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Bioengineering

सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन प्रदर्शित करने वाले बाहरी झिल्ली पुटिकाओं पर आधारित एक "प्लग-एंड-डिस्प्ले" नैनोपार्टिकल वैक्सीन प्लेटफॉर्म

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/64213
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल बाहरी झिल्ली पुटिकाओं के बायोइंजीनियरिंग को "प्लग-एंड-डिस्प्ले" वैक्सीन प्लेटफॉर्म के रूप में वर्णित करता है, जिसमें उत्पादन, शुद्धिकरण, बायोकोन्जेशन और लक्षण वर्णन शामिल हैं।

Abstract

बैक्टीरिया या वायरस से प्राप्त बायोमिमेटिक नैनोकणों ने वैक्सीन अनुसंधान और विकास में पर्याप्त रुचि आकर्षित की है। बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (ओएमवी) को मुख्य रूप से औसत विकास के दौरान ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया द्वारा स्रावित किया जाता है, जिसमें नैनो-आकार का व्यास और स्व-सहायक गतिविधि होती है, जो वैक्सीन वितरण के लिए आदर्श हो सकती है। ओएमवी ने प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और छोटे अणुओं के लिए एक बहुआयामी वितरण प्रणाली के रूप में कार्य किया है। ओएमवी की जैविक विशेषताओं का पूरा लाभ उठाने के लिए, बायोइंजीनियर्ड एस्चेरिचिया कोलाई-व्युत्पन्न ओएमवी का उपयोग वाहक के रूप में और सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) को एंटीजन के रूप में "प्लग-एंड-डिस्प्ले" वैक्सीन प्लेटफॉर्म बनाने के लिए किया गया था। स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस में स्पाईकैचर (एससी) और स्पायटैग (एसटी) डोमेन संयुग्मित ओएमवी और आरबीडी के लिए लागू किए गए थे। साइटोलिसिन ए (क्लाया) जीन को एससी जीन के साथ प्लास्मिड अभिकर्मक के बाद एक संलयन प्रोटीन के रूप में अनुवादित किया गया था, जिससे ओएमवी की सतह पर एक प्रतिक्रियाशील साइट बच गई थी। रात भर एक पारंपरिक बफर सिस्टम में आरबीडी-एसटी को मिलाने के बाद, ओएमवी और आरबीडी के बीच सहसंयोजक बंधन का गठन किया गया था। इस प्रकार, एक मल्टीवेलेंट-डिस्प्लेिंग ओएमवी वैक्सीन हासिल की गई थी। विभिन्न एंटीजन के साथ प्रतिस्थापित करके, ओएमवी वैक्सीन प्लेटफॉर्म कुशलतापूर्वक विभिन्न विषम एंटीजन प्रदर्शित कर सकता है, जिससे संभावित रूप से संक्रामक रोग महामारियों को तेजी से रोका जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ओएमवी वैक्सीन प्लेटफॉर्म के निर्माण के लिए एक सटीक विधि का वर्णन करता है, जिसमें उत्पादन, शुद्धिकरण, बायोकोन्जेशन और लक्षण वर्णन शामिल हैं।

Introduction

एक संभावित वैक्सीन प्लेटफॉर्म के रूप में, बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (ओएमवी) ने हालके वर्षों में अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित किया है। ओएमवी, मुख्य रूप से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया3 द्वारा स्वाभाविक रूप से स्रावित होते हैं, गोलाकार नैनोस्केल कण होते हैं जो लिपिड बाइलेयर से बने होते हैं, आमतौर पर 20-300 एनएम4 के आकार में। ओएमवी में विभिन्न पैतृक जीवाणु घटक होते हैं, जिनमें जीवाणु एंटीजन और रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) शामिल हैं, जो ठोस प्रतिरक्षा शक्तिकारकके रूप में काम करते हैं। अपने अद्वितीय घटकों, प्राकृतिक पुटिका संरचना और महान आनुवंशिक इंजीनियरिंग संशोधन साइटों से लाभान्वित होकर, ओएमवी को कई बायोमेडिकल क्षेत्रों में उपयोग के लिए विकसित किया गया है, जिसमें बैक्टीरियल वैक्सीन6, एडजुवेंट7, कैंसर इम्यूनोथेरेपी ड्रग्स8, ड्रग डिलीवरी वैक्टर9 और एंटी-बैक्टीरियल चिपकने वाला10 शामिल हैं।

