften mellem kliniske humane undersøgelser og dyreforsøg ikke ignoreres. Det hindrer farmaceutisk oversættelse i klinisk praksis. Der er således et presserende behov for mere komplekse og fysiologiske systemer til at simulere det in vivo biomekaniske miljø i forskningen af aortasygdomme.
Dyreforsøg, der anvendes i biomedicinsk forskning og lægemiddeludvikling, er dyre, tidskrævende og etisk tvivlsomme. Desuden kan resultaterne fra dyreforsøg ofte ikke forudsige de resultater, der er opnået i kliniske forsøg på mennesker 5,6. Manglen på humane prækliniske modeller og høj fejlrate i kliniske forsøg har resulteret i få effektive lægemidler til klinikken, hvilket har øget sundhedsomkostningerne7. Det haster derfor med at finde andre eksperimentelle modeller til at supplere dyremodeller. Mikrofabrikation og mikrofluidiske teknikker har udviklet sig meget i de senere år og giver nye teknikker til etablering af organoider-on-a-chip-modeller, der afhjælper ulemperne ved traditionelle 2D-cellekulturteknikker og etablerer en mere realistisk, billig og effektiv in vitro-model til fysiologiske undersøgelser og lægemiddeludvikling. Ved hjælp af mikrofluidiske enheder etableres organer-på-chips til dyrkning af levende celler i kamre på størrelse med mikrometer med forskellige stimuli for at replikere nøglefunktionerne i et væv eller organ. Systemet består af enkelte eller flere mikrofluidiske mikrokanaler, hvor enten en slags celle dyrkes i et perfunderet kammer, der replikerer funktioner af en vævstype eller forskellige celletyper dyrket på porøse membraner for at genskabe grænseflader mellem forskellige væv. Mikrofluidbaserede organoider kombineret med patientafledte celler har den unikke fordel at bygge bro over den store artsforskel mellem muse- og humane sygdomsmodeller og overvinde ulemperne ved traditionel 2D-cellekultur til sygdomsmekanismeforskning og lægemiddelopdagelse. Med den hurtige udvikling af mikrofluidik i de sidste par år har forskere indset nytten af in vitro organ-on-a-chip (OOC) modeller, der replikerer komplekse in vivo biologiske parametre8. Disse mikrofluidiske organoider simulerer in vitro biomekaniske miljøer, såsom cyklisk belastning, forskydningsspænding og væsketryk, hvilket giver et tredimensionelt (3D) cellekulturmiljø. Til dato er flere OOC-modeller blevet etableret for at simulere biomekaniske stimuli i organer som lunge9, nyre 10, lever11, tarm 12 og hjerte 13, men disse er ikke blevet anvendt bredt til undersøgelse af human aortasygdom.
I denne undersøgelse præsenterer vi en human aorta glat muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) model, der kan kontrollere de biomimetiske mekaniske kræfter og rytmer, der anvendes på TAAD-patientafledte primære HASMC'er. Chippen består af trelags tykke plader af polydimethylsiloxan (PDMS) ætset med kanaler og to kommercialiserede meget fleksible PDMS-membraner. HASMC'er dyrkes på PDMS-membranerne. Kanalen i midten af chippen er fyldt med et kulturmedium til cellekultur. Chippens øverste og nederste kanaler er forbundet til et vakuumtrykforsyningssystem, der kan styre rytmen og frekvensen af mekanisk trækbelastning af PDMS-membranerne. Rytmisk stamme, der opleves af HASMC'er, kan simuleres i HASMC-OOC og replikere det biomekaniske mikromiljø af væv eller organ, der ikke er funktionelt opnåeligt med konventionelle 2D-kultursystemer. Med fordelen ved højopløsning, realtidsbilleddannelse og biomekanisk mikromiljø kan levende cellers biokemiske, genetiske og metaboliske aktiviteter studeres for vævsudvikling, organfysiologi, sygdomsætiologi, molekylære mekanismer og biomarkøridentifikation, hjerte-kar-sygdomme og aortasygdom. Kombineret med vævsspecifikke og patientceller kan dette system bruges til lægemiddelscreening, personlig medicin og toksicitetstest. Denne HASMC-OOC-model giver en ny in vitro-platform til undersøgelse af patogenesen af aortasygdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane aortaprøver blev brugt til primær HASMC-isolering under godkendelse af Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortaprøver blev indsamlet fra patienter, der gennemgik stigende aorta-kirurgi på Zhongshan Hospital, Fudan University. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter før deltagelse.
