Summary
Detta protokoll beskriver optimeringen av experimentella parametrar vid användning av transesofageal förmakspacing för att bedöma förmaksflimmerkänslighet hos möss.
Abstract
Musmodeller av genetiska och förvärvade riskfaktorer för förmaksflimmer (AF) har visat sig vara värdefulla för att undersöka de molekylära determinanterna för AF. Programmerad elektrisk stimulering kan utföras med hjälp av transesofageal förmakspacing som ett överlevnadsförfarande, vilket möjliggör seriell testning på samma djur. Det finns dock många pacingprotokoll, vilket komplicerar reproducerbarheten. Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en standardiserad strategi för att utveckla modellspecifika experimentella parametrar för att förbättra reproducerbarheten mellan studier. Preliminära studier utförs för att optimera de experimentella metoderna för den specifika modellen som undersöks, inklusive ålder vid tidpunkten för studien, kön och parametrar för pacingprotokollet (t.ex. pacingläge och definition av AF-känslighet). Det är viktigt att man är noga med att undvika höga stimulansenergier, eftersom detta kan orsaka stimulering av ganglionisk plexi med oavsiktlig parasympatisk aktivering, manifesterad av överdrivet atrioventrikulärt (AV) block under pacing och ofta förknippat med artefaktisk AF-induktion. Djur som påvisar denna komplikation måste uteslutas från analysen.
Introduction
Förmaksflimmer (AF) representerar en slutlig gemensam väg för flera förvärvade och genetiska riskfaktorer. För studier som undersöker de patofysiologiska mekanismerna hos AF-substratet är musmodeller fördelaktiga med tanke på den enkla genetiska manipulationen och det faktum att de i allmänhet reproducerar den AF-mottaglighet som observerats hos människor för olika kliniska fenotyper 1,2,3. Möss utvecklar emellertid sällan spontan AF4, vilket kräver användning av provocerande förmakspacingstudier.
Programmerad elektrisk stimulering (PES) kan utföras för att bedöma murin förmakselektrofysiologi och AF-känslighet med antingen intrakardiell5 eller transesofageal6 pacing. Medan transesofagealt tillvägagångssätt är särskilt fördelaktigt som ett överlevnadsförfarande, kompliceras dess användning av de många publicerade experimentella protokollen 7,8 och variabilitetskällor som kan hindra reproducerbarhet9. Dessutom gör begränsade rapporterade protokolljämförelser det svårt att välja ett lämpligt pacingprotokoll.
Det nuvarande protokollet syftar till att använda en systematisk strategi för att utveckla modellspecifika transesofageala PES-metoder för att bedöma murin AF-känslighet för att öka reproducerbarheten. Det är viktigt att initiala pilotstudier utförs för att optimera pacingprotokollet genom att ta hänsyn till variationer i ålder, kön och pacingläge, med pacing utformad för att minimera oavsiktlig parasympatisk stimulering som kan förvirra resultat9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta förfarande godkändes av Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee och överensstämmer med guiden för vård och användning av laboratoriedjur. Protokollet utvecklades med hjälp av både genetiska9 och förvärvade10 (t.ex. hypertoni) musmodeller av AF-känslighet. Operatören var blindad för fenotypen hos musen som studerades.
1. Val av djur
- För genetiska modeller, utsätt möss för varannan vecka (dvs. varannan vecka) förmakstempo enligt beskrivningen nedan (se steg 6.) för att bestämma den optimala perioden av AF-mottaglighet.
- Börja varannan vecka pacing vid 8 veckors ålder. Använd kullkamrater av vild typ som kontroller för att minska variationen. Studera båda könen, eftersom man kanske inte utvecklar en AF-fenotyp9.
- För förvärvade modeller, utför pacing efter att möss uppnått fysisk mognad (~ 12 veckors ålder)10. Som nämnts ovan, studera båda könen.