सार्स-सीओवी-2 महामारी, जो 2020 से दुनिया भर में फैली है, ने वैश्विक समाज पर भारी असर डाला है। स्पाइक प्रोटीन (एस प्रोटीन) में रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एसीई 2) के साथ बंध सकता है, जो तब सेल11,12,13 में वायरस के प्रवेश की मध्यस्थता करता है। इस प्रकार, आरबीडी वैक्सीन की खोज के लिए एक प्रमुख लक्ष्य प्रतीत होता है 14,15,16। हालांकि, मोनोमेरिक आरबीडी खराब इम्युनोजेनिक है, और इसका छोटा आणविक भार प्रतिरक्षा प्रणाली को पहचानना मुश्किल बनाता है, इसलिए सहायक दवाओं की अक्सर आवश्यकता होतीहै।

आरबीडी की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने के लिए, पॉलीवेलेंट आरबीडी प्रदर्शित करने वाले ओएमवी का निर्माण किया गया था। आरबीडी प्रदर्शित करने के लिए ओएमवी का उपयोग करने वाले मौजूदा अध्ययन आमतौर पर बैक्टीरिया18 में व्यक्त किए जाने वाले ओएमवी के साथ आरबीडी को फ्यूज करते हैं। हालांकि, आरबीडी एक वायरस-व्युत्पन्न प्रोटीन है, और प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति इसकी गतिविधि को प्रभावित करने की संभावना है। इस समस्या को हल करने के लिए, स्पाइटैग (एसटी)/स्पाईकैचर (एससी) प्रणाली, जो स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस से प्राप्त होती है, का उपयोग पारंपरिक बफर सिस्टम19 में ओएमवी और आरबीडी के साथ सहसंयोजक आइसोपेप्टाइड बनाने के लिए किया गया था। एससी डोमेन को साइटोलिसिन ए (क्लायए) के साथ बायोइंजीनियर्ड एस्चेरिचिया कोलाई द्वारा एक संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया गया था, और एसटी को एचईके 293 एफ सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से आरबीडी के साथ व्यक्त किया गया था। ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी को रात भर मिलाया गया और इनक्यूबेट किया गया। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन या आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्धिकरण के बाद, ओएमवी-आरबीडी प्राप्त किया गया था।

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Protocol

1. प्लास्मिड निर्माण

  1. पहले प्रकाशित रिपोर्ट20 के बाद प्लास्मिड pThioHisa ClyA-SC के निर्माण के लिए BAMH I और Sal I साइटों के बीच एक एम्पीसिलीन-प्रतिरोधी pThioHisa-ClyA प्लास्मिड (सामग्री की तालिका देखें) में डीएनए एन्कोडिंग SpyCatcher अनुक्रम (पूरक फ़ाइल 1) डालें।
  2. पहले प्रकाशित रिपोर्ट 19 के बाद प्लास्मिड पीसीडीएनए 3.1 आरबीडी-एसटी के निर्माण के लिए बीएएमएच आई और इकोआर आई साइटों के बीच संश्लेषित स्पाईटैग-आरबीडी-हिस्टैग संलयन जीन (पूरक फाइल 1) को पीसीडीएनए 3.1 प्लास्मिड ( सामग्री की तालिका देखें) मेंविभाजित करें।

2. ओएमवी-एससी की तैयारी

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए CLYA-SC परिवर्तन करें।
    1. बीएल 21 सक्षम तनाव के 50 μL में pThioHisa ClyA-SC प्लास्मिड समाधान (50 ng/μL) का 5 μL जोड़ें, धीरे से झटका दें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा होने दें।
    2. 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 90 सेकंड के लिए घोल रखें, और फिर तुरंत 3 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रित घोल डालें।
    3. बैक्टीरियल सस्पेंशन में एलबी माध्यम का 500 μL जोड़ें और मिश्रण के बाद, 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम पर कल्चर करें।
    4. एम्पीसिलीन (100 μg / mL, सामग्री की तालिका देखें) युक्त एलबी एगर प्लेट पर सभी परिवर्तनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट करें।
      नोट: बाद के प्रयोगों में, एम्पीसिलीन को माध्यम में समान एकाग्रता पर रखा गया था। यदि नहीं, तो इससे बैक्टीरिया में प्लास्मिड का नुकसान हो सकता है।
  2. ओएमवी-एससी उत्पादन के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. प्लेट (चरण 2.1.4.) से 20 एमएल एलबी (एम्पीसिलीन-प्रतिरोधी) माध्यम और कल्चर से 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम पर रात भर एक एकल कॉलोनी को अलग करें।
    2. बैक्टीरियल समाधान (चरण 2.2.1 से) को 2 एल माध्यम में, 220 आरपीएम पर कल्चर, 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लघुगणकीय विकास चरण (ओडी600 एनएम 0.6 से 0.8 के बीच है) में टीका लगाएं।
    3. जब बैक्टीरियल समाधान के 600 एनएम पर ओडी 0.6-0.8 तक पहुंच जाता है, तो बैक्टीरिया के घोल की अंतिम एकाग्रता को 0.5 एमएम बनाने के लिए आइसोप्रोपिल बीटा-डी-थियोगलैक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और फिर रात भर 25 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम पर कल्चर करें।
  3. ओएमवी-एससी शुद्धिकरण करें।
    1. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 7,000 x g पर जीवाणु समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सुपरनैटेंट को 0.22 μm झिल्ली फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें, फिर इसे 100 kD अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली या खोखले फाइबर कॉलम का उपयोग करके केंद्रित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. 0.22 μm झिल्ली फ़िल्टर के माध्यम से एकाग्रता को फ़िल्टर करें, फिर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 2 घंटे के लिए 4 °C पर 150,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें), और एक पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    4. पीबीएस के साथ वर्षा को पुन: निलंबित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। समाधान -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक स्थिरता बनाए रख सकता है।

3. आरबीडी-एसटी तैयारी

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए आरबीडी-एसटी अभिकर्मक करें।
    1. एक उपयुक्त यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली (जैसे, एचईके 293 एफ) का चयन करें और वसूली के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 130 आरपीएम पर रात भर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    2. स्वचालित सेल काउंटर में एचईके 293 एफ सेल समाधान के 20 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें, एकाग्रता को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें, और फिर 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 130 आरपीएम पर कोशिकाओं को कल्चर करें।
    3. आरबीडी-एसटी प्लास्मिड को 0.22 μm झिल्ली फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, और सेल कल्चर माध्यम में 300 μg प्लास्मिड जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि अंतिम मात्रा 10 एमएल न हो; 10 सेकंड के लिए हिलाएं।
    4. पानी के स्नान में पीईआई (1 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें) को 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, 0.7 एमएल पीईआई को 9.3 एमएल सेल कल्चर माध्यम के साथ मिलाएं, और 10 सेकंड के लिए रुक-रुक कर हिलाएं।
      नोट: समाधान को जोर से न हिलाएं। अन्यथा, परिणामी बुलबुले अभिकर्मक दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं।
    5. पीईआई समाधान में प्लास्मिड समाधान जोड़ें, मिश्रण को 10 सेकंड के लिए रुक-रुक कर हिलाएं, और इसे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. मिश्रण को 280 एमएल सेल कल्चर माध्यम में जोड़ें और 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 130 आरपीएम पर कल्चर करें।
  2. आरबीडी-एसटी शुद्धिकरण करें।
    1. कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 6,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट एकत्र करने के लिए पिपेट का उपयोग करें।
    2. कॉलम को 2 एमएल नी-एनटीए अगारोस ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ भरें और इसे 3x PBS के साथ 3x धो लें।
    3. 20 mM की अंतिम सांद्रता बनाने के लिए सेल सुपरनैटेंट में इमिडाज़ोल ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और सेल सुपरनैटेंट 2x लोड करें।
    4. धोने के लिए 20 एमएम इमिडाज़ोल युक्त पीबीएस के 3 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) जोड़ें, और धोने के अंश को इकट्ठा करें।
    5. इमिडाज़ोल के कम से उच्च सांद्रता (जैसे, 0.3 एम, 0.4 एम, 0.5 एम) वाले पीबीएस के 3 सीवी के साथ ग्रेडिएंट इल्यूट; प्रत्येक एकाग्रता के लिए 2 गुना अधिक है।
    6. विभिन्न सांद्रता ग्रेडिएंट में आरबीडी-एसटी की पहचान करने के लिए एसडीएस-पेज21 का उपयोग करें।

4. ओएमवी-आरबीडी बायोकोन्जेशन और शुद्धिकरण

  1. बीसीए विधि द्वारा प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. मानक बीएसए प्रोटीन समाधान को 2 मिलीग्राम / एमएल से 0.0625 मिलीग्राम / एमएल तक क्रमिक रूप से पतला करें, शुद्ध ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी 10 एक्स को पतला करें, फिर बीसीए वर्किंग सॉल्यूशंस ए और बी (परख किट में प्रदान किया गया) को 50: 1 (वी / वी) के अनुपात में मिलाएं।
    2. पतला प्रोटीन समाधान (25 μL / अच्छी तरह से) जोड़ें और BCA कार्यशील समाधान (200 μL / अच्छी तरह से) के साथ मिलाएं; 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. प्रत्येक कुएं के 562 एनएम पर अवशोषण (ओडी) को मापें और मानक वक्र22 से प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी का बायोकॉन्जेशन करें।
    1. ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी को पीबीएस में 40: 1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अनुपात में मिलाएं।
    2. मिश्रण को रात भर 15 आरपीएम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण करने के लिए लंबवत रूप से घुमाएं।
      नोट: विभिन्न एंटीजन अलग-अलग अनुपात में प्रतिक्रिया कर सकते हैं। एंटीजन की विशेषताओं के आधार पर अलग-अलग प्रतिक्रिया अनुपात की कोशिश की जा सकती है।
  3. प्रतिक्रिया दक्षता की जाँच करें।
    1. ओएमवी-एससी, आरबीडी-एसटी और प्रतिक्रिया उत्पाद (चरण 4.2.) के 10 μL तैयार करें। 5x लोडिंग बफर का 2.5 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और नमूने को 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। नमूने को जेल में लोड करें (10 μL / 20 मिनट के लिए 60 वी पर वैद्युतकणसंचलन करें और 1 घंटे के लिए स्थिति को 120 वी में बदलें।
    2. प्रोटीन को जेल से पीवीडीएफ पश्चिमी सोख्ता झिल्ली में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें) 70 मिनट के लिए 100 वी पर।
    3. झिल्ली को 5% गैर वसा वाले पाउडर दूध / टीबीएसटी में डालें और 1 घंटे के लिए हिलाएं। फिर, 3x को TBST के साथ 5 मिनट के लिए हिलाने के साथ धो लें।
    4. झिल्ली को 0.1% हिस-टैग एंटीबॉडी / टीबीएसटी में डालें ( सामग्री की तालिका देखें) और 1 घंटे के लिए हिलाएं, फिर 3x को TBST के साथ 5 मिनट के लिए हिलाने के साथ धो लें।
    5. झिल्ली को 0.02% एंटी-माउस आईजीजी 1 एंटीबॉडी (एचआरपी)/टीबीएसटी ( सामग्री की तालिका देखें) में डालें और 40 मिनट के लिए हिलाएं, फिर 3x को 5 मिनट के लिए TBST के साथ हिलाएं।
    6. उन्नत केमिलुमिनेसेंस समाधान जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और झिल्ली को उजागर करें।
  4. ओएमवी-आरबीडी का शुद्धिकरण करें।
    1. प्रतिक्रिया किए गए ओएमवी-आरबीडी समाधान के 1 एमएल को 10 एमएल तक पतला करें, और 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 150,000 x g पर कमजोर पड़ने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सतह पर तैरने वाले को त्यागने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और अवशेषों को 10 एमएल पीबीएस के साथ निलंबित करें। 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 150,000 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और अवशेषों को 1 एमएल पीबीएस के साथ निलंबित करें।
      नोट: यदि एंटीजन की घुलनशीलता बहुत कम है, तो आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी19 द्वारा एक ही पृथक्करण प्रभाव प्राप्त किया जा सकता है।

5. लक्षण वर्णन

  1. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) करें।
    1. नमूने को 100 μg / mL एकाग्रता में पतला करें और नमूना सेल में 1 एमएल नमूना जोड़ें।
    2. "माप प्रकार" के लिए "आकार", "नमूना सामग्री" के लिए "प्रोटीन", "फैलाव" के लिए "पानी", "तापमान" के लिए "25 डिग्री सेल्सियस" चुनें, और फिर नमूने लोड करें और स्वचालित रूप से23 मापें।
  2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें।
    1. नमूने को 100 μg / mL तक पतला करें। एक 200-जाल तांबा ग्रिड लें, इसमें 20 μL नमूना जोड़ें, और इसे 10 मिनट के लिए अवशोषित होने दें।
    2. घोल को दूर करने के लिए फ़िल्टर पेपर का उपयोग करें, समर्थन फिल्म में 3% यूरिनिल एसीटेट के 20 μL जोड़ें, और 30 सेकंड के लिए दाग लगाएं।
    3. यूरिनिल एसीटेट को बंद करें और फिल्म को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्वाभाविक रूप से सुखाएं।
    4. नमूने को TEM सिस्टम पर लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 80 kV पर छवियों को कैप्चर करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के लिए फ़्लोचार्ट चित्रा 1 में दिखाया गया है। यह प्रोटोकॉल वैक्सीन प्लेटफॉर्म के रूप में ओएमवी का उपयोग करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण हो सकता है; किसी को केवल एंटीजन के प्रकार के आधार पर उपयुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों को चुनने की आवश्यकता है।

चित्रा 2 एक व्यवहार्य प्लास्मिड डिजाइन योजना प्रदान करता है। एससी जीन एक लचीले लिंकर के माध्यम से क्लाया जीन के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि एसटी शुद्धिकरण और सत्यापन के लिए हिस-टैग जीन के साथ आरबीडी जीन के 5 'टर्मिनल से जुड़ता है। वेस्टर्न ब्लॉट से पता चला कि प्रतिक्रिया धीरे-धीरे बढ़ती ओएमवी-एससी (चित्रा 3 ए) के साथ पूरी होती है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, लगभग सभी अपरिवर्तित आरबीडी-एसटी सुपरनैटेंट में बने रहे। दूसरा अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पहली बार (चित्रा 3 बी) पर एक और महत्वपूर्ण लाभ प्रदान नहीं करता है।

कण आकार का वितरण डीएलएस (चित्रा 4) द्वारा निर्धारित किया गया था। ओएमवी-एससी का जेड-औसत हाइड्रोडायनामिक व्यास 133 एनएम था, जबकि यह ओएमवी-आरबीडी के लिए 152.6 एनएम था (तालिका 1)। ये अंतर इसलिए हो सकते हैं क्योंकि आरबीडी गहन प्रदर्शन के बाद ओएमवी कण आकार को बढ़ाता है। टीईएम (चित्रा 5) के परिणाम डीएलएस परिणामों के अनुरूप हैं। छवियों से पता चला कि ओएमवी में हमेशा एक मानक गोलाकार संरचना होती है, चाहे आरबीडी से जुड़ी हो या नहीं। यह इंगित करता है कि निष्कर्षण, प्रतिक्रिया और शुद्धि की स्थिति ओएमवी की जैविक गतिविधि को बनाए रखने के लिए अनुकूल है।

Figure 1
चित्रा 1: ओएमवी-आरबीडी तैयारी का फ़्लोचार्ट। क्लाया-एससी प्लास्मिड को ई.कोलाई में बदल दिया गया था, जबकि आरबीडी-एसटी प्लास्मिड को एचईके 293 एफ कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। संवर्धन की अवधि के बाद, ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी को अलग और शुद्ध किया गया। पारंपरिक बफर और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन में बायोकोन्जेशन के बाद, ओएमवी-आरबीडी प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड प्रोफाइल। (बी) पीसीडीएनए आरबीडी-एसटी प्लास्मिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा ओएमवी-आरबीडी का सत्यापन। (ए) एंटी-6एक्स हिस्टैग के साथ ओएमवी-एससी और आरबीडी-एसटी के बीच प्रतिक्रिया अनुपात की खोज। एम: आणविक भार मार्कर 1: ओएमवी-एससी; 2: आरबीडी-एसटी; 3: OMV: RBD = 10: 1 (w / w); 4: OMV: RBD = 20: 1; 5: OMV: RBD = 40: 1. (बी) एंटी-6 एक्स हिस्टैग के साथ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की दक्षता का सत्यापन। एम: आणविक भार मार्कर 1: ओएमवी-एससी; 2: ओएमवी-आरबीडी प्री-अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; 3: आरबीडी-एसटी; 4: सुपरनैटेंट पोस्ट फर्स्ट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; 5: पहले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद अवक्षेपित; 6: सुपरनैटेंट पोस्ट सेकंड अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; 7: दूसरे अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद अवक्षेपित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: कण आकार वितरण डीएलएस द्वारा मापा जाता है। (बी) ओएमवी-आरबीडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: TEM द्वारा OMVs का विज़ुअलाइज़ेशन। (A) OMV-SC (200 μg/mL)। (बी) ओएमवी-आरबीडी (200 μg / mL)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना नाम तापमान (°C) Z-Ave (d.nm) PDI
OMV-SC 25 133 0.483
OMV-RBD 24.9 152.6 0.569

तालिका 1: डीएलएस द्वारा मापा पैरामीटर।

पूरक फ़ाइल 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

"प्लग-एंड-डिस्प्ले" नैनोपार्टिकल वैक्सीन प्लेटफॉर्म बनाने के लिए, एससी-फ्यूज्ड क्लाया को बीएल 21 (डीई 3) उपभेदों में व्यक्त किया गया था, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति24 में इसके फायदों के कारण पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडलों में से एक है, ताकि बैक्टीरिया प्रसार की प्रक्रिया के दौरान ओएमवी की सतह पर पर्याप्त एससी टुकड़ा प्रदर्शित हो। उसी समय, एंटीजन और ओएमवी के बीच रासायनिक युग्मन के लिए एक एसटी-फ्यूज्ड टारगेट एंटीजन तैयार किया गया था। इस प्रयोगात्मक योजना के फायदे और भविष्य के आवेदन की संभावनाएं मुख्य रूप से तीन पहलुओं में परिलक्षित होती हैं। सबसे पहले, विभिन्न एंटीजन और जैविक नैनोकणों की "प्लग-एंड-डिस्प्ले" प्रणाली का एहसास होता है। प्रतिक्रिया और शुद्धिकरण प्रक्रिया तेज और सीधी हो सकती है, जिसके उभरते संक्रामक रोगों और अन्य परिदृश्यों के लिए टीके विकसित करने में महत्वपूर्ण फायदे हैं। दूसरा, यह उच्च घनत्व एंटीजन प्रदर्शन के लक्ष्य को प्राप्त करता है और कम इम्युनोजेनेसिटी वाले कुछ एंटीजन के लिए एक वैक्सीन डिजाइन विधि प्रदान करता है। तीसरा, ओएमवी और आरबीडी (एंटीजेनिक प्रोटीन) की व्यक्तिगत अभिव्यक्ति उच्च एंटीजन गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए फायदेमंद है क्योंकि पारंपरिक प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणालियों में विशेष कोफ़ैक्टर्स, आणविक चैपरोन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों जैसे कार्यों की कमी होती है, जिससे प्रोटीन हानि और मिसफोल्डिंग हो सकती है।

प्लास्मिड निर्माण की प्रक्रिया में, सीएलवाईए को मुख्य रूप से सीएलवाईए के सी-टर्मिनल की ढीली बैरल-आकार की संरचना के कारण एससी से जुड़ने के लिए एक लक्ष्य के रूप में चुना गया था। अध्ययनों से पता चला है कि हीमोग्लोबिन प्रोटीज (एचबीपी) ऑटोट्रांसपोर्टर स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस25,26 से एंटीजन प्रदर्शित कर सकता है। अन्यथा, यदि प्रदर्शित किया जाने वाला एंटीजन प्रोकैरियोट से है, तो एससी / एसटी संयुग्मन का उपयोग किए बिना एंटीजन को सीधे सीएलवाईए के सी-टर्मिनल में बनाना संभव है। इस विधि के परिणामस्वरूप उच्च प्रदर्शन घनत्व वाले ओएमवी हो सकते हैं, लेकिन अभी भी एक जोखिम है कि एंटीजेनिक प्रोटीन सही ढंग से फोल्ड नहीं होंगे। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एससी / एसटी को लक्ष्य टुकड़े में डालने पर एक लचीले लिंकर को डिजाइन और उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो एससी और एसटी के बीच प्रतिक्रिया दक्षता में सुधार करने में मदद करता है। यहां उपयोग किया जाने वाला लिंकर अनुक्रम GSGGSGGSGTG था, और अन्य लचीले लिंकर भी चुने जा सकते हैं।