1. Primær human aorta glat muskelcelleisolering
- Vask den højre laterale region af den stigende aorta med steril PBS, 1x-2x.
- Fjern intima- og adventitialagene i vævet med to oftalmiske tang og behold medielaget for at høste cellerne.
- Læg medielaget på et 10 cm kulturfad og skær det i små stykker (2-3 mm) med en saks. Tilsæt 5 ml glat muskelcellekulturmedium (SMCM) indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Flyt det lille væv ind i kulturflasken med en steril dråber, og spred vævet jævnt. Kassér kulturmediet så meget som muligt, og vend derefter flasken på hovedet.
- Tilsæt 2 ml SMCM i den omvendte kulturflaske og læg den i inkubatoren (5% CO 2) ved 37 °C i 1-2 timer, drej den langsomt med højre side opad og tilsæt yderligere2 ml SMCM.
- Efter 5-7 dages inkubation udveksles SMCM med 4 ml frisk SMCM. Generelt klatrer sporadiske glatte muskelceller ud på cirka 2 uger.
- Kassér langsomt SMCM'en, og tilføj den langsomt, når du skifter medie. Transporter kulturflasken langsomt, når du flytter til en mikroskopstation; Ellers vil vævene flyde, og cellerne vil vokse langsomt.
- Når cellerne når ca. 80% sammenløb, vaskes med 2 ml PBS, fordøjes med 2 ml 0,25% trypsin og opdeles i to nye kulturflasker med 4 ml frisk SMCM.
- Identificer cellerne gennem en immunfluorescensanalyse af fire forskellige specifikke markører for glatte muskelceller (CNN1, SM22)14.
2. Forberedelse af PDMS-chip
- For at polymerisere PDMS tilsættes hærdningsmiddel (B-komponent) til base (A-komponent) ved et vægtforhold på A: B = 10: 1 w / w / w og blandes komplekset fuldstændigt i 5 minutter; Volumenet afhænger af undersøgelsens behov.
- Anbring den forberedte PDMS-gel i en vakuumudsugningstank i 30-60 minutter, og hold trykket under -0,8 mPa.
BEMÆRK: Højt tryk vil føre til utilstrækkelig ekstraktion af små bobler inde i PDMS-gelen, der vil påvirke det næste trin i chipfremstilling. - Brug computerstøttet design (CAD) software til at designe formen med en 100 mm × 40 mm × 8 mm ekstern rammestruktur og en 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal.
- Specialfremstiller formene i de tre lag ved hjælp af en højpræcisionscomputer numerisk kontrolgraveringsmaskine. Skær rammen af formene og mikrokanalerne ud ved hjælp af polymethylmethacrylat (PMMA) plader, og lim dem derefter på en anden PMMA-plade.
- Hæld den tilberedte PDMS-gel på en form med en 100 mm × 40 mm × 6 mm ydre ramme og 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal, og tværbinding ved 70 °C i 1-2 timer.
- Skræl de tværbundne PDMS-plader af formen, og skær de kommercialiserede PDMS-membraner i sektioner på 100 mm × 40 mm.
- Behandl de tre forberedte PDMS-plader og to PDMS-membraner med iltplasma i 5 minutter til PDMS-overfladeaktivering. Anvend følgende specifikke indstillinger: rumluft som procesgas; tryk indstillet til -100 kPa; nuværende sat til 180--200 Ma; spænding indstillet til 200 V; procestid til 5 min.
- Stans huller på de tre PDMS-plader ved hjælp af en 1 mm hulstanser til at lave indløb og udløb af luft og mellemstore mikrokanaler på PDMS-chippen.
