Summary
液体活检彻底改变了我们的肿瘤学转化研究方法,样本收集、质量和储存是其成功临床应用的关键步骤。在这里,我们描述了一种标准化且经过验证的下游无循环DNA应用的方案,该协议可应用于大多数转化研究实验室。
Abstract
术语液体活检(LB)是指来自原发性和/或转移性肿瘤的血液和其他体液中的蛋白质,DNA,RNA,细胞或细胞外囊泡等分子。LB已成为转化研究的中流砥柱,并开始成为临床肿瘤学实践的一部分,为实体活检提供了一种微创的替代方案。LB允许 通过 微创样本提取(例如血液)实时监测肿瘤。这些应用包括早期癌症检测、患者随访以检测疾病进展、评估最小残留疾病以及潜在识别分子进展和耐药机制。为了对这些可以在临床上报告的样品进行可靠的分析,应仔细考虑并严格遵守分析前程序。样品收集、质量和储存是确定其在下游应用中的有用性的关键步骤。在这里,我们介绍了液活检工作模块的标准化方案,用于收集、处理和储存血浆和血清样本,以便基于无循环DNA进行下游液体活检分析。这里介绍的协议需要标准设备,并且足够灵活,可以应用于大多数专注于生物程序的实验室。
Introduction
术语“液体活检”在2010年被定义为 起源于原发肿瘤的血液和其他体液中存在分子(例如蛋白质,脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA)),细胞或细胞外囊泡(例如外泌体)。液体活检样本的使用彻底改变了转化肿瘤学研究,因为组织活检仅限于特定时刻的特定区域,由于肿瘤异质性,可能会错过相关的克隆。此外,液体活检在原发组织稀缺或无法获得的肿瘤类型中起着相关作用,因为它可以避免侵入性活检,从而降低患者的成本和风险。此外,肿瘤分子特征的不断发展主要是由于治疗压力,液体活检样品可以捕获肿瘤克隆动力学,因为它们可以纵向,在疾病的不同临床和治疗时间,如基线,治疗,最佳反应,疾病进展甚至之前。“实时液体活检”的概念意味着可以实时监测肿瘤的动态变化,从而允许对这种疾病进行精准医疗。液体活检在临床上具有许多潜在的应用,包括癌症的筛查和早期检测,疾病的实时监测,最小残留疾病的检测,治疗耐药性的研究机制以及治疗水平1的患者分层。在许多肿瘤类型中,早期发现疾病复发和进展是未满足的临床需求,是提高癌症患者生存率和生活质量的关键因素。常规成像方式和可溶性肿瘤标志物可能缺乏该任务所需的敏感性和/或特异性。因此,临床上迫切需要新的预测标志物,例如基于循环游离核酸的靶标物。
用于液体活检研究的样本类型包括但不限于血液、尿液、唾液和粪便样本。其他肿瘤特异性样本可以是细胞抽吸物、脑脊液、胸腔积液、囊肿和腹水液、痰液和胰液2.前一种液体可能含有不同类型的癌症衍生物质,循环肿瘤细胞(CTC),或片段,例如外泌体和无细胞循环肿瘤DNA(ctDNA)。核酸可能被包封在细胞外囊泡(EV)中,或由于细胞死亡和损伤而释放到体液中。循环游离DNA(cfDNA)主要从凋亡或坏死细胞释放到血液中,并且存在于所有个体中,在炎症或肿瘤疾病中显示水平升高3。外泌体是由含有核酸,蛋白质和脂质的细胞分泌的小细胞外囊泡(~30-150nm)。这些囊泡构成细胞间通信网络的一部分,常见于许多类型的体液中 2.封闭在EV内的核酸受到保护,免受体液中恶劣环境的影响,从而为在液体活检环境中研究这些分子提供了更强大的方法。
总体而言,液体活检样品中循环核酸的水平非常低,因此需要灵敏的检测方法,例如数字PCR或下一代测序(NGS)。样品的分析前管理对于防止血细胞裂解和完整DNA的释放至关重要,从而导致cfDNA被基因组DNA污染。此外,在提取样品时必须小心,以避免存在基于酶的分析方法的抑制剂。
在这里,我们提出了一种用于收集和储存血浆和血清样品的标准化方法,这是基于液体活检的下游应用(包括循环核酸分析)的关键第一步。
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Protocol