- Under dessa förstudier, utför både burst pacing8 (med en fast pacing cykellängd [CL]) och decremental pacing7 (med en progressivt kortare pacing CL) för att bestämma det optimala pacing läget. Separera varje procedur med minst 24 timmar.
OBS: När ett ökande antal möss studeras, granska de ackumulerade data för att bestämma det optimala ålders-, köns- och pacingläget som främjar AF hos AF-mottagliga möss men inte kontroller.- Analysera data med hjälp av flera definitioner av AF-mottaglighet (t.ex. antal AF-episoder8, total AF-varaktighet 9, AF-incidens4 och ihållande AF-incidens, vanligtvis definierad som 10 s 11 eller 15 s 12, och till och med upp till 5 min13,14) eftersom vissa modeller kan visa en AF-fenotyp för en men inte alla definitioner9.
OBS:Definitionen av en AF-episod och AF-mottaglighet skiljer sig åt mellan publicerade studier 4,7. AF-episoder8 definieras vanligtvis som snabb förmaksaktivitet med ett oregelbundet oregelbundet ventrikulärt svar som uppträder under minst 1 sekunder (figur 1). Förutom AF kan förmakspacing också inducera förmaksfladder med antingen ett regelbundet eller oregelbundet ventrikulärt svar.
- Analysera data med hjälp av flera definitioner av AF-mottaglighet (t.ex. antal AF-episoder8, total AF-varaktighet 9, AF-incidens4 och ihållande AF-incidens, vanligtvis definierad som 10 s 11 eller 15 s 12, och till och med upp till 5 min13,14) eftersom vissa modeller kan visa en AF-fenotyp för en men inte alla definitioner9.
- Använd de optimerade modellspecifika parametrarna och definitionen av AF-känslighet för efterföljande studier på ytterligare möss.
2. Beredning av djur
- Bedöva musen i en induktionskammare med 3% isofluran (se materialtabell) i 1 l / min 100% syre.
OBS: Isofluran är skadligt. Det kan irritera huden eller ögat och kan orsaka yrsel, trötthet och huvudvärk, bland andra toxiciteter i centrala nervsystemet. Använd i ett väl ventilerat område med en lämplig rensningsmetod (t.ex. behållare med aktivt kol). - Efter förlusten av pedalreflexen, placera musen i ryggläge på en värmedyna som är utformad för att hålla kroppstemperaturen vid cirka 37 °C med bakbenen tejpade på dynans yta.
- Applicera smörjande ögonsalva på ögonen för att förhindra torkning.
- Placera en bedövningsmask ordentligt över musens näsa. Börja underhålla anestesi med 1% isofluran i 1 l / min av 100% syre. Se till att näsborrarna är fria från hinder eftersom möss är obligatoriska näsandning.
- Få ett ytelektrokardiogram (EKG, bly I) genom subkutan placering av 27 G EKG-nålelektroder (se materialtabell) anslutna till en biologisk förstärkare och datainsamlingshårdvara i frambenen. Jorda signalen genom att placera en nålelektrod i vänster bakben.
3. Kateter placering
- Ta kort bort isofluranmasken från musen.
- Sätt in en 2-F oktapolär elektrodkateter (elektrodbredd och avstånd = 0,5 mm) ansluten till en stimulator och stimulansisolator (se materialförteckning) i matstrupen (figur 2).
- Sätt in på ett djup som approximerar avståndet från munnen (med nacken utsträckt) till strax ovanför xiphoidbrosket.
- Placera isofluranmasken över musens näsborrar.
- Börja datainsamlingen med kontinuerlig registrering av EKG-ledning I med hjälp av analysprogramvara (se materialförteckning).
- Justera stimulansisolatorläget till bipolärt. Använd det distala elektrodparet under stimulering.
- Placera katetern ordentligt i matstrupen för att möjliggöra infångning. För att göra det, applicera en 1,5 mA stimulans med en pulsbredd på 2 ms vid en CL som är något kortare än sinus CL (använd t.ex. en CL på 100 ms om sinus CL är 120 ms). Placera katetern försiktigt tills konsekvent förmaksfångst erhålls.
4. Fastställande av tröskelvärde
- För att bestämma den förmaksdiastoliska infångningströskeln (TH), initiera pacing vid 1,5 mA med en pulsbredd på 2 ms vid CL som används för förmaksfångst. Minska stimulansamplituden med 0,05 mA steg tills förlusten av förmaksfångst, med efterföljande ökning tills fångst.
OBS: Den lägsta amplituden vid vilken konsekvent förmaksfångst erhålls är förmaks-TH. På grund av oro för parasympatisk stimulering vid höga stimulansamplituder, vilket återspeglas av överdrivet AV-block under pacing med artefaktisk AF-induktion9, är den maximala acceptabla TH 0,75 mA. Placera vid behov om katetern för att uppnå en TH ≤0,75 mA. - Justera stimulansamplituden till två gånger TH.
5. Bestämning av elektrofysiologiska egenskaper
- Mät elektrofysiologiska parametrar, inklusive sinusnodens återhämtningstid (SNRT), Wenckebach-cykellängd (WCL) och atrioventrikulär effektiv eldfast period (AVERP) före snabb förmakshastighet för AF-induktion15.
6. Mottaglighet för förmaksarytmi
- Utför pacing vid två gånger TH med en pulsbredd på 2 ms med antingen burst pacing vid olika CLs eller decremental pacing enligt bestämd från inledande studier (steg 1.1.-1.4.).
- För burst-tempo, takt vid en initial CL på 50 ms i 15 s med efterföljande tåg som inträffar vid CLs på 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms och 15 ms 8,10. Pausa tempot i 30 s efter varje tempotåg för att möjliggöra återhämtning innan du fortsätter. Om AF inträffar efter ett pacingtåg, vänta i 30 s efter avslutning innan du fortsätter med efterföljande pacing.
- För sjunkande tempo, takt vid en CL på 40 ms och minska CL med 2 ms varannan s tills terminering vid 20 ms7. Utför tempotåg i tredubbla16 ellerfemdubbla 17, med en paus på 30 s för återhämtning efter varje tåg. Som ovan, om AF utvecklas, vänta i 30 s efter uppsägning innan du fortsätter.
OBS: När du optimerar protokollparametrar under preliminära experiment (dvs. steg 1.1.-1.5.), utför decremental pacing med fem tåg. Gör en post hoc-analys för att avgöra om tre eller fem tåg ger störst känslighet. - Avsluta proceduren vid 30 s sinusrytm efter det sista tempotåget eller efter en 10 minuters episod av AF, beroende på vilket som kommer först.
7. Efter förfarandet
- Stoppa datainsamlingen.
- Ta försiktigt bort kateter och EKG-elektroder.
- Sluta anestesi.
- Placera den bedövade musen i en bur och observera i 10 minuter för att säkerställa återhämtning.
- Spara datafilen. Vid seriell testning, vänta i minst 24 timmar innan du upprepar pacingproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transesofageala förmakspacingstudier bedömer de elektrofysiologiska egenskaperna hos SA- och AV-noderna genom att bestämma SNRT och AVERP, liksom AF-känslighet6 (Figur 1). EKG-inspelning möjliggör mätningar av P-vågvaraktighet, PR-intervall, QRS-varaktighet och QT/QTc-intervall. Kontinuerlig inspelning av EKG under snabb förmakstakt kan ge följande mätningar av AF-sårbarhet: antalet episoder som induceras under studien, kumulativ och genomsnittlig varaktighet av episoderna och antalet ihållande AF-episoder. Episoder av överdrivet AV-block under pacing kan visa perioder av pacinginducerad parasympatisk stimulering (figur 3), vilket indikerar att den associerade AF är en artefakt av detta fenomen snarare än patofysiologin hos själva modellen9.
