Summary
لقد أحدثت الخزعة السائلة ثورة في نهجنا في الدراسات الانتقالية لعلم الأورام ، حيث يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة لتطبيقها السريري الناجح. هنا نصف بروتوكولا موحدا ومعتمدا لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية والتي يمكن تطبيقها في معظم مختبرات الأبحاث الانتقالية.
Abstract
يشير مصطلح الخزعة السائلة (LB) إلى جزيئات مثل البروتينات أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي و / أو النقيلي. برز LB كدعامة أساسية في البحوث الانتقالية وبدأ يصبح جزءا من ممارسة الأورام السريرية ، مما يوفر بديلا طفيف التوغل للخزعة الصلبة. يسمح LB بمراقبة الورم في الوقت الفعلي عن طريق استخراج عينة طفيفة التوغل ، مثل الدم. وتشمل التطبيقات الكشف المبكر عن السرطان، ومتابعة المرضى للكشف عن تطور المرض، وتقييم الحد الأدنى من الأمراض المتبقية، والتحديد المحتمل للتطور الجزيئي وآلية المقاومة. من أجل تحقيق تحليل موثوق به لهذه العينات التي يمكن الإبلاغ عنها في العيادة ، يجب النظر بعناية في إجراءات ما قبل التحليل واتباعها بدقة. يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة تحدد فائدتها في التطبيقات النهائية. هنا ، نقدم بروتوكولات موحدة من وحدة عمل الخزعة السائلة الخاصة بنا لجمع ومعالجة وتخزين عينات البلازما والمصل لتحليل الخزعة السائلة في المصب بناء على الحمض النووي الخالي من التداول. تتطلب البروتوكولات المعروضة هنا معدات قياسية ومرنة بما يكفي لتطبيقها في معظم المختبرات التي تركز على الإجراءات البيولوجية.
Introduction
تم تعريف مصطلح "الخزعة السائلة" في عام 20101 على أنه وجود جزيئات (مثل البروتين أو الحمض النووي الريبي النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)) أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية (على سبيل المثال ، الإكسوسومات) في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي. أحدث استخدام عينات الخزعة السائلة ثورة في أبحاث الأورام الانتقالية حيث أن خزعات الأنسجة ، التي تقتصر على منطقة معينة في لحظة معينة ، قد تفوت النسخ المستنسخة ذات الصلة بسبب عدم تجانس الورم. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الخزعة السائلة دورا ذا صلة في أنواع الأورام حيث تكون الأنسجة الأولية نادرة أو لا يمكن الوصول إليها ، لأنها قد تتجنب الخزعة الغازية ، مما يقلل من التكاليف والمخاطر على المرضى. علاوة على ذلك ، تتطور الخصائص الجزيئية للورم باستمرار ويرجع ذلك أساسا إلى ضغط العلاج ، ويمكن لعينات الخزعة السائلة التقاط الديناميكيات النسيلية للورم حيث يمكن أخذها طوليا ، في أوقات سريرية وعلاجية مختلفة من المرض مثل خط الأساس ، على العلاج ، أفضل استجابة ، وعند تطور المرض أو حتى قبل ذلك. مفهوم "الخزعة السائلة في الوقت الحقيقي" يعني أنه يمكن مراقبة التغيرات الديناميكية في الورم في الوقت الفعلي ، مما يسمح بالطب الدقيق في هذا المرض. الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في العيادة ، بما في ذلك الفحص والكشف المبكر عن السرطان ، والمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، والكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية ، ودراسة آليات مقاومة العلاج ، والتقسيم الطبقي للمرضى على المستوى العلاجي1. يعد الكشف المبكر عن تكرار المرض وتطوره حاجة سريرية غير ملباة في العديد من أنواع الأورام وهو عامل رئيسي في زيادة بقاء مرضى السرطان على قيد الحياة ونوعية حياتهم. قد تفتقر طرق التصوير الروتينية وعلامات الورم القابلة للذوبان إلى الحساسية و / أو الخصوصية المطلوبة لهذه المهمة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى علامات تنبؤية جديدة في العيادة ، مثل تلك القائمة على تعميم الأحماض النووية الحرة.
تشمل أنواع العينات المستخدمة في دراسات الخزعة السائلة على سبيل المثال لا الحصر عينات الدم والبول واللعاب والبراز. يمكن أن تكون العينات الأخرى الخاصة بالورم عبارة عن شفطات الخلايا والسائل الدماغي الشوكي والسائل الجنبي والكيس وسائل الاستسقاء والبلغم وعصير البنكرياس2. قد تحتوي السوائل السابقة على أنواع مختلفة من المواد المشتقة من السرطان ، أو الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) ، أو شظايا مثل الإكسوسومات والحمض النووي للورم المتداول الخالي من الخلايا (ctDNA). قد يتم تغليف الأحماض النووية في حويصلات خارج الخلية (EVs) أو إطلاقها في سوائل الجسم بسبب موت الخلايا وتلفها. يتم إطلاق الحمض النووي الحر المنتشر (cfDNA) بشكل رئيسي في مجرى الدم من الخلايا الماصة أو الميتة وهو موجود في جميع الأفراد ، مما يدل على زيادة المستويات في الأمراض الالتهابية أو الأورام3. Exosomes هي حويصلات صغيرة خارج الخلية (~ 30-150 نانومتر) تفرزها الخلايا التي تحتوي على الأحماض النووية والبروتينات والدهون. تشكل هذه الحويصلات جزءا من شبكة الاتصالات بين الخلايا وتوجد عادة في العديد من أنواع سوائل الجسم2. الأحماض النووية المغلقة داخل المركبات الكهربائية محمية من البيئة القاسية داخل سوائل الجسم، وبالتالي توفير طريقة أكثر قوة لدراسة هذه الجزيئات في إعداد الخزعة السائلة.
وعموما، فإن مستويات الأحماض النووية المتداولة في عينات الخزعة السائلة منخفضة جدا، وبالتالي هناك حاجة إلى طرق حساسة للكشف، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو تسلسل الجيل التالي (NGS). تعد الإدارة قبل التحليلية للعينة أمرا بالغ الأهمية لمنع تحلل خلايا الدم وإطلاق الحمض النووي السليم ، مما يتسبب في تلوث cfDNA بالحمض النووي الجينومي. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر عند استخراج العينات لتجنب وجود مثبطات لطرق التحليل القائمة على الإنزيم.
نقدم هنا طريقة موحدة لجمع وتخزين عينات البلازما والمصل ، وهي خطوة أولى حاسمة للتطبيقات النهائية القائمة على الخزعة السائلة ، بما في ذلك تحليلات الحمض النووي المتداولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقة أخلاقية مسبقة من المراكز المشاركة قبل استخراج عينات الدم. تم تنفيذ البروتوكولات التالية لعزل المصل والبلازما وفقا للمبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية الحيوية.
ملاحظة: يتم توفير الاعتبارات السابقة قبل بدء البروتوكول هنا. مطلوب موافقة أخلاقية مسبقة لاستخدام العينات البشرية في البحوث الطبية الحيوية ، مع الموافقة المستنيرة المقابلة. مطلوب خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية للتعامل مع عينات الدم. يجب ارتداء معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات طوال العملية لتجنب العدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالدم. مطلوب ما لا يقل عن 30 دقيقة لمعالجة عينات المصل. بعد استخراج الدم في أنابيب بدون مضادات التخثر ، حافظ على درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30-45 دقيقة للسماح بتكوين الجلطة. مطلوب ما لا يقل عن 40 دقيقة لإعداد البلازما ، ويجب معالجة العينات في غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج عند استخدام أنابيب حمض الإيثيلين ديامين رباعي حمض الخليك (EDTA) أو في غضون 24-48 ساعة إذا كنت تستخدم أنابيب تجميع تثبيت الخلايا أو أنابيب محددة لجمع الحمض النووي خالية من الخلايا. ومع ذلك ، وفقا لبعض الشركات المصنعة ، فإن العينات مستقرة لمدة تصل إلى 2 أسابيع في هذه الأنابيب المتخصصة. من المهم التحقق من انحلال الدم ، مما سيعطي البلازما أو جزء المصل مظهرا محمرا. راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على عينات انحلال في المناقشة.
1. إعداد المصل لدراسات الخزعة السائلة
ملاحظة: إجمالي الوقت المطلوب لتنفيذ هذه الخطوة هو 30 دقيقة (الشكل 1).
- استخراج 4-10 مل من الدم في أنابيب لا تحتوي على مضادات التخثر (غطاء أحمر أو أحمر / رمادي أسود) والحفاظ عليها في RT لمدة 30-45 دقيقة. معالجة هذه العينات في غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج.