在提取血液样本之前,事先从参与中心获得伦理批准。以下血清和血浆分离方案是根据生物医学研究的伦理原则进行的。
注意:此处提供了开始协议之前的注意事项。在生物医学研究中使用人类样本需要事先获得伦理批准,并征得相应的知情同意。需要一个II类生物安全柜来处理血液样本。在整个手术过程中应穿戴实验室外套、防护手套和眼镜,以避免被血源性病原体感染。处理血清样品至少需要30分钟。在没有抗凝剂的管中提取血液后,在室温(RT)下保持30-45分钟以允许凝块形成。血浆制备至少需要40分钟,当使用乙二胺四乙酸(EDTA)管时,样品应在提取时间起4小时内处理,如果使用细胞稳定收集管或特定的无细胞DNA收集管,则应在24-48小时内处理。然而,根据一些制造商的说法,样品在这些专用管中稳定长达2周。检查溶血很重要,这将使血浆或血清部分呈微红色外观。请参阅讨论中有关溶血样品的故障排除部分。
1. 液体活检研究的血清制备
注:执行此步骤所需的总时间为30分钟(图1)。
- 在不含抗凝剂(红色或红色/灰黑色帽)的试管中提取4-10mL血液,并在室温下维持30-45分钟。在提取后4小时内处理这些样品。
- 在适当设计的样本数据库中记录样品提取的时间和日期以及受试者识别(ID)。
- 穿着实验室外套,防护手套和眼镜,在RT(15°C-25°C)下以1,600(±150)x g离心含有新鲜血液的管子10分钟,并施加最大断裂。
- 离心后,小心地从离心机中取出管子;血清上清液的上相将显示清澈和淡黄色(图2)。检查样品是否显示溶血迹象(图3),并在适当时记录溶血的存在。
- 在II类生物安全柜中,将血清作为250μL等分试样转移到收集管中。
注:等分试样的体积必须根据研究要求进行调整。 - 立即将血清直立冷冻在-80°C的储存箱中,并记录样品储存时间。
- 验证样品是否在所需的4小时时间范围内处理。
2. 用于液体活检研究的血浆制备
注:执行此步骤所需的总时间为40分钟(图4)。
- 在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中提取4-10 mL血液。从提取时间开始在4小时内处理样品。
- 在适当设计的示例数据库中记录样本提取的时间和日期以及受试者ID。
- 穿着实验室外套,防护手套和眼镜,在室温(15°C-25°C)下以1,600(±150)x g离心EDTA管10分钟,并施加最大断裂。
注:使用其他收集管时,请参阅制造商的说明。 - 离心后,血浆上清液将呈清澈和淡黄色。检查样品是否出现溶血迹象(图3),并使用一次性血清移液管(或一次性球形移液管或带过滤尖端的p1000移液器)将血浆(上清液剂)转移到15 mL离心管中而不会干扰细胞层。在细胞层上方留下少量残留的血浆(约5mm)。
- 如果观察到溶血,请丢弃样品进行进一步分析。(图 5)。请参阅讨论中的故障排除部分以评估溶血。
- 将血浆在15mL离心管中以RT(15°C-25°C)以3,000(±150)x g离心10-20分钟 。 执行此步骤以除去从第一个离心步骤中携带的任何残留的完整血细胞。
- 离心后,小心地从离心机中取出管子,并使用一次性血清移液管(或一次性球形移液管或带过滤尖端的p1000移液器)将1-4 mL血浆转移到1-4 mL聚丙烯低温小瓶中。残留的血浆体积(约0.3mL或7mm高度)必须留在管的底部,以避免血浆被血细胞污染(图5)。
- 立即将等离子体直立冷冻在-80°C的储存箱中,并记录样品储存的时间。验证样品是否在所需的4小时时间范围内处理。
- 使用P1000和过滤的吸头收集细胞层(黄褐色涂层)并将其转移到2 mL管中。立即冷冻并储存在-80°C。
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Representative Results