- Bond tre PDMS-plader og to PDMS-membraner sammen i rækkefølgen: luftkanal PDMS-plade (øverste lag) - PDMS-membran - mellemkanal PDMS-plade (mellemlag) - PDMS-membran- luftkanal PDMS-plade (bundlag). Udfør dette trin under et stereoskopisk mikroskop ved 4x for fuldt ud at overlappe luftmikrokanalerne med de mellemstore mikrokanaler.
- Anbring den samlede PDMS-chip i en 70 °C inkubator i 1 time.
- Forbered flere 1 mm indvendige diameter og 3 cm længde latexslanger. Indsæt en 1 mm ydre diameter og 1 cm lang nål i rustfrit stål i den ene ende af den forberedte slange, og indsæt derefter en Luer i den anden ende af slangen for at skabe røret, der er forbundet med PDMS-chippens luft og mellemstore mikrokanaler.
- Indsæt de forberedte rør i udløb og indløb af luften og mellemstore mikrokanaler på PDMS-chippen.
3. PDMS-chip overfladebehandling og sterilisering
- Tilsæt 2 ml 80 mg / ml musekollagen i PDMS-chippens mellemstore mikrokanal ved hjælp af en 2 ml sprøjte og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Efter inkubation skal du fjerne kollagenet fra kanalen og huske med en 2 ml sprøjte. Placer de kollagenbelagte PDMS-chips i en 60 °C inkubator natten over.
- Anbring PDMS-chipsene i en UV-sterilisator i mere end 1 time. Placer de steriliserede PDMS-chips på en ultraren bænk som forberedelse til celleeksperimentet.
4. Cellesåning på PDMS-chippen og cellestrækningsprocessen
- Dyrkning 4 x 10 5 primære humane glatte muskelceller (HASMC'er) fra patienter, der bruger glat muskelcellemedium (SMCM) indeholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin i en5 % CO2 -inkubator ved 37 ° C.
- Når HASMC-tætheden når 80%, kasseres SMCM og vaskes cellerne med 2 ml PBS.
- Fordøje cellerne ved hjælp af 1 ml 0,25% trypsin i 2 minutter og centrifuge ved 100 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og suspender cellepelleten i 1 ml frisk SMCM. Brug 8 ml SMCM til at dyrke cellerne på en 10 cm kulturskål.
- Celletallet beregnes ved hjælp af et cytometer, og cellerne anvendes i en slutkoncentration på 2 x 105 celler/ml.
- Hæld langsomt 2 ml PBS i den kollagenbelagte og steriliserede PDMS-chipmediummikrokanal og kassér senere ved hjælp af en 2 ml sprøjte.
- Hæld langsomt i alt 2 ml 2 x 105 celler / ml HASMC-suspension i PDMS-chippens mellemstore mikrokanal ved hjælp af en 2 ml sprøjte. Luk derefter Luer ved indgangen og udgangen af PDMS-chippen. PDMS-chippen anbringes i en inkubator (5 % CO2) ved 37 °C i 1 dag.
- Når cellerne er fastgjort til PDMS-membranen i PDMS-chippen, næsten efter 24 timer, skal du forbinde luftmikrokanalens udløb på PDMS-chippen til vakuumstyringssystemet. Når cellen er fastgjort, kan en langstrakt, normal cellulær form ses under mikroskopet, i modsætning til de suspenderede runde celler.
- Tænd magnetventilen og vakuumpumpen. Åbn vakuumregulatoren, og juster trykniveauet til 10 kPa for 7,18 ± 0,44% belastning og 15 kPa for 17,28 ± 0,91% belastning.
- Når parametrene for styresystemet er indstillet, anbringes PDMS-chipsene i en inkubator (5% CO2) ved 37 °C og strækkes i 24 timer.
5. Forberedelse af det mekaniske styresystem
- Forbered flere magnetventiler, vakuumfiltre, vakuumregulatorer, en vakuumpumpe, en peristaltisk pumpe og en programmerbar logisk regulator (PLC), der styrer magnetventilen.
- Programmer PLC-controlleren, og indstil tænd/sluk-tidsintervallet til 1 Hz. Tilslut magnetventilerne til den programmerede controller.