- سجل وقت وتاريخ استخراج العينة وتحديد الموضوع (ID) في قاعدة بيانات عينة مصممة بشكل مناسب.
- ارتداء معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات، وجهاز الطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على دم جديد في RT (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق عند 1600 (± 150) × غرام، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر.
- بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ؛ ستظهر المرحلة العليا من supernatant المصل واضحة وصفراء (الشكل 2). تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم (الشكل 3) وسجل وجود انحلال الدم عند الاقتضاء.
- في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية ، انقل المصل إلى أنابيب التجميع على شكل 250 ميكرولتر أليكوتس.
ملاحظة: يجب تعديل حجم الأليكوتس وفقا لمتطلبات الدراسة. - قم بتجميد المصل على الفور في وضع مستقيم في صندوق تخزين عند -80 درجة مئوية وسجل وقت تخزين العينة.
- تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ 4 ساعات.
2. تحضير البلازما لدراسات الخزعة السائلة
ملاحظة: إجمالي الوقت المطلوب لتنفيذ هذه الخطوة هو 40 دقيقة (الشكل 4).
- استخراج 4-10 مل من الدم في أنابيب تحتوي على الإيثيلين ديامين رباعي حمض الخليك (EDTA). معالجة العيناتفي غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج.
- سجل وقت وتاريخ استخراج العينة ومعرف الموضوع في قاعدة بيانات نموذجية مصممة بشكل مناسب.
- يرتدي معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات ، جهاز الطرد المركزي لأنبوب EDTA في RT (15 درجة مئوية - 25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق عند 1600 (± 150) × g ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر.
ملاحظة: ارجع إلى إرشادات الشركة المصنعة عند استخدام أنابيب تجميع أخرى. - بعد الطرد المركزي ، سيظهر السوبرنات البلازما واضحا ومصفرا. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم (الشكل 3) ونقل البلازما (supernatant) إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل دون إزعاج الطبقة الخلوية باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها (أو ماصة لمبة يمكن التخلص منها أو ماصات p1000 مع طرف مرشح). اترك كمية صغيرة متبقية من البلازما فوق طبقة الخلية (حوالي 5 مم).
- إذا لوحظ انحلال الدم، تخلص من العينة لإجراء مزيد من التحليلات. (الشكل 5). راجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة لتقييم انحلال الدم.
- قم بطرد البلازما في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل في RT (15 درجة مئوية -25 درجة مئوية) لمدة 10-20 دقيقة عند 3000 (±150) × جم. قم بتنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي خلايا دم سليمة متبقية تم نقلها من خطوة الطرد المركزي الأولى.
- بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ونقل 1-4 مل من البلازما إلى 1-4 مل من قوارير البولي بروبيلين المبردة باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها (أو ماصة لمبة يمكن التخلص منها أو ماصات p1000 مع طرف مرشح). يجب ترك الحجم المتبقي من البلازما (حوالي 0.3 مل أو 7 مم) في الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب تلويث البلازما بخلايا الدم (الشكل 5).
- قم بتجميد البلازما على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند -80 درجة مئوية وسجل وقت تخزين العينة. تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ 4 ساعات.
- جمع الطبقة الخلوية (معطف بافي) باستخدام P1000 وطرف مصفى ونقلها إلى أنبوب 2 مل. تجمد على الفور وتخزينها في -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد الطرد المركزي لأنابيب الدم بدون مضادات التخثر ، تظهر المرحلة العليا باللون الأصفر الباهت وتتوافق مع جزء المصل (الشكل 2). تتم إزالة هذا الكسر بعناية واقتباسه للتحليل اللاحق.
قد يكون انحلال الدم موجودا إما في جزء البلازما أو المصل ، وسيكون للمرحلة العليا مظهر ضارب إلى الحمرة ، مما يشير إلى وجود ودرجة انحلال الدم (الشكل 3).