在没有抗凝剂的情况下离心血管后,上相呈现淡黄色并对应于血清级分(图2)。该馏分被小心地除去并等分,以便随后进行分析。
溶血可能存在于血浆或血清部分,并且上相将具有红色外观,这表明溶血的存在和程度(图3)。
EDTA管离心后,几个相或层将很明显;上相(淡黄色)是血浆部分,占总血容量的55%;薄灰白色界面是含有白细胞和血小板的黄褐色外套层,占总血容量的<1%;下层阶段(红色)含有红细胞,占总血容量的45%)。吸出白细胞层上方1cm,并确保细胞层不受干扰,以减少血浆与血细胞的污染(图5)。应小心地去除该馏分并等分试样以进行后续分析。
从血浆样品中提取的cfDNA的浓度和完整性应使用基于电泳的方法进行评估。cfDNA是使用市售的柱基试剂盒提取的。使用特定于cfDNA应用的基于凝胶的市售试剂盒进行定量(材料表)。 图6A 显示了可用于下游应用的高质量cfDNA提取的示例。然而, 图6B 显示了具有高水平基因组污染的不合适样品的示例。
图1:液体活检研究的血清制备。 图中显示了从样品离心到等分试样的储存的血清制备过程的概述。步骤1:在没有抗凝剂的管中进行血液样品分离血清。步骤2:离心血管,在提取后4小时内获得血清。步骤3:取出血清上清液的上相,用于后续储存。步骤4:将血清管直立冷冻在-80°C, 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:离心后在没有抗凝剂的试管中收集的血液样本。 上期对应于血清级分。 请点击此处查看此图的大图。
图3:离心后溶血样品的示例。 由于溶血,对应于血浆/血清级分的上相呈红色。理想情况下,应丢弃这些样品,或者至少应记录样品中溶血的存在,因为这可能会影响某些下游应用。 请点击此处查看此图的大图。
图4:用于液体活检研究的血浆制备。 图中显示了血清制备过程的概述,从样品离心到等分试样的储存和黄褐色涂层收集。步骤1:血液样品在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中用于分离血浆。步骤2:离心血管,在提取后4小时内获得血浆。步骤3:将血浆上清液转移到15 mL离心管中,而不会干扰细胞层。步骤4:离心血浆以除去从第一个离心步骤中携带的任何血细胞。步骤5:将血浆转移到低温小瓶中,并在-80°C下直立冷冻血浆管。 步骤6:收集细胞层(黄褐色外套)并储存在-80°C, 请点击此处查看此图的大图。
图5:离心后的EDTA血液样本。 离心含有新鲜血液的管后,可以看到三个可见层。上相对应于血浆部分,薄灰白色界面对应于黄褐色外套,含有白细胞和血小板,底相含有红细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图6:从血浆中分离出的cfDNA的基于电泳的分析(A)最佳实验的一个例子。(B) 次优实验的例子。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
液体活检在癌症管理的不同时间具有许多潜在的应用。首先,在诊断时识别肿瘤分子标志物,这些标记物将表明存在潜在的肿瘤病变,可以在临床上进一步研究。其次,在治疗期间对疾病进行实时监测,评估治疗分子反应、克隆进化,以及早期发现疾病复发或治疗耐药性。最后,在手术治疗后,作为检测最小残留疾病的工具。欧洲肿瘤内科学会(ESMO)最近发布了在转移性非小细胞肺癌(NSCLC)中实施ctDNA突变检测的指南,以确定可操作的治疗靶点。这些指南包括 ctDNA 分析的方法学考虑因素、技术评估和验证,并讨论了一些挑战,如体细胞嵌合、低变异等位基因频率 (VAF) 和偶然的种系致病变异检测4.最近发布的用于转移性乳腺癌患者诊断、分期和治疗的ESMO临床实践指南表明,在治疗方法发生变化或进入临床试验的必要条件的情况下,基于ctDNA的分析5.