क्लिक-रसायन विज्ञान संयुग्मन के लिए एससी / एसटी प्रणाली के अलावा, स्नूपटैग / स्नूपकैचर और सॉर्टेस ए संयुग्मन का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन27,28 के बीच सहसंयोजक संयुग्मन के लिए भी किया जाता है। साथ ही, यह भी बताया गया है कि एक ही वेक्टर29 पर कई अलग-अलग लिंकेज सिस्टम की शुरूआत या कई एंटीजन19 के लिए एक ही लिंकेज सिस्टम का उपयोग एक ही वेक्टर पर कई हेटरोलॉगस एंटीजन प्रदर्शित करने के उद्देश्य को प्राप्त कर सकता है, और फिर पॉलीवेलेंट या मल्टीफंक्शनल टीके तैयार किए जा सकते हैं।

उच्च साइटोटॉक्सिसिटी और कम उपज वैक्सीन प्लेटफॉर्म 4,30 के रूप में ओएमवी के व्यापक उपयोग को सीमित करती है। ओएमवी की साइटोटॉक्सिसिटी को कम करने के लिए प्रासंगिक साहित्य31,32,33 के अनुसार, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले तनाव में कुछ एलपीएस-संबंधित जीनों को बाहर कर दिया गया है। इस प्रोटोकॉल में पेश की गई विधि द्वारा बैक्टीरिया के समाधान के प्रत्येक 1 एल से 1.18 मिलीग्राम ओएमवी निकाले जा सकते हैं। उपज अभी भी कुछ आनुवंशिक रूप से संशोधित उच्च-पुटिका-उत्पादकउपभेदों की तुलना में कम है। यदि आवश्यक हो, तो उच्च दबाव समरूपीकरण अधिक ओएमवी का उत्पादन करने के लिए जीवाणु झिल्ली के अंकुरण को भी बढ़ावा दे सकता है, जो बेहतर उपज प्राप्त कर सकता है और एक ही समय में घनत्व प्रदर्शित कर सकताहै।

ओएमवी की सतह पर प्रदर्शित एससी के घनत्व के लिए प्रेरण की स्थिति महत्वपूर्ण है। हमने एसडीएस-पेज के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की निगरानी की और फिर प्रेरण स्थिति की जांच की, जो अपेक्षाकृत हल्का है और अधिक प्रोटीन व्यक्त करता है। विभिन्न प्रोटीनों को अलग-अलग प्रेरण स्थितियों की आवश्यकता हो सकती है, और प्रेरण स्थितियों में परिवर्तन से ओएमवी की सतह पर प्रदर्शित एससी के घनत्व में अंतर हो सकता है। प्रयोगात्मक स्थितियों के बाद एंटीजन और वाहक अनुपात को समायोजित करने का सुझाव दिया जाता है ताकि सबसे उपयुक्त प्रतिक्रिया अनुपात का पता लगाया जा सके। इसके अलावा, ओएमवी-आरबीडी का शुद्धिकरण एसईएम या अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। दोनों तरीकों की कोशिश की गई थी; अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन अधिक सुविधाजनक है, और परिणामस्वरूप ओएमवी में एसईएम प्रोटोकॉल के समान शुद्धता थी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चोंगकिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के प्रमुख कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (सं। सीएसटीसी 2020jcyj-zdxmX0027) और चीनी राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन परियोजना (संख्या 31670936, 82041045)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 185
सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन प्रदर्शित करने वाले बाहरी झिल्ली पुटिकाओं पर आधारित एक "प्लग-एंड-डिस्प्ले" नैनोपार्टिकल वैक्सीन प्लेटफॉर्म
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