بعد الطرد المركزي لأنابيب EDTA ، ستكون عدة مراحل أو طبقات واضحة ؛ المرحلة العليا (الأصفر الشاحب) هي جزء البلازما ، الذي يمثل 55 ٪ من إجمالي حجم الدم ؛ الواجهة الرقيقة الرمادية البيضاء هي طبقة المعطف الرقيق التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية ، وتمثل <1٪ من إجمالي حجم الدم ؛ تحتوي المرحلة السفلى (اللون الأحمر) على خلايا دم حمراء ، والتي تمثل 45٪ من إجمالي حجم الدم). استنشاق 1 سم فوق طبقة الكريات البيض ، وتأكد من عدم إزعاج طبقة الخلية لتقليل تلوث البلازما بخلايا الدم (الشكل 5). يجب إزالة هذا الكسر بعناية واقتباسه للتحليل اللاحق.
يجب تقييم تركيز وسلامة cfDNA المستخرج من عينات البلازما باستخدام الطرق القائمة على الرحلان الكهربائي. تم استخراج cfDNA باستخدام مجموعة قائمة على الأعمدة متاحة تجاريا. تم إجراء القياس الكمي باستخدام مجموعة أدوات متاحة تجاريا قائمة على الهلام خاصة بتطبيقات cfDNA (جدول المواد). ويبين الشكل 6 ألف مثالا على استخراج cfDNA بجودة عالية يمكن استخدامه في التطبيقات النهائية. وحيث إن الشكل 6B يوضح مثالا على عينة غير مناسبة ذات مستوى عال من التلوث الجينومي.
الشكل 1: تحضير المصل لدراسات الخزعة السائلة. يتم عرض مخطط لعملية تحضير المصل ، من الطرد المركزي للعينة إلى تخزين الأليكوت. الخطوة 1: عينة دم في أنبوب بدون مضادات التخثر لعزل المصل. الخطوة 2: الطرد المركزي لأنبوب الدم للحصول على المصل في غضون 4 ساعات من الاستخراج. الخطوة 3: قم بإزالة المرحلة العليا من supernatant المصل للتخزين اللاحق. الخطوة 4: قم بتجميد أنبوب المصل في وضع مستقيم عند -80 درجة مئوية .
الشكل 2: عينات الدم التي تم جمعها في أنابيب بدون مضادات تخثر بعد الطرد المركزي. المرحلة العليا تتوافق مع جزء المصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مثال على عينة متحلل بعد الطرد المركزي. المرحلة العليا المقابلة لجزء البلازما / المصل تظهر حمراء بسبب انحلال الدم. من الناحية المثالية ، يجب التخلص من هذه العينات ، أو على الأقل يجب تسجيل وجود انحلال الدم في العينة ، لأن هذا قد يؤثر على بعض التطبيقات النهائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحضير البلازما لدراسات الخزعة السائلة. يتم عرض مخطط لعملية تحضير المصل ، من الطرد المركزي للعينات إلى تخزين aliquots وجمع معطف buffy. الخطوة 1: عينة دم في أنبوب يحتوي على حمض الإيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA) لعزل البلازما. الخطوة 2: الطرد المركزي لأنبوب الدم للحصول على البلازما في غضون 4 ساعات من الاستخراج. الخطوة 3: نقل البلازما الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل دون إزعاج الطبقة الخلوية. الخطوة 4: الطرد المركزي للبلازما لإزالة أي خلايا دم تم نقلها من خطوة الطرد المركزي الأولى. الخطوة 5: انقل البلازما إلى قوارير مبردة وقم بتجميد أنبوب البلازما في وضع مستقيم عند -80 درجة مئوية. الخطوة 6: جمع الطبقة الخلوية (معطف بافي) وتخزينها في -80 درجة مئوية.
الشكل 5: عينات الدم EDTA بعد الطرد المركزي. ثلاث طبقات مرئية مرئية بعد الطرد المركزي للأنابيب التي تحتوي على دم جديد. تتوافق المرحلة العليا مع جزء البلازما ، وتتوافق الواجهة الرمادية البيضاء الرقيقة مع المعطف البرتقالي وتحتوي على خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية ، وتحتوي المرحلة السفلية على خلايا الدم الحمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التحليل القائم على الرحلان الكهربائي ل cfDNA المعزول من البلازما . (أ) مثال على تجربة مثالية. (ب) مثال على تجربة دون المستوى الأمثل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في أوقات مختلفة أثناء إدارة السرطان. أولا ، عند التشخيص لتحديد العلامات الجزيئية للورم التي من شأنها أن تشير إلى وجود آفة ورم محتملة يمكن التحقيق فيها سريريا. ثانيا ، أثناء العلاج للمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، وتقييم الاستجابة الجزيئية للعلاج ، والتطور النسيلي ، والكشف المبكر عن انتكاسات المرض أو مقاومة العلاج. أخيرا ، بعد العلاج الجراحي ، كأداة للكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية. نشرت الجمعية الأوروبية لعلم الأورام الطبي (ESMO) مؤخرا مبادئ توجيهية لتنفيذ اختبار طفرة ctDNA في سرطان الرئة النقيلي ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) لتحديد الأهداف العلاجية القابلة للتنفيذ. وتشمل هذه المبادئ التوجيهية الاعتبارات المنهجية، والتقييم التقني والتحقق من صحة تنميط الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين، ومناقشة بعض التحديات مثل الفسيفساء الجسدية، وتردد الأليل المتغير المنخفض (VAF)، والكشف العرضي عن المتغيرات المسببة للأمراض الجرثومية4. تشير إرشادات الممارسة السريرية ESMO المنشورة مؤخرا لتشخيص المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي النقيلي وتدريجهم وعلاجهم إلى التحليل القائم على ctDNA في الحالات التي يكون فيها هناك تغيير في نهج العلاج أو إذا كان ذلك مطلوبا لدخول تجربة سريرية5.
يجب معالجة العينات في غضون 4 ساعات من وقت الاستخراج. يمكن أن تؤدي معالجة العينات خارج هذا الإطار الزمني إلى تدهور العينة وتؤدي إلى زيادة انحلال الدم ، مما قد يؤثر على تركيز cfDNA ويؤثر على التطبيقات النهائية مثل تنميط miRNA. يوصى باستخدام 2-4 مل من البلازما من أجل الحصول على حساسية كافية للتحليل النهائي. تحتوي التطبيقات القائمة على cfDNA على مادة حافظة تعمل على استقرار خلايا الدم النووية وتمنع إطلاق الحمض النووي الجيني الملوث (gDNA) ؛ الحمض النووي مستقر في هذه الأنابيب لمدة تصل إلى 14 يوما عند 6 درجات مئوية إلى 37 درجة مئوية بعد استخراج الدم. ومع ذلك ، يجب معالجة العينات في غضون 24-48 ساعة لتجنب التلوث بخلايا الدم البيضاء المحللة.
يجب استخدام Aliquots ذات الحجم الكافي لتجنب ذوبان الجليد لعينات المصل والبلازما. يعتمد حجم وعدد الأليكوتات على الاستخدام النهائي للعينات وكذلك سعة تخزين الفريزر -80 درجة مئوية. 1 مل aliquots مفيدة لأن هذا هو الحجم القياسي المستخدم للعديد من بروتوكولات استخراج cfDNA ويمكن إزالة الجليد من الأليكوتات المختلفة إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الحجم.
يمكن تقدير انحلال الدم للعينة عن طريق قياس الامتصاص عند طول موجي يبلغ 540 نانومتر من العينة المشتبه في انحلالها مقارنة بعينة غير انحلالية ذات مظهر مصفر واضح. يتم حساب انحلال الدم النسبي للعينة كنسبة امتصاص عند طول موجي يبلغ 540 نانومتر لعينة غير متحلل (ذات مظهر مصفر واضح) وللعينة الانحلالية (ذات المظهر المحمر). ينصح القراء بالرجوع إلى مقالة TylerVan Buren et al ، لمزيد من المعلومات6.
تعد سلامة العينة أمرا بالغ الأهمية في جميع تطبيقات الخزعة السائلة في المراحل النهائية ، والوقت من استخراج العينة إلى نوع أنبوب المعالجة وجمع العينات هما عاملان حاسمان يجب مراعاتهما لأنهما يؤثران على جودة وإنتاجية علامات ctDNA. كقاعدة عامة ، يجب جمع جميع العينات في أنبوب خاص ب cfDNA أو أنبوب EDTA ومعالجتها في غضون 48 ساعة و 4 ساعات من الاستخراج ، على التوالي. وبالتالي ، من المهم أن يكون هناك تنسيق جيد مع الموظفين والخدمات المشاركة في جمع العينات. من الناحية المثالية ، يجب إنشاء دائرة مفصلة لجمع العينات تحدد بوضوح مهام جميع الأشخاص المتورطين ، مع تعليمات مفصلة للتعامل مع العينات ونقلها. يفضل استخدام البلازما على المصل لتطبيقات cfDNA حيث يميل المصل إلى التلوث بالحمض النووي الجيني بسبب تحلل خلايا الدم البيضاء أثناء عملية التخثر7. من ناحية أخرى ، تحتوي البلازما بشكل عام على مثبطات PCR مثل الهيبارين والهيموجلوبين والهرمونات والغلوبولين المناعي G واللاكتوفيرين8. ومع ذلك ، يمكن أن يساعد تخفيف العينة في التغلب على هذه المشكلة ، شريطة أن تحتوي العينة على تركيز كاف من cfDNA. تشير دراسة حديثة إلى سير عمل ما قبل التحليل لتطبيقات الخزعة السائلة ، ومقارنة أنابيب التثبيت المختلفة وقياسات الكمية والجودة للأحماض النووية المعزولة من البلازما ، مما يدل على أهمية بروتوكول معالجة موحد للتحليل النهائي القابل للتكرار9. توصي إرشادات تحليل cfDNA التابعة للمعهد الوطني للسرطان (NCI) بمعالجة أنابيب EDTA في غضون 2-4 ساعات وتلك التي تحتوي على مادة حافظة خاصة في غضون 3 أيام10. يمكن أن تكون البنوك الحيوية مرفقا مفيدا للمحققين بدون المعدات اللازمة لمعالجة العينات وتخزينها. من الناحية المثالية ، لا ينبغي تجميد العينات أكثر من مرة وعدم تخزينها لأكثر من 3 سنوات قبل الاستخدام ؛ وبالتالي ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لحجم الأليكوتات للتطبيقات النهائية من أجل تجنب دورات التجميد والذوبان.
خطوة حاسمة أخرى في معالجة البلازما هي الطرد المركزي. الأول يحدد العزل الصحيح للبلازما من الخلايا أحادية النواة ، مصدر تلوث gDNA الذي يمكن أن يخفف بشكل كبير من الوفرة النسبية ل ctDNA. يهدف الطرد المركزي الثاني الذي يتم إجراؤه بسرعات أعلى إلى زيادة إزالة خلايا الدم البيضاء المحللة11. لا يبدو أن استخدام الفرامل بعد انتهاء الطرد المركزي له أي تأثير على جودة عينات البلازما12. هناك اعتبار مهم آخر عند معالجة عينات الدم وهو نوع دوار أجهزة الطرد المركزي المراد استخدامه ، إما دوار متأرجح أو ثابت. لمعالجة عينات الدم ، يوصى باستخدام دوار متأرجح. يسمح هذا التنسيق بفصل أفضل لمكونات الدم بناء على تدرجات الكثافة ، ويقع موقع حبيبة الخلية بعد الطرد المركزي في الجزء السفلي من أنبوب جهاز الطرد المركزي ، بينما ، مع جهاز طرد مركزي دوار ثابت ، تتشكل حبيبات الخلية على طول جانب الأنبوب. تسمح الدوارات الثابتة باستخدام المزيد من قوة الجاذبية وأكثر ملاءمة لفصل البروتينات والأحماض النووية ، على الرغم من أنها تسمح عادة بمعالجة المزيد من العينات في نفس الوقت.
العائد النهائي من cfDNA أمر بالغ الأهمية لحساسية التطبيق في المراحل النهائية. وفقا لذلك ، مع البيانات السابقة ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 3.6 نانوغرام (ng) من cfDNA لتحقيق حساسية <0.1٪ و 36 نانوغرام للحصول على حساسية <0.01٪ للكشف عن الأليلات الطافرة13. يجب مراعاة جودة ولكن أيضا كمية cfDNA عند اتخاذ قرار بشأن حجم العينة للجمع والاستخراج. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن متوسط / متوسط تركيز cfDNA المستخرج من 1 مل من البلازما هو 21 نانوغرام / مل في سرطان بطانة الرحم 14 ،14.3 (النطاق 7-204) نانوغرام / مل في سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين 15 ، 8.02 (± 7.81) نانوغرام / مل في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) 16 ، و 1.35 نانوغرام / مل في حالات سرطان البنكرياس17. يعتمد حجم البلازما المطلوب على تقنية المصب المستخدمة ولكن يوصى باستخدام 2-4 مل من أجل الوصول إلى حساسية كافية.