- Tilslut vakuumpumpens indløb til vakuumfiltrene, og tilslut derefter vakuumfiltrenes udløb til vakuumregulatorerne. Tilslut vakuumregulatorernes udløb til magnetventiler, og tilslut til sidst udløbet af magnetventilerne til udløbene på PDMS-chipsens luftmikrokanaler.
- Tilslut udløbet af den peristaltiske pumpe til indløbet af PDMS-chippens mellemstore mikrokanal og indløbet af den peristaltiske pumpe til udløbet af den mellemstore mikrokanal PDMS-chip til udskiftning af kulturmedium og lægemiddelhåndtering.
- Juster amplituden af belastningen af regulatoren og belastningsfrekvensen af mikrocontrolleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HASMC-OOC-modellen består af et vakuumstyringssystem, et cirkulationssystem og PDMS-chips og det skematiske design af HASMC-OOC-modellen (figur 1). Vakuumstyringssystemet består af en vakuumpumpe, magnetventiler og en PLC-regulator. For at fungere som cirkulationssystem blev en peristaltisk pumpe brugt til at opdatere cellekulturmediet og tilføje lægemidler. PDMS-chippen bestod af to vakuumkamre og et mellemkammer fyldt med SMCM til cellevækst. I henhold til designet af spånstrukturen blev PMMA-formen forberedt, og de tre PDMS-plader blev fremstillet ved at hælde i forme og tværbinding ved 70 ° C i 2 timer. Efter behandling med plasma blev de tre PDMS-plader og to PDMS-membraner bundet sammen (figur 2). Da PDMS-chipsene blev forberedt, blev HASMC'erne dyrket på PDMS-membranen i chippen, og PDMS-chipsene blev forbundet til vakuumstyringssystemet og cirkulationssystemet. En skematisk oversigt over hele systemet er vist i supplerende figur 1. PDMS-chipparametrene er vist i figur 3A, og PDMS-membranens mekaniske egenskaber er vist i figur 3B. For at kvantificere trækstammerne i PDMS-membranen fangede vi realtidsdeformationerne af PDMS-membranerne fra et tværsnitsbillede af den mikrofluidiske model med vakuumtryk på 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa og 30 kPa. Vi målte også ændringerne i længden for at evaluere PDMS-membranens belastningsstørrelse i forskellige dyrkningskanalbredder på 2 mm, 4 mm og 6 mm (figur 3C-E). Mikrokanaler 6 mm i bredden blev brugt i PDMS-chippen. Resultaterne viste, at et vakuumtryk på 10 kPa inducerede 7,18 ± 0,44% stamme og 15 kPa induceret 17,28 ± 0,91% stamme (figur 3E).
For at verificere cellelevedygtigheden af HASMC-cellelinjen (CRL1999) i PDMS-chippen blev der udført et LIVE / DEAD-assay på dag 3 og 5, efter at cellerne blev dyrket. Resultaterne viste, at cellelevedygtigheden var højere end 90% på dag 3 og dag 5 (figur 4A). Cytoskelet (F-actin) farvning af CRL1999 i PDMS-chippen viste normal cellemorfologi og celler justeret vinkelret på stammen efter at have strakt sig i 24 timer (figur 4B-C). Immunofluorescensfarvning af de kontraktile markører SM22 og CNN1 blev udført under anvendelse af HASMC-OOC efter 24 timers rytmisk belastning (figur 4D-E). Til at begynde med blev 2 ml PBS langsomt hældt i kanalen og kasseret med en 2 ml sprøjte. Derefter blev 2 ml 4% (v / v) paraformaldehyd hældt i kanalen og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Herefter blev 2 ml 0,2% (v/v) Triton X-100 hældt i kanalen af en 2 ml sprøjte og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Dette blev efterfulgt af 2 ml PBS, der langsomt hældes i kanalen og kasseres af en 2 ml sprøjte efter vask af cellerne. Derefter blev 2 ml 5% (w/v) bovin serumalbumin langsomt hældt i kanalen og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev 1 ml SM22- eller CNN1-antistof langsomt hældt i kanalen og inkuberet natten over ved 4 ° C. Efter inkubation blev 1 ml ged anti-kanin sekundært antistof langsomt hældt i kanalen og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev 1 ml DAPI-opløsning langsomt hældt i kanalen og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Resultaterne viste, at fluorescensintensiteten af SM22 og CNN1 under belastningsforhold var højere end under statiske forhold (figur 4F). Sammenlignet med statiske tilstande blev SM22- og CNN1-generne i HASMC'er opreguleret under belastningsforhold (figur 4G). Disse data antydede, at CRL1999 var vinkelret på stammeretningen, og at en kontraktil fænotype var mere udtalt under belastningsforhold end under konventionel celledyrkning under statiske forhold.