Figur 1: Representativa resultat av förmakstempo. Yt-EKG-inspelningar som visar (A) sinusrytm och (B) förmaksflimmer efter snabb förmakstakt. Tempohastigheten överstiger Wenckebach CL, vilket resulterar i förlust av 1: 1 AV-nodledning under pacing. Baslinjeartefakten är relaterad till musandning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visuell representation av transesofagealkatetern och dess närhet till ganglionic plexi. (A) Ett fotografi som visar den 2-F oktapolära katetern. (B) Skildring av kateterns närhet till den bakre vänstra förmaks ganglioniska plexi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa resultat av överdrivet AV-block under snabb förmakstakt. Yt-EKG-inspelningar som visar förmakstemporytm med (A) och utan (B) överdrivet AV-block som kan uppstå under förmakstempo, särskilt under pacing med högre stimulansintensitet och vid korta CLs. Röda pilar betecknar QRS-komplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transesofageal förmakspacing tillåter inte bara seriella studier på samma djur, utan dess varaktighet är vanligtvis kortare än intrakardiella studier (~ 20 min), vilket minimerar anestesianvändning och dess effekter på elektrofysiologiska parametrar.
Det är viktigt att optimera metoderna initialt för varje enskild musmodell. Åldrande ökar AF-inducerbarheten hos normala möss18,19, och enskilda genetiska modeller kan visa AF-inducerbarhet under en begränsad tidsperiod. Att utföra pilotstudier varannan vecka kan bestämma ett åldersfönster under vilket AF-fenotypmusen är inducerbar men kontrollmöss inte är det. Kön kan vara en avgörande faktor, eftersom antingen ett eller båda könen kan visa inducerbar AF9. Dessutom kan specifika möss visa AF-känslighet som svar på endast en typ av pacing-läge, medan andra visar AF-känslighet för ett annat läge eller för flera lägen9.
Under snabb förmakshastighet kan möss uppleva överdrivet AV-block som ofta sammanfaller med AF-induktion. Detta fenomen orsakas av oavsiktlig stimulering av ganglionisk plexi som ligger på det bakre vänstra atriumet, vilket resulterar i parasympatisk aktivering9. Betydande AV-block definieras som ventrikulär bradykardi som varar ≥ 10% av ett enda tempotåg och påträffas oftast vid pacing med höga stimulansintensiteter och vid korta tempo CLs. Denna typ av arytmiinduktion ökar förekomsten av AF hos kontrollmöss och orsakar större arytmivariation inom en experimentell grupp. Med tanke på dessa förorenande egenskaper måste djur som upplever AF under dessa förhållanden uteslutas från analysen.
Skulle djupgående AV-block uppstå under pacing trots TH ≤0,75 mA är det rimligt att minska tempoamplituden till 1,5x TH7. Dessutom, om en AF-fenotyp inte observeras under preliminära experiment, är det tänkbart att försöka igen med 10 ms som den lägsta pacing CL16. Om en AF-fenotyp inte observeras vid 12 veckors ålder för en förvärvad modell, överväga preliminära studier varannan vecka för att undersöka effekterna av ökande fenotypmognad20.
En begränsning av detta tillvägagångssätt är användningen av isoflurananestesi. Isofluran är känt för att undertrycka autonom funktion21, och denna effekt kan inte uteslutas trots en relativt kort exponering. Detta protokoll representerar den första detaljerade rapporten om en optimerad strategi för att utveckla transesofageala PES-metoder hos möss. Medan denna studie fokuserar på AF-mottaglighet, kan framtida tillämpningar av detta protokoll användas för att bedöma ventrikulära arytmier22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Figur 2 skapades med BioRender.com. Detta arbete stöddes av bidrag från National Heart, Lung, and Blood Institute vid National Institutes of Health (HL096844 och HL133127); American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 och 903918 [MBM]); och National Center for Advancing Translational Sciences vid National Institute of Health (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