تعد إمكانية تتبع العينات جانبا مهما يجب مراعاته عند إنشاء مجموعات العينات. يجب وضع علامات على جميع العينات و aliquots بشكل صحيح وواضح ، مما يسمح بسهولة بتحديد الهوية لاحقا. كما يمكن استخدام البنوك الحيوية لأن لديها نظام معتمد لإدارة الجودة، يضمن جودة وأمن وتتبع البيانات والعينات البيولوجية المخزنة، مع الامتثال للتشريعات واللوائح المحلية والدولية المعمول بها. يجب تخزين البيانات المرتبطة بالعينات بشكل مثالي في قاعدة بيانات مناسبة لهذا الغرض ، مثل التقاط البيانات الإلكترونية للبحوث (REDCap) ، وهو تطبيق قائم على الويب طورته جامعة فاندربيلت لالتقاط البيانات للبحوث السريرية وإنشاء قواعد بيانات ومشاريع (https://www.project-redcap.org/). يوصى بشدة باستخدام خادم آمن مع تشفير البيانات.
تم مؤخرا استعراض التحديات المتعلقة بتنفيذ الخزعة السائلة في العيادة10 ، وكانت إحدى القضايا الرئيسية التي تم تسليط الضوء عليها هي توحيد ظروف ما قبل التحليل مثل جمع العينات ومعالجتها وتخزينها ، والتي تؤثر بشكل مباشر على التحقق التحليلي والسريري ، وكذلك تكرار النتائج. تهدف اتحادات الخزعة السائلة مثل CANCER-ID والجمعية الأوروبية للخزعة السائلة (ELBS) وأطلس تنميط الدم في السرطان (BloodPAC) إلى توحيد خطوات ما قبل التحليل وتحديد أفضل الممارسات لدراسات الخزعة السائلة في الإعداد السريري18,19.
الخزعة السائلة هي أداة مرنة ومفيدة للغاية مع إمكانات كبيرة في سياق تشخيص السرطان وعلاجه ومتابعته20. وتظهر مجموعة متزايدة من الأدلة أهميتها الواسعة، ومن أجل تنفيذها واستخدامها على نحو سليم فإن أهمية جمع العينات بطريقة موحدة أمر أساسي للحصول على بيانات قيمة وقابلة للمقارنة. إن العمل مع البروتوكولات الموحدة أمر بالغ الأهمية لتجنب العقبات التقنية في التحليلات اللاحقة ، والتي كانت قيدا حقيقيا في الماضي باستخدام عينات أرشيفية قديمة. هنا ، قدمنا بروتوكولات تم التحقق من صحتها يمكن أن تساعد في ضمان الإجراءات المسبقة التحليلية المثلى لدراسات الخزعة السائلة السريرية والبحثية القائمة على cfDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
بياتريس بيلوسيلو (BB): حصلت BB على جائزة أتعاب لمتحدثة أو استشارية أو دور استشاري من Amgen و Astra-Zeneca و Biocartis و Janssen و Merck-Serono و Novartis و Qiagen و Roche Diagnostics و Roche Pharma و ThermoFisher و Pfizer و BMS. سارة لوبيز-تارويلا (SL): حصلت SL على جائزة أتعاب لمتحدثة أو استشارية أو دور استشاري من Astra-Zeneca / Daiichi-Sankyo و MSD و Novartis و Pfizer و Roche Pharma و Gilead و Lilly و Pierre Fabre و Seagen و GlaxoSmithKline و Veracyte. نويليا تارازونا (NT): حصلت NT على أتعاب للمتحدث أو الاستشارات أو الدور الاستشاري من Amgen و Pfizer و Merck-Serono و Servier و SEOM و ESMO. خافيير هرنانديز-لوسا (JHL): حصل على جائزة أتعاب لمتحدث أو استشاري أو دور استشاري من Astra-Zeneca و Janssen و Novartis و Roche Diagnostics و Roche Pharma و ThermoFisher و Lilly و Diaceutics. أفاد رودريغو توليدو (RT) بتلقي منح بحثية تتعلق بهذه الدراسة من نوفارتيس ومنح بحثية لا علاقة لها بهذه الدراسة من AstraZeneca و Beigene. أما المؤلفون المتبقون فليس لديهم أي إفصاحات فيما يتعلق بالمخطوطة.
Acknowledgments
نود أن نشكر شبكة البحوث الطبية الحيوية في السرطان (CIBERONC) على دعمها ومنحة المشروع التالية: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC PLATFORM لتوحيد وتعزيز الخزعة السائلة. PI رودريغو توليدو ، (CIBERONC) ، 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
