Summary

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.

Abstract

Sıvı biyopsisi (LB) terimi, birincil ve / veya metastatik tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarındaki proteinler, DNA, RNA, hücreler veya hücre dışı veziküller gibi molekülleri ifade eder. LB, translasyonel araştırmalarda bir dayanak noktası olarak ortaya çıkmış ve solid biyopsiye minimal invaziv bir alternatif sunarak klinik onkoloji uygulamasının bir parçası haline gelmeye başlamıştır. LB, kan gibi minimal invaziv bir numune ekstraksiyonu yoluyla bir tümörün gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Uygulamalar arasında erken kanser tespiti, hastalık progresyonunun tespiti için hasta takibi, minimal rezidüel hastalığın değerlendirilmesi ve moleküler progresyon ve direnç mekanizmasının potansiyel olarak tanımlanması yer almaktadır. Klinikte rapor edilebilen bu örneklerin güvenilir bir analizini elde etmek için, preanalitik prosedürler dikkatlice düşünülmeli ve kesinlikle takip edilmelidir. Örnek toplama, kalite ve depolama, aşağı akış uygulamalarında kullanışlılıklarını belirleyen önemli adımlardır. Burada, dolaşımda olmayan DNA’ya dayalı aşağı akış sıvı biyopsi analizi için plazma ve serum örneklerinin toplanması, işlenmesi ve depolanması için sıvı biyopsi çalışma modülümüzden standartlaştırılmış protokoller sunuyoruz. Burada sunulan protokoller standart ekipman gerektirir ve biyolojik prosedürlere odaklanan çoğu laboratuvarda uygulanacak kadar esnektir.

Introduction

“Sıvı biyopsi” terimi 2010 yılında1 birincil tümörden kaynaklanan kan ve diğer vücut sıvılarında moleküllerin (örneğin, protein, deoksiribonükleik asit (DNA), ribonükleik asit (RNA)), hücrelerin veya hücre dışı veziküllerin (örneğin, eksozomlar) varlığı olarak tanımlanmıştır. Sıvı biyopsi örneklerinin kullanımı, translasyonel onkoloji araştırmalarında devrim yaratmıştır, çünkü belirli bir anda belirli bir bölgeyle sınırlı olan doku biyopsileri, tümör heterojenliği nedeniyle ilgili klonları kaçırabilir. Ek olarak, sıvı biyopsi, primer dokunun az olduğu veya erişilemediği tümör tiplerinde ilgili bir rol oynar, çünkü invaziv bir biyopsiden kaçınabilir, hastalar için maliyetleri ve riski azaltabilir. Ayrıca, tümörün moleküler özellikleri esas olarak tedavi baskısı nedeniyle sürekli olarak gelişmektedir ve sıvı biyopsi örnekleri, tümör klonal dinamiklerini, hastalığın başlangıç, tedavi, en iyi yanıt ve hatta daha önce olduğu gibi hastalığın farklı klinik ve terapötik zamanlarında uzunlamasına alınabildikleri için yakalayabilir. “Gerçek zamanlı sıvı biyopsisi” kavramı, tümördeki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı olarak izlenebileceği ve böylece bu hastalıkta hassas tıbba izin verilebileceği anlamına gelir. Sıvı biyopsi, kanserin taranması ve erken teşhisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi, minimal kalıntı hastalığın tespiti, tedavi direnci için mekanizmaların incelenmesi ve hastaların terapötik düzeydesınıflandırılması dahil olmak üzere klinikte çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. Hastalığın nüksünün ve progresyonunun erken saptanması birçok tümör tipinde karşılanmamış bir klinik ihtiyaçtır ve kanser hastalarının sağkalımını ve yaşam kalitesini arttırmada anahtar faktördür. Rutin görüntüleme yöntemleri ve çözünür tümör belirteçleri bu görev için gereken duyarlılık ve/veya özgüllükten yoksun olabilir. Bu nedenle, klinikte, dolaşımdaki serbest nükleik asitlere dayananlar gibi yeni prediktif belirteçlere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.

Sıvı biyopsi çalışmaları için kullanılan örnek türleri kan, idrar, tükürük ve dışkı örneklerini içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Diğer tümöre özgü örnekler hücre aspiratları, beyin omurilik sıvısı, plevral sıvı, kist ve asit sıvısı, balgam ve pankreas suyu2 olabilir. Eski sıvılar, farklı tipte kanserden türetilmiş materyaller, dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC) veya eksozomlar ve hücresiz dolaşımdaki tümör DNA’sı (ctDNA) gibi fragmanlar içerebilir. Nükleik asitler hücre dışı veziküllerde (EV’ler) kapsüllenebilir veya hücre ölümü ve hasarı nedeniyle vücut sıvılarına salınabilir. Dolaşımdaki serbest DNA (cfDNA) esas olarak apoptotik veya nekrotik hücrelerden kan dolaşımına salınır ve tüm bireylerde bulunur, enflamatuar veya onkolojik hastalıklarda artmış seviyeler gösterir3. Eksozomlar, nükleik asitler, proteinler ve lipitler içeren hücreler tarafından salgılanan küçük hücre dışı veziküllerdir (~ 30-150 nm). Bu veziküller hücreler arası iletişim ağının bir parçasını oluşturur ve birçok vücut sıvısı türünde yaygın olarak bulunur2. EV’lerin içindeki nükleik asitler, vücut sıvıları içindeki sert ortamdan korunur, böylece bu molekülleri sıvı biyopsi ortamında incelemek için daha sağlam bir yol sağlar.

Genel olarak, sıvı biyopsi örneklerinde dolaşımdaki nükleik asit seviyeleri çok düşüktür ve bu nedenle dijital PCR veya yeni nesil dizileme (NGS) gibi algılama için hassas yöntemlere ihtiyaç vardır. Numunenin preanalitik yönetimi, kan hücresi lizisini ve bozulmamış DNA’nın salınmasını önlemek için çok önemlidir, bu da cfDNA’nın genomik DNA ile kontaminasyonuna neden olur. Ayrıca, enzim bazlı analiz yöntemlerinin inhibitörlerinin varlığından kaçınmak için numuneler çıkarılırken dikkatli olunmalıdır.

Burada, dolaşımdaki nükleik asit analizleri de dahil olmak üzere sıvı biyopsi bazlı aşağı akış uygulamaları için çok önemli bir ilk adım olan plazma ve serum örneklerinin toplanması ve depolanması için standartlaştırılmış bir yöntem sunuyoruz.

Protocol

Kan örneklerinin çıkarılmasından önce katılımcı merkezlerden önceden etik onay alınmıştır. Serum ve plazma izolasyonu için aşağıdaki protokoller biyomedikal araştırmalar için etik ilkelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. NOT: Protokole başlamadan önce dikkat edilmesi gereken hususlar burada verilmiştir. İnsan örneklerinin biyomedikal araştırmalarda kullanımı için, ilgili bilgilendirilmiş onam ile önceden etik onay gereklidir. Kan örneklerini işlemek iç…

Representative Results

Antikoagülan olmadan kan tüplerinin santrifüjlenmesinden sonra, üst faz soluk sarı renkte görünür ve serum fraksiyonuna karşılık gelir (Şekil 2). Bu fraksiyon dikkatlice çıkarılır ve sonraki analizler için aliquoted edilir. Hemoliz, plazma veya serum fraksiyonunda mevcut olabilir ve üst faz, hemolizin varlığını ve derecesini gösteren kırmızımsı bir görünüme sahip olacaktır (Şekil 3). <p class="jove_…

Discussion

Sıvı biyopsi, kanser yönetimi sırasında farklı zamanlarda çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. İlk olarak, tanıda, klinik olarak daha fazla araştırılabilecek potansiyel bir tümör lezyonunun varlığını düşündürecek tümör moleküler belirteçlerini tanımlamak. İkincisi, hastalığın gerçek zamanlı izlenmesi için tedavi sırasında, tedavi moleküler yanıtının değerlendirilmesi, klonal evrim ve hastalık nükslerinin veya tedavi direncinin erken tespiti. Son olarak, cerrahi tedaviden …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kanserde Biyomedikal Araştırma Ağı’na (CIBERONC) destekleri ve aşağıdaki proje hibeleri için teşekkür ederiz: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC sıvı biyopsisinin standardizasyonu ve teşviki için platform. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Materials

1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 120.086 Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes BIOFIL GSP010010 Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube Becton Dickinson 367525 These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes BIOFIL CFT411150 Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant Becton Dickinson 368965 Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing Corning 430662 Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube Becton Dickinson 367864 These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System Agilent G2991BA Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes BIOFIL GSP010005 Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant Becton Dickinson 366468 Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor Thermo Fisher Scientific Sorvall ST 16  10688725 Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials Corning 431120 These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips CORNING 4809 Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Qiagen 55114 Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL Streck 218997 These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C) ESCO 2180104 Any standard tubes/equipment can be used

References

  1. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
  3. Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
  4. Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
  5. Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
  6. Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
  7. Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic – implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
  8. Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
  9. Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
  10. Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
  11. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
  12. Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
  13. Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
  14. Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
  15. Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
  16. Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
  17. Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
  18. Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
  19. Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
  20. De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).

Play Video

Cite This Article
Earl, J., Calabuig-Fariñas, S., Sarasquete, M. E., Muinelo Romay, L., Lopez-Tarruella, S., Bellosillo Paricio, B., Rodríguez, M., Valencia Leoz, K., Dueñas Porto, M., Tarazona, N., Hernandez Losa, J., Toledo, R. A. A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications. J. Vis. Exp. (187), e64123, doi:10.3791/64123 (2022).

View Video