En neuronal lysosom nærhetsmerking proteomikkprotokoll er beskrevet her for å karakterisere det dynamiske lysosomale mikromiljøet i humaninduserte pluripotente stamcelleavledede nevroner. Lysosomale membranproteiner og proteiner som interagerer med lysosomer (stabilt eller forbigående) kan kvantifiseres nøyaktig i denne metoden med utmerket intracellulær romlig oppløsning i levende humane nevroner.
Lysosomer kommuniserer ofte med en rekke biomolekyler for å oppnå nedbrytning og andre forskjellige cellulære funksjoner. Lysosomer er kritiske for menneskelig hjernefunksjon, da nevroner er postmitotiske og stole sterkt på autofagi-lysosomveien for å opprettholde cellulær homeostase. Til tross for fremskritt i forståelsen av ulike lysosomale funksjoner, er det teknisk utfordrende å fange den svært dynamiske kommunikasjonen mellom lysosomer og andre cellulære komponenter, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte. Her er en detaljert protokoll gitt for den nylig publiserte endogene (knock-in) lysosom-nærhetsmerkingsproteomiske metoden i humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC) -avledede nevroner.
Både lysosomale membranproteiner og proteiner som omgir lysosomer innenfor en radius på 10-20 nm, kan trygt identifiseres og kvantifiseres nøyaktig i levende humane nevroner. Hvert trinn i protokollen er beskrevet i detalj, dvs. hiPSC-nevronkultur, nærhetsmerking, nevronhøsting, fluorescensmikroskopi, biotinylert proteinberikelse, proteinfordøyelse, LC-MS-analyse og dataanalyse. Oppsummert gir denne unike endogene lysosomale nærhetsmerkingsproteomikkmetoden et høyt gjennomstrømnings- og robust analytisk verktøy for å studere de svært dynamiske lysosomale aktivitetene i levende menneskelige nevroner.
Lysosomer er katabolske organeller som nedbryter makromolekyler via lysosomal-autofagi-banen1. Foruten nedbrytning er lysosomer involvert i ulike cellulære funksjoner som signaltransduksjon, næringsmåling og sekresjon 2,3,4. Forstyrrelser i lysosomal funksjon har vært involvert i lysosomale lagringsforstyrrelser, kreft, aldring og nevrodegenerasjon 3,5,6,7. For postmitotiske og svært polariserte nevroner spiller lysosomer kritiske roller i nevronal cellulær homeostase, nevrotransmitterfrigivelse og langdistansetransport langs axonene 8,9,10,11. Imidlertid har det vært en utfordrende oppgave å undersøke lysosomer i humane nevroner. Nylige fremskritt i indusert pluripotent stamcelle (iPSC) -avledet nevronteknologi har muliggjort kulturen av levende menneskelige nevroner som tidligere var utilgjengelige, og bygger bro over gapet mellom dyremodeller og menneskelige pasienter for å studere den menneskelige hjerne12,13. Spesielt integrerer den avanserte i3Neuron-teknologien stabilt neurogenin-2-transkripsjonsfaktoren i iPSC-genomet under en doxycyklinin-induserbar promotor, og driver iPSC-er til å differensiere til rene kortikale nevroner i 2 uker14,15.
På grunn av den svært dynamiske lysosomale aktiviteten er det teknisk utfordrende å fange lysosomale interaksjoner med andre cellulære komponenter, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte. Nærhetsmerkingsteknologi er godt egnet til å studere disse dynamiske interaksjonene på grunn av sin evne til å fange både stabile og forbigående / svake proteininteraksjoner med eksepsjonell romlig spesifisitet16,17. Konstruert peroksidase eller biotin ligase kan genetisk smeltes til agnproteinet. Ved aktivering produseres svært reaktive biotinradikaler for å kovalent merke naboproteiner, som deretter kan berikes av streptavidinbelagte perler for nedstrøms bottom-up proteomikk via flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) plattformer 17,18,19,20,21.
En endogen lysosomal nærhetsmerkingsproteomikkmetode ble nylig utviklet for å fange det dynamiske lysosomale mikromiljøet i i3Neurons22. Konstruert askorbatperoksidase (APEX2) ble slått inn på C-enden av det lysosomale assosierte membranproteinet 1 (LAMP1) i iPSC, som deretter kan differensieres til kortikale nevroner. LAMP1 er et rikelig lysosomalt membranprotein og en klassisk lysosomal markør23. LAMP1 uttrykkes også i sene endosomer, som modnes til lysosomer; Disse sene endosom-lysosomene og ikke-nedbrytende lysosomene er alle referert til som lysosomer i denne protokollen. Denne endogene LAMP1-APEX-sonden, uttrykt på fysiologisk nivå, kan redusere LAMP1-feillokaliserings- og overuttrykksartefakter. Hundrevis av lysosomale membranproteiner og lysosomale interaktorer kan identifiseres og kvantifiseres med utmerket romlig oppløsning i levende menneskelige nevroner.
Her beskrives en detaljert protokoll for lysosom-nærhetsmerking av proteomikk i humane iPSC-avledede nevroner med ytterligere forbedringer fra den nylig publiserte metoden22. Den generelle arbeidsflyten er illustrert i figur 1. Protokollen inkluderer hiPSC-avledet nevronkultur, nærhetsmerkingsaktivering i nevroner, validering av APEX-aktivitet ved fluorescensmikroskopi, bestemmelse av et optimalt streptavidinperler-til-inngang-proteinforhold, anrikning av biotinylerte proteiner, on-beads proteinfordøyelse, peptidavsalting og kvantifisering, LC-MS-analyse og proteomikkdataanalyse. Feilsøkingsretningslinjer og eksperimentelle optimaliseringer diskuteres også for å forbedre nærhetsmerking kvalitetskontroll og ytelse.
Ved hjelp av denne LAMP1-APEX-sonden blir proteiner på og nær den lysosomale membranen biotinylert og beriket. Gitt den typiske lysosomdiameteren på 100-1,200 nm, gir denne metoden utmerket intracellulær oppløsning med en 10-20 nm merkingsradius. LAMP1 er et rikelig lysosomalt membranprotein og en klassisk markør for lysosomer, som fungerer som et utmerket agnprotein for lysosomal APEX-merking på endogent uttrykksnivå. Imidlertid eksisterer det også begrensninger ved bruk av LAMP1 for å målrette lysosomer, da …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien støttes av NIH-stipendet (R01NS121608). AMF anerkjenner ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship og Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi takker Michael Ward-laboratoriet ved National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) for molekylærbiologisk støtte og i3Neuron-teknologiutviklingen.
10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |