Summary
L’article décrit la méthode d’isolement des cellules endothéliales glomérulaires immortalisées conditionnellement des reins de souris transgéniques exprimant le virus simien thermolabile 40 et les mitochondries photo-activables, PhAMexcisée. Nous décrivons la procédure d’isolement des glomérules à partir de reins entiers à l’aide de billes, d’étapes de digestion, d’ensemencement et de culture de GECs-CD31 positifs.
Abstract
Le dysfonctionnement des cellules endothéliales glomérulaires (GEC) peut initier et contribuer à la dégradation de la barrière de filtration glomérulaire. L’augmentation du stress oxydatif mitochondrial a été suggérée comme un mécanisme entraînant un dysfonctionnement GEC dans la pathogenèse de certaines maladies glomérulaires. Historiquement, l’isolement des GEC des modèles in vivo a été notoirement difficile en raison des difficultés à isoler les cultures pures des glomérules. Les GEC ont des besoins de croissance complexes in vitro et une durée de vie très limitée. Ici, nous décrivons la procédure d’isolement et de culture de GEC conditionnellement immortalisés avec des mitochondries fluorescentes, permettant le suivi des événements de fission et de fusion mitochondriales. Les GEC ont été isolés à partir des reins d’une double souris transgénique exprimant le thermolabile SV40 TAg (de l’Immortomouse), favorisant conditionnellement la prolifération et supprimant la différenciation cellulaire, et une protéine fluorescente photoconvertible (Dendra2) dans toutes les mitochondries (de la souris photo-activable mitochondria [PhAMexcisée]). La lignée cellulaire stable générée permet la différenciation cellulaire après inactivation du gène TAg immortalisant SV40 et la photo-activation d’un sous-ensemble de mitochondries provoquant un passage de la fluorescence du vert au rouge. L’utilisation de mitoDendra2-GECs permet d’imager en direct les événements de distribution, de fusion et de fission des mitochondries fluorescentes sans colorer les cellules.
Introduction
Le glomérule est essentiel pour la filtration du sang en limitant le passage des grosses molécules à travers la barrière de filtration glomérulaire 1,2. Le glomérule contient quatre types de cellules: les cellules épithéliales pariétales, les podocytes (cellules épithéliales viscérales), les cellules endothéliales glomérulaires (GEC) et les cellules mésangiales3. L’endothélium glomérulaire est caractérisé par une structure vasculaire unique, selon la présence de fenestrae nécessaires pour de grands volumes de filtration4. La surface apicale de l’endothélium glomérulaire est recouverte d’une couche de glycocalyx chargée négativement et d’une couche appelée couche de surface endothéliale qui crée un espace entre l’endothélium et le sang. Cette structure assure une sélectivité de charge élevée limitant le passage des molécules chargées négativement telles que l’albumine et empêchant l’adhésion leucocytaire et plaquettaire5.
Les GEC sont très sensibles aux changements métaboliques, tels que l’hyperglycémie associée au milieu diabétique. En effet, le diabète entraîne une circulation accrue des substances nocives, la saturation des voies métaboliques du glucose, et une perturbation de l’équilibre redoxcellulaire 3,6. De plus, l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène induit un dysfonctionnement mitochondrial, ce qui affecte la fonction endothéliale7.
L’objectif global du protocole actuel est d’isoler les cellules endothéliales glomérulaires immortalisées présentant des caractéristiques mitochondriales fluorescentes. En effet, la culture cellulaire des GEC primaires a un cycle prolifératif limité et une sénescence précoce8. De plus, la présence de mitochondries fluorescentes aide à examiner les événements de fission et de fusion en réponse à l’hyperglycémie ou à tout autre traitement. Comme méthode alternative, d’autres laboratoires ont utilisé h-TERT pour immortaliser les cellules in vitro9.
La méthode décrite ici permet d’isoler des cellules endothéliales glomérulaires mitoDendra2 immortalisées sous condition chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines (Figure 1). Ce protocole détaillé décrit l’utilisation de souris transgéniques (H-2K b-tsA58) hébergeant le gène 10,11 du grand antigène tumoral du virus simien 40 (SV40 TAg) pour générer des cellules thermolabiles immortalisées sous condition. Le produit du gène TAg tsA58 est fonctionnel à la température permissive de 33 °C sous le contrôle du promoteur flanquant 5' inductible du gène H-2Kb de la souris, qui est augmenté au-dessus des niveaux basaux lors de l’exposition à l’interféron gamma (IFNγ), maintenant ainsi le phénotype de prolifération conditionnelle12. H-2Kb se dégrade rapidement à la température non permissive de 37 °C en l’absence d’IFNγ, supprimant la fonction immortalisant du tsA58Tag dans les cellules et permettant aux cellules de développer un phénotype 13,14,15 plus différencié. Le croisement optionnel de souris transgéniques H-2Kb-tsA58 avec des souris PhAM, qui expriment un Dendra2-vert spécifique aux mitochondries (sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase), permet la détection en direct de mitochondries fluorescentes16. La fluorescence verte Dendra2 passe à la fluorescence rouge après exposition à un laser 405 nm16. Lorsque les mitochondries fusionnent après photo-commutation, elles forment des formes allongées qui apparaissent jaunes à cause de l’échange de matière verte et jaune ou apparaissent rouges lorsqu’elles subissent une fission 7,17. Les mitoDendra2-GECs sont un excellent outil pour étudier les réponses cellulaires des mitochondries GEC à différents stimuli.
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Protocol
Toutes les procédures animales décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï. Nous avons utilisé trois souris mâles (souris transgéniques H-2Kb-tsA58 avec des mitochondries photo-activables [PhAM]) achetées au laboratoire Jackson et maintenues sur un régime alimentaire normal.
1. Conditions de travail et préparatifs
- Nettoyez l’espace de travail à l’intérieur de la hotte à flux laminaire en utilisant 70% d’éthanol et de lumière UV-C.
- Préparez les tampons de lavage de la perle. Faire tampon-1 en utilisant 0,1 M de phosphate de sodium à pH 7,4-8,0, tampon-2 en utilisant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium et magnésium complétée par 0,1% d’antigène sérique bovin (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 et tampon-3 en utilisant 0,2 M Tris avec 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Concentrateur de particules magnétiques
- Préparation des billes magnétiques
- Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, mélanger délicatement 200 μL de billes magnétiques (4 x 108 billes) avec 200 μL de tampon-1.
NOTE: Préparez 200 μL de billes magnétiques par souris 1 jour avant le prélèvement de tissu. Les perles seront utilisées pour récolter les glomérules. - Placez le tube dans un concentrateur de particules magnétique pendant 1 min, puis aspirez soigneusement le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes lavées dans 200 μL de tampon-1.
- Placez le tube contenant les billes magnétiques dans le concentrateur de particules magnétiques pendant 1 min et aspirez doucement le surnageant.
- Inactivez les groupes tosyles libres en lavant les billes magnétiques 2x, 5 min chacune, en utilisant 200 μL de tampon-2 en plaçant le tube dans le concentrateur de particules magnétiques et en jetant le tampon.
- Incuber les billes magnétiques dans 200 μL de tampon-3 pendant 24 h à 4 °C, ou pendant 4 h à 37 °C, pour inactiver les groupes tosyles libres restants. Placez le tube dans le concentrateur magnétique pendant 1 min, aspirez doucement le surnageant et jetez-le.
- Laver les billes magnétiques 1x avec 200 μL de tampon-2 pendant 5 min à 4 °C. Replacez le tube dans le concentrateur magnétique pendant 1 min et aspirez doucement le surnageant. Retirer le tube du concentrateur magnétique et remettre en suspension les billes magnétiques dans 200 μL de tampon-2 pour obtenir 4 x 108 billes/mL.
NOTE: À ce stade, il est possible de laisser les perles à 4 ° C jusqu’à 15 jours.
- Dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, mélanger délicatement 200 μL de billes magnétiques (4 x 108 billes) avec 200 μL de tampon-1.
3. Isolement des cellules glomérulaires rénales de souris
- Préparez le matériel de perfusion : seringue de 30 mL, aiguille papillon de 25 G. Préparez le matériel d’isolement: boîte stérile de 10 cm, scalpel, concentrateur de particules magnétique, crépine cellulaire de 40 μm, crépine cellulaire de 100 μm.
- Préparez 100 ml de 1x Hank’s Balanced salt solution (HBSS) complétée par des antibiotiques à 1 % et ajustez le pH à 7,35. Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm et la garder sous le capot pour éviter toute contamination.
- Mélanger 200 μL de billes magnétiques de l’étape 2.1.6 avec 20 mL de 1x HBSS.
REMARQUE : Pour chaque souris, 200 μL de billes diluées dans 20 mL de HBSS 1x seront nécessaires. - Préparer une partie aliquote de 1 mL de collagénase de type II (125 CDU/mg) à 1 mg/mL dans 1x solution HBSS, pH 7,35. Préchauffer le RPMI avec un milieu FCS à 10 % au bain-marie à 37 °C. Préchauffer le milieu de culture cellulaire endothéliale à 37 °C (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
REMARQUE: Le RPMI sera utilisé pour neutraliser la collagénase. - Pré-enduire deux puits d’une plaque de 6 puits avec 2 mL de collagène IV à 10 μg/mL (1 mL/puits) pendant 45 min à température ambiante. Lavez la plaque 3x avec 1x PBS pour éliminer l’acide acétique utilisé pour diluer le collagène. Utilisez immédiatement les plaques enduites ou conservez-les entre 2 et 8 °C jusqu’à 4 semaines.
REMARQUE: Il est préférable de sceller la ou les plaques avec un film transparent pour éviter le dessèchement. Le revêtement de collagène facilite la fixation des cellules à la plaque. - Nettoyez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux de la figure 2 en utilisant de l’éthanol à 70 %, puis en les autoclavant pendant 30 min. Nettoyez l’espace de travail chirurgical avec de l’éthanol à 70 %.
- Anesthésiez les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (10 mg/mL de kétamine et 1 mg/mL de xylazine). Pour confirmer que l’animal est complètement anesthésié, vérifiez le réflexe de pincement des orteils.
- Fixez les pattes de la souris avec des aiguilles de 19 G pour la maintenir en place sur une plate-forme de dissection. Nettoyez la poitrine et l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % et ouvrez l’abdomen le long de la poitrine avec des ciseaux A (Figure 2).
- Insérez une aiguille papillon dans le ventricule gauche (figure 3A) et injectez environ 100 μL de la solution de billes (à partir de l’étape 1.2) pour élargir la circulation sanguine.
- Casser délicatement la veine cave inférieure sous les reins à l’aide d’une aiguille de 19 G (figure 3A). Poursuivre la perfusion initiée à l’étape 3.9.
REMARQUE: Alternativement, une mini-pompe peut être utilisée à la vitesse: 18.0+, durée: 5 min. Une bonne perfusion est importante pour récolter un grand nombre de glomérules portant des billes magnétiques. Il s’agit d’une procédure de non-survie/terminale. - Retirez délicatement le tissu adipeux à l’aide d’une pince à épiler et excisez les deux reins avec de fins ciseaux chirurgicaux c (figure 2) et placez-les dans une assiette contenant 1 mL de 1x HBSS sur de la glace. Hacher le rein avec des ciseaux b (Figure 2) puis avec un scalpel stérile en petits morceaux de 1 mm comme le montre la Figure 3B.
- Ensuite, incuber le rein émincé avec 1 mL de collagénase de type II à partir de l’étape 3.4 pendant 35 minutes à 37 °C en inclinant doucement à l’aide d’un agitateur horizontal. Le tissu doit être complètement digéré après cette étape, comme le montre la figure 3C.
- Ajouter 4 mL de RPMI avec 10% FBS (à partir de l’étape 3.4) pour neutraliser la collagénase. Filtrer le tissu digéré à travers une passoire cellulaire stérile de 100 μm dans un tube de 50 mL. Utilisez le fond d’un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL pour remuer le tissu digéré contre la passoire afin de permettre aux glomérules de passer.
- Rincer la crépine cellulaire avec 15 mL de 1x HBSS, puis centrifuger le flux continu à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. À ce stade, la pastille contient trois couches; les billes avec des glomérules sont visibles dans la couche intermédiaire du tube, la couche supérieure est constituée de structures plus petites telles que des tubules, et la couche inférieure est constituée de débris (Figure 3D).
- Aspirez soigneusement le surnageant et la couche blanche supérieure. La pastille restante contient les billes portant les glomérules et les débris (figure 3D). Remettez la pastille en suspension avec 1,5 mL de 1x HBSS et transférez-la dans un tube de 2 mL.
- Placer le tube dans le concentrateur magnétique (Figure 3E), aspirer le surnageant, puis laver les billes 2x avec 1 mL de 1x HBSS; à ce stade, placez 20 μL de la suspension cellulaire sur une lame pour vérifier la présence de glomérules au microscope (Figure 3F; un glomérule [flèche noire] et quelques billes [flèches jaunes] dans la suspension).
- Aspirer soigneusement le surnageant, remettre la pastille en suspension dans un milieu de croissance des cellules endothéliales (tableau des matériaux) et la transférer dans un tube propre de 2 mL. Ajouter 2 μL d’IFNγ (100 U/mL) dans le tube et plaquer les cellules sur un puits d’une plaque de 6 puits. Incuber les cellules à 33 °C.
- Après 3 jours de culture, changez soigneusement le milieu en pipetant 1 mL du milieu et en le remplaçant par 1 mL de milieu frais. A ce stade, les cellules sont hétérogènes avec un mélange de cellules glomérulaires (Figure 4G).
REMARQUE : Dans la culture en croissance, il y aura un mélange de cellules glomérulaires et de billes magnétiques (Figure 4G). Notez que toutes les cellules doivent montrer des mitochondries vertes et fluorescentes. - Après 7 jours de culture, aspirer complètement le milieu et le remplacer par un nouveau milieu de croissance cellulaire endothéliale de 2 mL complété par de l’IFNγ (100 U/mL). À ce stade, les cellules commencent à proliférer mais sont encore hétérogènes (Figure 4A).
- Après 10 jours de culture lorsque les cellules atteignent ~80% de confluence, faire passer les cellules à l’aide de trypsine comme décrit à l’étape 5.1 puis les transférer dans une fiole T25 recouverte de collagène IV.
- Après 1 semaine (total ~21 jours de culture), faire passer les cellules dans une fiole T75 recouverte de collagène IV.
4. Préparation des billes pour l’isolement des cellules endothéliales
- Commencez par enduire les billes anti-rats de mouton d’un anticorps anti-souris CD31 3,18,19. Utiliser 10 μL de billes pour chaque fiole T75.
- Laver 10 μL de billes 3x avec 200 μL de 1x PBS supplémenté avec 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% pénicilline/streptomycine. Placez le tube dans l’aimant du concentrateur pour pipeter le tampon de lavage à chaque fois.
- Remettez les billes en suspension dans 200 μL de PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% pénicilline/streptomycine. Ajouter 4,8 μL d’anticorps CD31 anti-souris de rat 7,18,19, placer le tube sur un agitateur horizontal et mélanger doucement pendant 1 h à température ambiante, puis maintenir le tube à 4 °C pendant la nuit.
5. Isoler les cellules endothéliales glomérulaires avec des billes enrobées de CD31
- Ajouter 3 mL de trypsine à 0,25 % dans une fiole T75 et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine avec 3 mL de milieu de croissance endothéliale, transférer les cellules dans un tube de 15 mL, puis centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et laver les cellules dans 1 mL de PBS contenant 1% de BSA, 2 mM d’EDTA, 1% de pénicilline / streptomycine. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Remettez la pastille en suspension dans 200 μL de billes enduites préparées à l’étape 4 et ajoutez 800 μL de PBS contenant 1 % de BSA, 2 mM d’EDTA et 1 % de pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules pendant 45 min en agitant en continu à 37 °C, 5% de CO2.
- Placez le tube dans le concentrateur magnétique et lavez les cellules 4x avec 1x PBS contenant 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% pénicilline/streptomycine. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu de croissance endothéliale supplémenté avec 100 U/mL d’IFNγ.
- Plaque de 1,5 mL de cellules/puits dans des puits recouverts de collagène IV sur une plaque de 6 puits. Culture des cellules dans des conditions permissives à 33 °C.
NOTE: Les cellules isolées expriment le virus simien 40 (SV40) grand antigène T tsA58, permettant l’activation de la prolifération continue à 33 °C (condition permissive). - Après 4 jours en culture, retirer 750 μL du milieu et le remplacer par le même volume de milieu frais additionné de 100 U/mL d’IFNγ.
- Après 10 jours à 14 jours de culture, vérifier la croissance de colonies de GEC positifs CD31 (Figure 4C) qui expriment des mitochondries fluorescentes à l’aide d’un microscope à épifluorescence muni d’un filtre de 488 nm.
- Après 21 jours de culture, les cellules peuvent avoir atteint 80% à 90% de confluence; les transférer dans une fiole T25. Après avoir atteint la confluence, les cellules peuvent être maintenues avec un milieu de croissance RPMI et 10% FCS.
REMARQUE : Avant d’atteindre la confluence, les cellules peuvent sembler hétérogènes (Figure 4B). Cependant, une fois qu’ils sont confluents, ils acquièrent une morphologie pavée. - À ce stade, les cellules pourraient être cryoconservées. Lorsque la confluence atteint 80 %, ajouter 3 mL de trypsine à 0,25 % aux cellules et les incuber à 37 °C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu de croissance complété par 10% FBS.
- Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu de congélation (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquote les cellules dans des cryotubes et les stocker à la température de la vapeur d’azote liquide.
6. Cultiver les mitoDendra2-GEC
- Décongeler les cellules de la cryoaliquote, à partir de l’étape 5.10, dans un bain-marie à 37 °C et les transférer dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu de croissance endothéliale préchauffé.
- Centrifuger la suspension à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le milieu et transférer la pastille dans le ballon de culture cellulaire T25 cm2 enduit de collagène IV avec un milieu de croissance cellulaire endothéliale préchauffé complété par 100 U/mL d’IFNγ et incuber à 33 °C.
- Changez le support le lendemain. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 70% à 80%, généralement après 5 jours, transférez-les dans une fiole de culture cellulaire T75 cm2 .
- Pour différencier les cellules du phénotype endothélial, transférer les cellules dans des conditions non permissives à 37 °C dans un milieu de croissance sans IFNγ.
7. Passage des mitoDendra2-GECs
- Retirer le milieu, laver les cellules avec du PBS et ajouter 3 mL de solution tiède trypsine-EDTA à 0,25 % (T75 cm2 flacons), incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Lorsque les cellules sont détachées, ajouter 5 mL de milieu de croissance et pipeter de haut en bas. Centrifuger la suspension à 200 x g pendant 5 min à température ambiante et transférer les cellules dans une nouvelle fiole ou plaque revêtue de collagène IV.
REMARQUE: La réussite doit être effectuée une fois par semaine dans un rapport de 1:4.
8. Caractérisation des mitoDendra2-GEC
- Effectuer une coloration par immunofluorescence de CD31 sur des cellules différenciées 7,18,19,20 (Figure 4D). Utilisez d’autres marqueurs tels que vWF et Isolectin-B4 ainsi que20.
- Pour confirmer la spécificité mitochondriale de Dendra2, marquez les cellules avec des marqueurs mitochondriaux spécifiques en incubant les cellules dans un milieu de croissance contenant 100 nM de tracker mitochondrial pendant 30 min à 37 °C, 5% CO2.
- Retirez le milieu et lavez doucement les cellules avec un milieu préchauffé sans rouge de phénol pour effectuer une imagerie en direct.
NOTE: Alternativement, les cellules peuvent être fixées à l’aide de fixateurs de formaldéhyde (4%) pendant 30 minutes, suivies d’un lavage plusieurs fois dans du PBS. Les cellules fixes peuvent être stockées à 4 °C dans 1x PBS jusqu’à utilisation. Une confirmation par cytométrie de flux est également possible : cellules de marquage avec anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. Les GEC devraient être négatifs pour les marqueurs podocytaires (synaptopodine, Nphs1, Podxl), les marqueurs cellulaires mésangiaux (PDGFRβ, angiotensinogène) et les marqueurs cellulaires tubulaires (aquaporine, aminopeptidase-N). Ces marqueurs servent de témoins négatifs. En raison de l’expression Dendra2 mitochondriale spécifique de ces cellules, évitez d’utiliser le canal FITC.
9. Imagerie cellulaire vivante des changements structurels des mitochondries en réponse au stress oxydatif ou à une glycémie élevée
- Plaque 1 x 105 GEC sur un plat à fond de verre de 35 mm recouvert de collagène IV à l’aide d’un milieu de croissance des cellules endothéliales (tableau des matériaux). Après 24 h, passer à milieu sans rouge de phénol. Les cellules ont des mitochondries vertes et fluorescentes.
- Régler la chambre environnementale à 37 °C, 5 % d’humidité et 5 % de CO2 1 h avant le début de l’expérience.
- Sous un microscope confocal, utilisez un objectif 40x/1,2 W pour ajuster la mise au point et sélectionner la région d’intérêt. Incuber les cellules avec 2 ml de glucose de 5 mM ou 25 mM pendant 60 min.
- Exposer les cellules à un laser de 405 nm (4% de puissance laser) pour photoconvertir une sous-population de mitochondries du vert au rouge (Figure 5A-B, D-E).
- Utilisez le laser 561 nm pour exciter Dendra2 à l’état non converti afin de visualiser la fluorescence rouge. Voir le protocole de commutation photo détaillé tel que décrit précédemment16. Les événements de fusion apparaissent sous forme de fluorescence jaune après plusieurs minutes en raison de la fusion de la matrice verte et de la matrice rouge (Figure 4C, F).
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Representative Results
Dans cet article, un protocole détaillé pour l’isolement de cellules endothéliales glomérulaires immortalisées sous condition avec des mitochondries fluorescentes stables (mitoDendra2-GECs) est décrit (Figure 1). L’utilisation de jeunes souris âgées de 6 à 10 semaines est essentielle pour obtenir un nombre important de cellules saines. Après 3 jours de culture, les cellules commencent à croître lentement à partir des glomérules isolés, comme le montre la figure 3G. Après 7 jours, les cellules sont hétérogènes, montrant d’autres types de cellules glomérulaires, telles que les podocytes, les cellules épithéliales pariétales et les cellules mésangiales (Figure 4A). Après avoir atteint une confluence de 70 % à 80 %, d’autres cellules glomérulaires ont été retirées à l’aide d’une sélection positive de cellules endothéliales avec des billes magnétiques marquées CD31 (Figure 4B-C). Les mitoDendra2-GECs exprimaient CD31 (figure 4D) et étaient négatives pour le marqueur podocyte, comme le montre la coloration négative à la synaptopodine (figure 4E-F).
La caractéristique mitochondriale fluorescente dans les mitoDendra2-GECs permet d’étudier la morphologie des mitochondries dans diverses conditions in vitro. Ici, nous avons testé l’effet d’une glycémie élevée (25 mM) sur la structure mitochondriale des mitoDendra2-GECs (Figure 5D-F). Par rapport aux mitochondries allongées visibles dans les cellules sous glucose normal (5mM; Figure 5A-C), fragmentation ou fission élevée des mitochondries induite par le glucose observée par les mitochondries proéminentes en forme de sphéroïde (Figure 5E). De plus, nous avons utilisé un laser de 405 nm pour photoconvertir une sous-population sélectionnée de mitochondries en un seul mitoDendra2-GEC vivant (Figure 5A,D). Dans les figures 5B et 5E, la photo-commutation réussie des mitochondries du vert (488 nm) au rouge (561 nm) dans la zone sélectionnée est présentée. Fait important, il a permis d’assister aux événements de fusion dans les mitoDendra2-GEC cultivés sous glucose normal, comme on peut l’observer par la fluorescence verte et rouge fusionnée jaune à la suite de la fusion de la matrice mitochondriale (Figure 5C). En revanche, dans le mitoDendra2-GEC traité à haute teneur en glucose, les mitochondries étaient fragmentées et étaient principalement rouges (Figure 5F), ce qui suggère que, dans le laps de temps testé, les événements de fission / fusion ont été retardés ou inhibés en raison des dommages causés par le traitement à haute teneur en glucose, ce qui est cohérent avec les rapports précédents18,19.
Figure 1 : Description représentative de l’isolement murin du GEC. Le diagramme représente les étapes significatives de l’isolement du GEC, en commençant par la perfusion du cœur de souris avec des billes magnétiques pour isoler les glomérules rénaux, la digestion de la collagénase, la culture de cellules glomérulaires et, enfin, la purification de GEC à l’aide de billes enrobées de CD31. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Description du curage rénal. Image représentative de tous les instruments chirurgicaux stériles nécessaires à la dissection. Des ciseaux (a) sont nécessaires pour ouvrir la peau de la souris, et une paire séparée de ciseaux (b, c) est nécessaire pour isoler le rein. Une pince à épiler (d) et (e) est nécessaire pour maintenir la peau. Une pince à épiler (f) est nécessaire pour recueillir le rein disséqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Description de la récolte des glomérules. (A) Perfuser le ventricule gauche avec la solution de billes HBSS à l’aide d’une seringue de 20 mL. Perforer la veine cave inférieure avec une aiguille de 19 G. (B) Après perfusion, retirez la graisse du rein et coupez-la en morceaux de 1 mm. (C) Digérer le tissu avec la collagénase de type II. D) Après digestion et centrifugation, trois couches sont formées; Les perles portant les glomérules sont dans la couche médiane, comme indiqué par la flèche noire. E) Séparer les billes isolées portant les glomérules à l’aide du concentrateur magnétique. (F) Image représentative de glomérules fraîchement isolés. (G) Croissance de cellules à partir de glomérules isolés après 3 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Essai mitochondrial in vitro. (A) Cellules glomérulaires après 3 jours de culture. (B) GEC après 7 jours. (D) Purification de GEC avec des billes marquées CD31. Imagerie microscopique de la coloration CD31. (E) Les GEC sont négatifs pour la synaptopodine. (F) Podocytes colorés à la synaptopodine (488 nm, fluorescence verte) comme témoin négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Imagerie microscopique de la fusion mitochondriale fluorescente in vitro. Les images ont été acquises avec un microscope confocal utilisant un objectif d’eau 40x. (A-B) La zone sélectionnée (cercle rouge) a été éclairée avec une ligne de 405 nm (4% de puissance laser) pour 300 itérations de blanchiment à une vitesse de 6,3-12,61 / pixel, comme décrit précédemment16. (A-C) Cellules dans les milieux de croissance contenant 5 mM de glucose; La fluorescence verte (488 nm) montre des mitochondries saines. (B, E) Les mitochondries ont été photo-commutées en rouge (567 nm). (C) La fluorescence jaune détecte un événement de fusion active de GEC traité avec 5mM de glucose. (D) Les cellules ont été traitées avec une glycémie élevée de 25 mM pendant 30 min. La fluorescence verte montre des mitochondries fragmentées et (E) une partie qui a été photo-commutée en rouge. (F) La figure montre une diminution de l’événement de fusion comme le montre la fluorescence jaune réduite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les mitochondries sont essentielles au métabolisme cellulaire, à l’homéostasie et aux réponses au stress, et leur dysfonctionnement est lié à de nombreuses maladies, y compris les maladies rénales. Les mitochondries jouent un rôle dans la génération pathologique d’espèces réactives excessives de l’oxygène (ROS), la régulation des niveaux de calcium intracellulaire, les voies de mort cellulaire et la dynamique cytosquelettique21,22,23.
L’isolement des GEC murins est difficile en raison de leur petit nombre, de leur taille, de leurs facteurs matriciels et de leur nature interdépendante avec d’autres cellules glomérulaires essentielles à leur survie. Le présent article présente un protocole détaillé pour l’isolation GEC de souris. Plus précisément, nous avons utilisé des souris transgéniques comme outil pour obtenir des lignées cellulaires immortalisées sous condition à fort potentiel de prolifération. Les souris transgéniques, exprimant le grand antigène T tsA58 du virus simien 40 (SV40), permettent l’activation d’une prolifération continue dans des conditions permissives à 33 °C et ont été croisées ici avec les souris excisées PHAM exprimant une fluorescence mitochondriale spécifique. Les souris doubles transgéniques ont offert un excellent outil pour étudier la structure des mitochondries. En effet, les souris excisées PHAM portent le vert Dendra2 mitochondrial spécifique (sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase), permettant la détection en direct de mitochondries fluorescentes et l’observation d’événements de fission et de fusion par photocommutation vert-rouge16.
Le protocole comprend trois étapes importantes : l’extraction des glomérules à l’aide de billes, la prolifération des cellules glomérulaires et la purification ultérieure de la GEC à l’aide de billes CD31 une fois les cellules en culture. L’utilisation d’une seule digestion avec de la collagénase est suffisante pour isoler les cellules gmammaires. D’autres protocoles utilisent une deuxième digestion avec l’ADN et la protéinase24. Cependant, nous avons remarqué de meilleurs rendements cellulaires avec une seule étape de digestion. L’ADN peut rester active et ralentir la prolifération des cellules. De plus, le GEC pourrait être isolé par tamisage différentiel comme décrit précédemment20, ce qui n’est pas toujours facile lorsque l’on utilise des reins de souris.
Il est crucial d’autoclaver tous les outils chirurgicaux avant de commencer l’isolement des reins et des glomérules pour éviter la contamination. De plus, il est important de filtrer et de compléter les solutions avec des antibiotiques pour éliminer toute source de contaminants. En effet, les infections à mycoplasmes peuvent provoquer une cytopathologie qui interfère par conséquent avec tous les paramètres mesurés en culture cellulaire25.
L’isolement des glomérules repose sur la perfusion intra-cardiaque des billes. Certes, une perfusion lente avec 20 ml de 1x billes contenant du HBSS est essentielle pour récolter un grand nombre de glomérules. Les billes seront piégées dans les glomérules, ce qui facilite leur purification à l’aide d’un concentrateur magnétique. Les billes peuvent être préparées et conservées à 4 °C jusqu’à 15 jours avant d’être utilisées pour faciliter la procédure expérimentale.
De plus, la digestion des glomérules avec agitation continue est cruciale pour dissocier un bon nombre de glomérules du rein. D’autre part, l’isolement des GEC murins est difficile en raison de leur petite taille et de la présence d’autres cellules glomérulaires. Par conséquent, l’isolement progressif des glomérules, la croissance de toutes les cellules glomérulaires en culture et l’utilisation ultérieure de billes enrobées de CD31 pour purifier les cellules endothéliales sont essentiels, en particulier pour obtenir un nombre plus important de GEC viables et conditionnellement prolifératifs. Néanmoins, la validation de la pureté des cellules avec immunomarquage et cytométrie de flux est nécessaire.
En outre, le protocole décrit la caractérisation du phénotype GEC et le test de fusion/fission des mitochondries in vitro. Les mitoDendra2-GECs sont un excellent outil pour étudier les réponses cellulaires des mitochondries GEC à différents stimuli in vitro sans avoir besoin de transfection ou de coloration.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le professeur Cijiang He et le Dr Fu Jia pour leurs connaissances sur l’isolement des cellules endothéliales chez la souris et remercient le professeur Mone Zaidi d’avoir fourni les sourisexcisées PhAM et des discussions précieuses. Les auteurs aimeraient également remercier le CORE de microscopie de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï et le personnel pour les conseils que nous avons reçus. Ce travail a été soutenu par des subventions de la subvention R01DK097253 des National Institutes of Health et de la subvention CDMRP E01 W81XWH2010836 du ministère de la Défense à I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
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