样品应在提取后4小时内处理。超出该时间范围的样品处理会导致样品降解并导致溶血增加,这可能会影响cfDNA浓度并影响下游应用,如miRNA分析。建议使用2-4 mL血浆,以获得下游分析的足够灵敏度。基于cfDNA的应用含有一种防腐剂,可以稳定有核血细胞并防止释放污染的基因组DNA(gDNA);提取血液后,DNA在这些管中在6°C至37°C下稳定长达14天。然而,样品应在24-48小时内处理,以避免被裂解的白细胞污染。
应使用足够体积的等分试样,以避免血清和血浆样品的冻融。等分试样的体积和数量将取决于样品的下游用途以及-80°C冰箱的储存能力。1 mL等分试样是有用的,因为这是用于许多cfDNA提取方案的标准体积,如果需要更多体积,可以解冻各种等分试样。
与具有明显淡黄色外观的非溶血样品相比,可以通过测量可疑溶血样品的540nm波长处的吸光度来估计样品的溶血性。样品的相对溶血性计算为非溶血样品(具有明显的淡黄色外观)和溶血样品(具有红色外观)在540nm波长处的吸光度之比。建议读者参考泰勒范布伦等人的文章,以获取更多信息6.
样品完整性在所有下游液体活检应用中都至关重要,从样品提取到处理和样品收集管类型的时间是两个关键因素,因为它们会影响ctDNA标记物的质量和产量。作为一般规则,所有样品必须收集在cfDNA特异性管或EDTA管中,并分别在提取后的48小时和4小时内处理。因此,与参与样本收集的人员和服务进行良好协调非常重要。理想情况下,应建立详细的样品收集电路,明确定义所有相关人员的任务,并详细说明样品的处理和转移。对于 cfDNA 应用,血浆优于血清,因为在凝血过程中,由于白细胞裂解,血清往往会受到基因组 DNA 的污染7.另一方面,血浆通常含有PCR抑制剂,例如肝素,血红蛋白,激素,免疫球蛋白G和乳铁蛋白8。然而,样品稀释可以帮助克服这个问题,前提是样品具有足够浓度的cfDNA。最近的一项研究报告了液体活检应用的分析前工作流程,比较了不同的稳定管以及从血浆中分离的核酸的定量和质量测量,证明了标准化处理方案对于可重复的下游分析的重要性9。美国国家癌症研究所(NCI)cfDNA分析指南建议在2-4小时内处理EDTA管,并在3天内处理具有特殊防腐剂的管子10。生物样本库对于不需要样品处理和储存所需设备的调查人员来说可能是一个有用的设施。理想情况下,样品不应冷冻解冻超过一次,并且在使用前不应储存超过3年;因此,必须特别注意下游应用的等分试样的体积,以避免冻融循环。
等离子体处理的另一个关键步骤是离心;第一个确定从单核细胞中正确分离血浆,单核细胞是gDNA污染的来源,可以大大稀释ctDNA的相对丰度。以较快的速度进行的第二次离心旨在进一步除去裂解的白细胞11。离心完成后使用制动器似乎对等离子体样品12的质量没有任何影响。处理血液样品时的另一个重要考虑因素是要使用的离心机转子的类型,无论是摆出式还是固定式转子。为了处理血液样本,建议使用外摆转子。这种形式允许根据密度梯度更好地分离血液成分,并且离心后细胞沉淀的位置位于离心管的底部,而使用固定转子离心机,细胞沉淀沿着管的侧面形成。固定转子允许使用更大的重力,更适合分离蛋白质和核酸,尽管它们通常允许同时处理更多的样品。
cfDNA的最终产量对于下游应用的灵敏度至关重要。因此,根据以前的数据,至少需要3.6纳克(ng)的cfDNA才能达到<0.1%和36 ng的灵敏度,以获得<0.01%的灵敏度来检测突变等位基因13。在决定用于收集和提取的样品体积时,必须考虑cfDNA的质量和数量。例如,先前的研究表明,从1 mL血浆中提取的cfDNA的平均/中位数浓度在子宫内膜癌14中为21ng / mL,在霍奇金淋巴瘤15中为14.3(范围7-204)ng / mL,在非小细胞肺癌 ±(NSCLC)16中为1.35ng / mL,在胰腺癌病例中为1.35ng / mL17。所需的血浆体积取决于所采用的下游技术,但建议使用2-4 mL以达到足够的灵敏度。
样品可追溯性是创建样品集合时必须考虑的一个重要方面;所有样品和等分试样都应正确清晰地标记,以便于后续识别。也可以使用生物样本库,因为它们具有经过认证的质量管理体系,该系统保证了所存储的数据和生物样品的质量,安全性和可追溯性,符合适用的当地和国际法律法规。理想情况下,与样品相关的数据应存储在适合此目的的数据库中,例如研究电子数据采集(REDCap),这是范德比尔特大学开发的基于Web的应用程序,用于捕获临床研究数据并创建数据库和项目(https://www.project-redcap.org/)。还强烈建议使用具有数据加密功能的安全服务器。
最近回顾了与在临床中实施液体活检相关的挑战10,其中一个突出的关键问题是样品收集,处理和储存等分析前条件的标准化,这直接影响了分析和临床验证,以及结果的可重复性。液体活检联盟,如癌症-ID,欧洲液体活检学会(ELBS)和癌症血液分析图谱(BloodPAC)旨在标准化分析前步骤,并确定临床环境中液体活检研究的最佳实践18,19。
液体活检是一种非常灵活和有用的工具,在癌症诊断,治疗和随访方面具有巨大的潜力20。越来越多的证据显示其广泛相关性,为了正确实施和使用,以标准化方式收集样本的重要性是获得有价值和可比数据的关键。使用标准化协议对于避免后续分析中的技术障碍至关重要,这在过去使用旧的档案样本时一直是一个真正的限制。在这里,我们提供了经过验证的方案,可以帮助保证临床和研究基于cfDNA的液体活检研究的最佳分析前程序。
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Disclosures
比阿特丽斯·贝洛西略(BB):BB获得了来自安进,阿斯特拉 - 泽内卡,生物卡蒂斯,杨森,默克 - 塞罗诺,诺华,奇亚根,罗氏诊断,罗氏制药,赛默飞世尔,辉瑞和BMS的演讲者,顾问或顾问职位的酬金。Sara López-Tarruella (SL):SL获得了来自阿斯特拉-泽内卡/第一桑京,默沙东,诺华,辉瑞,罗氏制药,吉利德,礼来,皮埃尔法布尔,西根,葛兰素史克和韦拉克特的演讲者,顾问或顾问职位的酬金。诺利亚塔拉索纳(NT):北领地获得了安进,辉瑞,默克 - 塞罗诺,施维耶,SEOM和ESMO的演讲者,顾问或顾问职位的酬金。哈维尔·埃尔南德斯-洛萨(JHL):从阿斯特拉-泽内卡、杨森、诺华、罗氏诊断、罗氏制药、保温费舍、礼来和迪奥西克获得演讲、顾问或顾问职位的酬金。罗德里戈·托莱多(RT)报告获得了诺华公司与本研究相关的研究资助,以及与阿斯利康和贝葛内本研究无关的研究资助。其余作者没有关于手稿的披露。
Acknowledgments
我们要感谢癌症生物医学研究网络(CIBERONC)的支持和以下项目资助:LB CIBERONC平台:用于液体活检标准化和促进的CIBERONC平台。PI罗德里戈托莱多,(西伯利亚),2019-2021。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
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