Ved hjælp af bicuspid aortaklap-relaterede TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklap-relaterede TAAD (TAV-TAAD) patientafledte primære HASMC'er etablerede vi BAV-TAAD og TAV-TAAD sygdomsmodeller. Resultaterne af F-actinfarvning af BAV-TAAD og TAV-TAAD patientafledte primære HASMC'er viste normal cellemorfologi og celler justeret vinkelret på belastningsretningen efter strækning i 24 timer (figur 5A-B). Immunofluorescensfarvning viste, at SM22- og CNN1-ekspression i BAV-TAAD og TAV-TAAD patientafledte primære HASMC'er var højere under belastningsbetingelser end under statiske forhold (figur 5C-G,I). Genekspressionsniveauerne for SM22 og CNN1 i BAV-TAAD og TAV-TAAD patientafledte primære HASMC'er blev opreguleret under belastningsbetingelser i modsætning til statiske tilstande (figur 5H, J). Disse resultater i BAV-TAAD og TAV-TAAD patientafledte primære HASMC'er i PDMS-chippen var i overensstemmelse med resultaterne fra HASMC-cellelinjen CRL1999, hvilket indikerer, at kombinationen af patientafledte primære HASMC'er og HASMC-OOC-modellen replikerer HASMC-egenskaber i TAAD, som giver en BAV-TAAD og TAV-TAAD in vitro sygdomsmodel til yderligere undersøgelse af sygdommens molekylære mekanismer og lægemiddelscreening.
Figur 1: Skematisk design af HASMC-OOC-systemet. Systemet består af et vakuumstyringssystem, et cirkulationssystem og PDMS-chips. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: PDMS-chipforberedelsesprocedure. PDMS-gelen blev hældt i en PMMA-form og tværbundet ved 70 °C i 1-2 timer. Derefter blev de tre PDMS-plader og to PDMS-membraner behandlet med plasma i 5 minutter og bundet sammen. Endelig blev de tilberedte PDMS-chips steriliseret, og en koncentration på 2 x 105 celler / ml HASMC-suspension blev langsomt hældt i PDMS-chippens mellemstore mikrokanal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: PDMS-chippens detaljerede parametre og mekaniske egenskaber. (A) De detaljerede parametre for PDMS-chippen. PDMS-pladestørrelsen var 100 mm × 40 mm × 6 mm, og mikrokanalstørrelsen var 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Parametrene for den kommercielle PDMS-membran. Den beregnede strækningsamplitude af PDMS-membranen ved forskellige vakuumtryk for mikrokanalbredder på 2 mm (C), 4 mm (D) og 6 mm (E). Dataene viser middelværdi ± standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cellemorfologi, orientering og fænotypeændring af HASMC'er under cykliske belastningsforhold. (A) Repræsentativt billede af LIVE/DEAD-analysen på dag 3 og dag 5 efter HASMC-cellelinje (CRL1999), der dyrkes på en PDMS-chip. (B) F-actin farvning af CRL1999 under statiske og belastningsforhold. (C) Celleorienteringen af CRL1999 under statiske og belastningsforhold. Repræsentativt billede af immunfluorescensfarvningen af SM22 (D) og CNN1 (E) i CRL1999 under statiske og belastningsforhold. (F) Den relative intensitet af immunfluorescensfarvning af SM22 og CNN1. (G) SM22 - og CNN1 mRNA-ekspression i CRL1999 under statiske og belastningsforhold. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tosidede Studerendes t-tests blev brugt til at sammenligne de to grupper. Dataene viser middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Cellemorfologi og fænotypiske ændringer i BAV-TAAD og TAV-TAAD patientafledt HASMC-OOC. Repræsentativt billede af F-actinfarvning af BAV-TAAD (A)-afledte primære HASMC'er og TAV-TAAD (B)-afledte primære HASMC'er under statiske og belastningsforhold. SM22 immunfluorescensfarvning i BAV-TAAD (C)-afledte primære HASMC'er og TAV-TAAD (D)-afledte primære HASMC'er under statiske og belastningsforhold. Repræsentativt billede af immunfluorescensfarvningen af CNN1 i BAV-TAAD (E)-afledte primære HASMC'er og TAV-TAAD (F)-afledte primære HASMC'er under statiske og belastningsforhold. (G) Den relative intensitet af SM22- og CNN1-immunfluorescensfarvning i BAV-TAAD-afledte primære HASMC'er. (H) SM22 - og CNN1 mRNA-ekspression i BAV-TAAD-afledte primære HASMC'er under statiske og belastningsforhold. (I) Den relative intensitet af SM22- og CNN1-immunfluorescensfarvning i TAV-TAAD-afledte primære HASMC'er. (J) SM22 - og CNN1 mRNA-ekspression i TAV-TAAD-afledte primære HASMC'er under statiske og belastningsforhold. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tosidede Studerendes t-tests blev brugt til at sammenligne de to grupper. Dataene viser middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Skematisk instruktion af udstyrsforberedelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den hurtige udvikling af mikrofluidisk teknologi er OOC-modeller, der kan replikere den biologiske funktion og struktur af et eller flere organer in vitro, opstået i de senere år til applikationer inden for biologi, medicin og farmakologi15. OOC kan simulere nøglefunktioner i det menneskelige fysiologiske mikromiljø, der er afgørende for at udforske sygdomsmekanismer og fremme præklinisk lægemiddeloversættelse 8,16. Selvom OOC stadig er i de tidlige stadier, og der er behov for mere input for at optimere designet af OOC, er der gjort store fremskridt i de senere år17,18. I modsætning til andre tredimensionelle cellekulturmodeller kan OOC efterligne de biomekaniske parametre i menneskekroppen, der er afgørende for vævsudvikling og vedligeholdelse af organfunktion. Organer og væv i det kardiovaskulære system udsættes konstant for væskestrømningsinduceret forskydning og cyklisk spænding in vivo. Derfor skal in vitro-cellulære eksperimenter af det kardiovaskulære system udføres i en eksperimentel platform, der tilvejebringer sådanne biomekaniske parametre for at opnå realistiske eksperimentelle resultater, der kan sammenlignes med dem, der opnås ved in vivo-undersøgelser.
I denne undersøgelse etablerede vi en HASMC-OOC, der præcist kan kontrollere parametrene for den biomekaniske stamme, som HASMC'er udsættes for. Det er muligt at kontrollere væskehastigheden og væskeforskydningen, som cellerne udsættes for, samt præcist at kontrollere amplituden, frekvensen og rytmen af forskellige mønstre af cyklisk belastning. Af de mange materialer, der er blevet brugt inden for OOC, er PDMS et af de mest anvendte 19,20,21. PDMS er gennemsigtig, fleksibel, biokompatibel og åndbar, og disse egenskaber bidrager til dens brede anvendelse inden for mikrofluidiske chips19. Påførte trykændringer kan deformere PDMS for at opnå den mekaniske kraft af sammentrækning og afslapning, og permeabiliteten af PDMS sikrer, at cellekulturmiljøet på chippen kan være i overensstemmelse med inkubationsbetingelserne på 5% CO2 ved 37 ° C i inkubatoren. Derfor giver PDMS ikke kun kontrolleret mekanisk kraft til cellerne, men giver også et kulturmiljø, der er egnet til normal cellevækst. Vores eksperimentelle resultater viser, at morfologien og aktiviteten af celler dyrket i PDMS-chippen er i overensstemmelse med 2D-kulturbetingelserne, hvilket indikerer, at PDMS er biokompatibel.
Under biomimetiske in vivo fysiologiske forhold udsættes HASMC'er i aortavæggen for den cykliske belastning på ca. 9%22. Under patologiske tilstande, såsom hypertension, aortadilatation og aortaaneurisme, udsættes HASMC'er for cyklisk stamme større end 16%23. Vi karakteriserede PDMS-chippens trækegenskaber, og de eksperimentelle resultater viser, at et vakuumtryk på 10 kPa inducerede 7,18 ± 0,44% stamme og 15 kPa induceret 17,28 ± 0,91% belastning. Derudover kan hyppigheden af belastningen og væskeforskydningsspændingen styres af dette PDMS-chipsystem. Ved hjælp af BAV-TAAD og TAV-TAAD patientafledte primære HASMC'er kan molekylære mekanismer og lægemiddelscreening af disse aortasygdomme udføres ved hjælp af denne HASMC-OOC in vitro-model , som kan replikere sygdomspatogenesen af forskellige aortasygdomme. Ved hjælp af dette system har vi etableret en sygdomsmodel til at studere patogenesen af BAV-TAAD og afslørede, at mitokondriel fusionsaktivator delvist kunne redde mitokondriedysfunktionen i syge celler24.
HASMC-OOC blev designet baseret på inspiration og reference fra lung-on-a-chip fra Ingbers arbejde9. Deres enhed replikerede fysiologiske vejrtrækningsbevægelser af alveolerne i lungen, og chippen bestod af tre lag: øvre og nedre mellemkanaler, en porøs PDMS-membran og to sidevakuumkamre. Sidevakuumkamre kan kun fremstilles i specialiserede laboratorier med avanceret mikrofluidisk udstyr. For at muliggøre samling under mere generelle laboratorieforhold placerede vi vakuumkamrene på toppen og bunden af chippen. Begge strækmetoder har lignende funktioner, så chipstrukturen kan vælges i henhold til laboratorieforholdene og forskningsbehovene, så den vælges. For strukturelt at etablere den rørformede struktur af den menneskelige aorta og opnå flere biologiske prøver fra cellerne til udførelse af yderligere kompleks biologisk analyse og eksperimentelle assays etablerede vi desuden en fem-lags PDMS-chip med større kanaler, som bestod af en mellemmellemkanal, to PDMS-membraner og top- og bundvakuumkamre. To PDMS-membraner og de store kanaler i PDMS-chippen øgede cellekulturområdet op til 8,4 cm2, hvilket gav nok prøver til proteinanalyse. De tidligere rapporterede platforme fokuserede hovedsageligt på at undersøge mindre arteriesygdomme, såsom en hjernearterie, perifert kar eller andre arterielle sygdomme25,26. Aorta er et stort fartøj med en diameter på 25-35 mm, og aortaens tunikamedier består hovedsageligt af glatte muskelceller udsat for høj trækstamme. Aortopatiens patologi er forbundet med ombygning af aortavæggen, glat muskelcelleapoptose og fænotypisk skift, som alle kan reguleres af mekanisk belastning. Således er patientafledte HASMC'er og trækbelastning væsentlige komponenter for succesen med HASMC-OOC. Der er dog nogle begrænsninger for denne undersøgelse. HASMC-OOC anvendte ikke kokulturerede vaskulære celler, herunder HASMC'er, aortaendotelceller og fibroblaster, som bedre kan simulere in vivo-mikromiljøet i den humane aorta og kan bruges til at studere interaktionen mellem disse celler. Selvom HASMC'er oplever rytmisk belastning, dyrkes cellerne stadig på en flad PDMS-membran, der ikke efterligner den ekstracellulære matrix. I fremtidige undersøgelser vil vi overvinde disse begrænsninger ved at kombinere mikrofluidiske chips med 3D-bioprintteknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender, at dette arbejde blev støttet af tilskud fra Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) og Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
