La biopsia líquida ha revolucionado nuestro enfoque de los estudios traslacionales oncológicos, siendo la recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento pasos cruciales para su aplicación clínica exitosa. Aquí describimos un protocolo estandarizado y validado para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo que se puede aplicar en la mayoría de los laboratorios de investigación traslacional.
El término biopsia líquida (LB) se refiere a moléculas como proteínas, ADN, ARN, células o vesículas extracelulares en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario y / o metastásico. LB se ha convertido en un pilar en la investigación traslacional y ha comenzado a formar parte de la práctica de oncología clínica, proporcionando una alternativa mínimamente invasiva a la biopsia sólida. El LB permite el monitoreo en tiempo real de un tumor a través de una extracción de muestra mínimamente invasiva, como la sangre. Las aplicaciones incluyen la detección temprana del cáncer, el seguimiento del paciente para la detección de la progresión de la enfermedad, la evaluación de la enfermedad residual mínima y la identificación potencial de la progresión molecular y el mecanismo de resistencia. Para lograr un análisis confiable de estas muestras que se puede informar en la clínica, los procedimientos preanalíticos deben considerarse cuidadosamente y seguirse estrictamente. La recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento son pasos cruciales que determinan su utilidad en aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos protocolos estandarizados de nuestro módulo de trabajo de biopsia líquida para recolectar, procesar y almacenar muestras de plasma y suero para el análisis de biopsia líquida aguas abajo basado en ADN libre de circulación. Los protocolos presentados aquí requieren equipos estándar y son lo suficientemente flexibles para ser aplicados en la mayoría de los laboratorios centrados en procedimientos biológicos.
El término “biopsia líquida” se definió en 20101 como la presencia de moléculas (por ejemplo, proteína, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN)), células o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario. El uso de muestras de biopsia líquida ha revolucionado la investigación oncológica traslacional, ya que las biopsias de tejido, limitadas a una región particular en un momento determinado, pueden perder clones relevantes debido a la heterogeneidad tumoral. Además, la biopsia líquida juega un papel relevante en los tipos de tumores donde el tejido primario es escaso o no accesible, ya que puede evitar una biopsia invasiva, reduciendo los costos y el riesgo para los pacientes. Además, las características moleculares del tumor están en constante evolución debido principalmente a la presión de la terapia, y las muestras de biopsia líquida pueden capturar la dinámica clonal del tumor, ya que se pueden tomar longitudinalmente, en diferentes momentos clínicos y terapéuticos de la enfermedad, como la línea de base, en el tratamiento, la mejor respuesta y en la progresión de la enfermedad o incluso antes. El concepto de “biopsia líquida en tiempo real” significa que los cambios dinámicos en el tumor se pueden monitorear en tiempo real, lo que permite la medicina de precisión en esta enfermedad. La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en la clínica, incluyendo el cribado y la detección precoz del cáncer, la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la detección de la enfermedad residual mínima, el estudio de los mecanismos de resistencia al tratamiento y la estratificación de los pacientes a nivel terapéutico1. La detección precoz de la recurrencia y progresión de la enfermedad es una necesidad clínica insatisfecha en muchos tipos de tumores y es un factor clave para aumentar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer. Las modalidades de diagnóstico por imágenes de rutina y los marcadores tumorales solubles pueden carecer de la sensibilidad y/o especificidad requerida para esta tarea. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos marcadores predictivos en la clínica, como los basados en ácidos nucleicos libres circulantes.
Los tipos de muestras que se utilizan para los estudios de biopsia líquida incluyen, entre otros, muestras de sangre, orina, saliva y heces. Otras muestras específicas del tumor pueden ser aspirados celulares, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido de quistes y ascitis, esputo y jugo pancreático2. Los primeros líquidos pueden contener diferentes tipos de materiales derivados del cáncer, células tumorales circulantes (CTC) o fragmentos como exosomas y ADN tumoral circulante libre de células (ctDNA). Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en vesículas extracelulares (EV) o liberarse en los fluidos corporales debido a la muerte y el daño celular. El ADN libre circulante (cfDNA) se libera principalmente en el torrente sanguíneo desde células apoptóticas o necróticas y está presente en todos los individuos, mostrando niveles aumentados en enfermedades inflamatorias u oncológicas3. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contienen ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Estas vesículas forman parte de la red de comunicación intercelular y se encuentran comúnmente en muchos tipos de fluidos corporales2. Los ácidos nucleicos encerrados dentro de los EV están protegidos del ambiente hostil dentro de los fluidos corporales, proporcionando así una forma más robusta de estudiar estas moléculas en el entorno de biopsia líquida.
En general, los niveles de ácidos nucleicos circulantes en las muestras de biopsia líquida son muy bajos y, por lo tanto, se necesitan métodos sensibles para la detección, como la PCR digital o la secuenciación de próxima generación (NGS). El manejo preanalítico de la muestra es crucial para prevenir la lisis de las células sanguíneas y la liberación de ADN intacto, causando la contaminación del cfDNA con el ADN genómico. Además, se debe tener cuidado al extraer muestras para evitar la presencia de inhibidores de los métodos de análisis basados en enzimas.
Aquí presentamos un método estandarizado para la recolección y almacenamiento de muestras de plasma y suero, que es un primer paso crucial para las aplicaciones posteriores basadas en biopsia líquida, incluidos los análisis de ácidos nucleicos circulantes.
La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en diferentes momentos durante el tratamiento del cáncer. Primero, en el momento del diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorales que sugieran la presencia de una posible lesión tumoral que podría investigarse más a fondo clínicamente. En segundo lugar, durante el tratamiento para la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la evaluación de la respuesta molecular del tratamiento, la evolución clonal y la detección precoz de rec…
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer a la Red de Investigación Biomédica en Cáncer (CIBERONC) su apoyo y la siguiente subvención del proyecto: LB PLATAFORMA CIBERONC: Plataforma CIBERONC para la estandarización y promoción de la biopsia líquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |