Summary
本プロトコルは、外膜小胞のバイオエンジニアリングを、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームとして説明しています。
Abstract
細菌またはウイルスから得られる生体模倣ナノ粒子は、ワクチンの研究開発において大きな関心を集めている。外膜小胞(OMV)は、平均的な成長中に主にグラム陰性菌によって分泌され、ナノサイズの直径と自己アジュバント活性を持ち、ワクチンの送達に理想的である可能性があります。OMVは、タンパク質、核酸、および低分子の多面的な送達システムとして機能してきました。OMVの生物学的特性を最大限に活用するために、バイオエンジニアリングされた 大腸菌由来のOMVをキャリアとして、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)を抗原として利用して、「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームを構築しました。 化膿レンサ 球菌のスパイキャッチャー(SC)ドメインとスパイタグ(ST)ドメインをコンジュゲートOMVとRBDに適用しました。Cytolysin A(ClyA)遺伝子は、プラスミドトランスフェクション後に融合タンパク質としてSC遺伝子とともに翻訳され、OMVの表面に反応部位を残しました。従来のバッファーシステムでRBD-STを一晩混合した後、OMVとRBDの間に共有結合を形成しました。このようにして、多価表示OMVワクチンが達成された。OMVワクチンプラットフォームは、多様な抗原に置き換えることで、さまざまな不均一な抗原を効率的に表示できるため、感染症の流行を迅速に防ぐことができます。このプロトコルは、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む、OMVワクチンプラットフォームを構築するための正確な方法を説明しています。
Introduction
潜在的なワクチンプラットフォームとして、外膜小胞(OMV)は近年ますます注目を集めています1,2。主にグラム陰性菌3によって自然に分泌されるOMVは、通常20〜300nmのサイズの脂質二重層で構成される球状のナノスケール粒子です4。OMVには、細菌抗原や病原体関連分子パターン(PAMP)など、固形免疫増強因子として機能するさまざまな親細菌成分が含まれています5。OMVは、そのユニークな成分、自然な小胞構造、および優れた遺伝子工学修飾部位の恩恵を受けて、細菌ワクチン6、アジュバント7、癌免疫療法薬8、薬物送達ベクター9、および抗菌接着剤10を含む多くの生物医学分野で使用するために開発されてきました。
2020年以降世界中に広がったSARS-CoV-2のパンデミックは、グローバル社会に大きな打撃を与えました。スパイクタンパク質(Sタンパク質)の受容体結合ドメイン(RBD)は、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)と結合することができ、次いで、細胞へのウイルスの侵入を媒介する11、12、13。したがって、RBDはワクチン発見の主要な標的であるように思われます14,15,16。しかし、単量体RBDは免疫原性が低く、分子量が小さいため免疫系が認識しにくいため、アジュバントが必要になることがよくあります17。
RBDの免疫原性を高めるために、多価RBDを示すOMVを構築した。RBDを表示するためにOMVを使用する既存の研究は、通常、RBDをOMVと融合させて細菌で発現させます18。しかし、RBDはウイルス由来のタンパク質であり、原核生物の発現はその活性に影響を与える可能性があります。この問題を解決するために、 化膿レンサ球菌由来のSpyTag(ST)/SpyCatcher(SC)系を用いて、従来の緩衝系においてOMVおよびRBDと共有結合性イソペプチドを形成した19。SCドメインは、バイオエンジニアリングされた 大腸菌による融合タンパク質としてCytolysin A(ClyA)で発現し、STはHEK293F細胞発現系を介してRBDで発現しました。OMV-SCとRBD-STを混合し、一晩インキュベートしました。超遠心またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による精製後、OMV-RBDが得られた。
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Protocol
1. プラスミド構築
- SpyCatcher配列をコードするDNA(補足ファイル1)を、BamH IサイトとSal Iサイトの間のアンピシリン耐性pThioHisA-ClyAプラスミド(材料表を参照)に挿入し、以前に発表された第20相に続いてプラスミドpThioHisA ClyA-SCを構築します。
- 合成したSpyTag-RBD-Histag融合遺伝子(補足ファイル1)を、BamH IサイトとEcoR Iサイトの間のpcDNA3.1プラスミド( 材料表を参照)にリゲートし、以前に発表された第19報告に従ってプラスミドpcDNA3.1 RBD-STを構築しました。
2. OMV-SCの準備
- 以下の手順に従ってClyA-SC変換を実行します。
- 5 μLのpThioHisA ClyA-SCプラスミド溶液(50 ng/μL)を50 μLのBL21コンピテント株に加え、穏やかに吹き付け、氷上で30分間冷却します。
- 溶液を42°Cの水浴に90秒間入れ、次に混合溶液を氷上に3分間置く。
- 細菌懸濁液に500 μLのLB培地を加え、混合後、220 rpm、37°Cで1時間培養します。
- すべての形質転換をアンピシリン(100 μg/mL、 材料の表を参照)を含むLB寒天プレートにプレートし、37°Cで一晩培養します。
注:その後の実験では、アンピシリンは培地中で同じ濃度に保たれました。そうでない場合、これは細菌のプラスミドの損失を引き起こす可能性があります。
- OMV-SC 実動の場合は、以下のステップを実行します。
- プレートから単一コロニーを単離し(ステップ2.1.4.)、20 mLのLB(アンピシリン耐性)培地に、37°Cで220 rpmで一晩培養します。
- 細菌溶液(ステップ2.2.1から)を2L培地に植菌し、対数増殖段階(OD600nm は0.6〜0.8の間)まで220rpm、37°Cで5時間培養する。
- 細菌溶液の600 nmでのODが0.6〜0.8に達したら、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、 材料表を参照)を加えて細菌溶液の最終濃度を0.5 mMにし、25°Cで220 rpmで一晩培養します。
- OMV-SC 精製を実行します。
- 細菌溶液を7,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
- 上清を0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、100 kD限外ろ過膜または中空糸カラムを使用して濃縮します( 材料表を参照)。
- 濃縮液を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心分離機(材料の表を参照)を使用して4°Cで2時間150,000 x gで遠心分離し、ピペットで上清を廃棄します。
- 沈殿をPBSで再懸濁し、-80°Cで保存します。 この溶液は、-80°Cで長期安定性を維持できます。
3. RBD-STの準備
- 以下の手順に従ってRBD-STトランスフェクションを実行します。
- 適切な真核生物発現系(例えば、HEK293F)を選択し、回収後に細胞を37°Cで130rpmで一晩培養する。
- 20 μLのHEK293F細胞溶液を自動セルカウンター( 材料表を参照)に加え、細胞数を記録し、濃度を1 x 106 細胞/mLに調整してから、細胞を130 rpm、37°C、4時間培養します。
- RBD-STプラスミドを0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10 mLになるまで300 μgのプラスミドを細胞培養培地( 材料の表を参照)に加えます。10秒間振とうします。
- PEI(1 mg/mL、 材料表参照)をウォーターバスで65°Cに加熱し、0.7 mLのPEIと9.3 mLの細胞培養培地を混合し、10秒間間欠的に振とうします。
注意: 溶液を激しく振らないでください。そうしないと、結果として生じる気泡がトランスフェクション効率に影響を与える可能性があります。 - プラスミド溶液をPEI溶液に加え、混合物を断続的に10秒間振とうし、37°Cで15分間インキュベートします。
- この混合物を280 mLの細胞培養培地に加え、37°Cで130 rpmで5日間培養します。
- RBD-ST精製を実行します。
- 細胞を6,000 x g で25°Cで20分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を回収します。
- カラムに2 mLのNi-NTAアガロース( 材料表を参照)を満たし、3x PBSで3回洗浄します。
- 細胞上清にイミダゾール( 材料表参照)を加えて最終濃度を20mMにし、細胞上清を2倍負荷します。
- 洗浄用に20 mMのイミダゾールを含むPBSを3カラム容量(CV)添加し、洗浄画分を回収します。
- 低濃度から高濃度(例:.、0.3 M、0.4 M、0.5 M)のイミダゾールを含む3 CVのPBSでグラジエント溶出します。各濃度で2倍に溶出します。
- SDS-PAGE21 を使用して、異なる濃度勾配でRBD-STを特定します。
4. OMV-RBDバイオコンジュゲーションと精製
- BCA法によりタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。
- 標準BSAタンパク質溶液を2 mg/mLから0.0625 mg/mLに連続希釈し、精製したOMV-SCとRBD-STを10倍に希釈してから、BCA作業溶液AとB(アッセイキットに付属)を50:1(v/v)の比率で混合します。
- 希釈したタンパク質溶液(25 μL/ウェル)を加え、BCA作業溶液(200 μL/ウェル)と混合します。37°Cで30分間インキュベートします。
- 各ウェルの562 nmにおける吸光度(OD)を測定し、標準曲線22からタンパク質濃度を算出する。
- 以下の手順に従って、OMV-SCおよびRBD-STのバイオコンジュゲーションを実行します。
- OMV-SCとRBD-STをPBSで40:1(w / w)の比率で混合します。
- 垂直回転させて、混合物を4°Cで15rpmで一晩ブレンドします。
注:異なる抗原は異なる比率で反応する可能性があります。抗原の特性に基づいて異なる反応比を試すことができます。
- 反応効率を検証します。
- 10 μLのOMV-SC、RBD-ST、および反応生成物を準備します(ステップ4.2)。2.5 μLの5xローディングバッファー( 材料表を参照)を加え、サンプルを100°Cで5分間加熱します。サンプルをゲル(10 μL/ウェル)にロードします。60Vで20分間電気泳動を行い、条件を120Vに1時間変更します。
- タンパク質をゲルからPVDFウェスタンブロッティングメンブレン( 材料の表を参照)に100 Vで70分間移します。
- メンブレンを5%の無脂粉ミルク/ TBSTに入れ、1時間振とうします。その後、TBSTで3回、振とうしながら1回の洗浄につき5分間洗浄します。
- メンブレンを0.1%His-Tag抗体/ TBST( 材料の表を参照)に入れて1時間振とうした後、振とうしながら洗浄ごとにTBSTで5分間3回洗浄します。
- メンブレンを0.02%抗マウスIgG1抗体(HRP)/TBST( 材料表参照)に入れて40分間振とうした後、振とうしながら1回洗浄するごとにTBSTで3回5分間洗浄します。
- 強化された化学発光溶液( 材料の表を参照)を追加し、膜を露出させます。
- OMV-RBDの精製を行います。
- 反応したOMV-RBD溶液1 mLを10 mLに希釈し、希釈液を150,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
- ピペットを使用して上清を捨て、残渣を10 mLのPBSで懸濁します。懸濁液を150,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
- 上清を捨て、残渣を1 mLのPBSで懸濁します。
注:抗原の溶解度がはるかに低い場合、サイズ排除クロマトグラフィー19によって同じ分離効果を達成することができる。
5.特性評価
- 動的光散乱(DLS)を実行します。
- サンプルを100 μg/mLの濃度に希釈し、1 mLのサンプルをサンプルセルに加えます。
- 「測定タイプ」に「サイズ」、「試料材料」に「タンパク質」、「分散剤」に「水」、「温度」に「25°C」を選択し、試料をロードして自動測定します23。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して画像をキャプチャします。
- サンプルを100 μg/mLに希釈します。200メッシュの銅グリッドを取り、それに20μLのサンプルを加え、10分間吸収させます。
- ろ紙を使用して溶液を吸い取り、20 μLの3%酢酸ウラニルをサポートフィルムに加え、30秒間染色します。
- 酢酸ウラニルを吸い取り、フィルムを室温で1時間自然乾燥させます。
- サンプルをTEMシステム( 材料表を参照)にロードし、80kVで画像をキャプチャします。
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Representative Results
このプロトコルのフローチャートを 図 1 に示します。このプロトコルは、OMVをワクチンプラットフォームとして利用するための一般的なアプローチである可能性があります。抗原の種類に基づいて適切な発現システムを選択するだけで済みます。
図2は、実現可能なプラスミド設計スキームを示しています。SC遺伝子はフレキシブルリンカーを介してClyA遺伝子と接続され、STは精製と検証のためにHisタグ遺伝子でRBD遺伝子の5'末端に接続します。ウェスタンブロットは、OMV-SCの増加とともに反応が徐々に完了することを示した(図3A)。超遠心後、未反応のRBD-STのほとんどすべてが上清中に残存した。2回目の超遠心分離は、1回目に比べてさらなる有意な利点を提供しなかった(図3B)。
粒径の分布はDLSにより決定した(図4)。OMV-SCのZ平均流体力学的直径は133 nmでしたが、OMV-RBDのZ平均流体力学的直径は152.6 nmでした(表1)。これらの違いは、RBDが集中的な表示後にOMV粒子サイズを増加させるためである可能性があります。TEMの結果(図5)はDLSの結果と一致しています。画像は、OMVがRBDに接続されているかどうかにかかわらず、常に標準的な球形構造を持っていることを示しました。これは、抽出、反応、および精製条件がOMVの生物学的活性を維持するのに役立つことを示しています。
図1:OMV-RBD準備のフローチャート。 ClyA-SCプラスミドは 大腸菌に形質転換され、RBD-STプラスミドはHEK293F細胞にトランスフェクトされました。一定期間の培養後、OMV-SCおよびRBD-STを単離し、精製した。従来のバッファーおよび超遠心分離でのバイオコンジュゲーションの後、OMV-RBDが得られた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:本研究で使用したプラスミドプロファイル。 (a)pThioHisA ClyA-SCプラスミド。(イ)PCDNA RBD-STプラスミド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ウェスタンブロットによるOMV-RBDの検証 。 (A)アンチ6xHisTagを用いたOMV-SCとRBD-STの反応比の探索。M:分子量マーカー1:OMV-SC;2: RBD-ST;3: OMV:RBD = 10:1 (w/w);4: OMV:RBD = 20:1;5: OMV:RBD = 40:1。(B)抗6xHisTagによる超遠心分離の効率の検証。M:分子量マーカー1:OMV-SC;2:OMV-RBD前超遠心分離;3: RBD-ST;4:第1回超遠心後の上清;5:第1の超遠心分離後の沈殿物;6:2回目の超遠心分離後の上清;7:2回目の超遠心分離後の沈殿物。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DLSで測定した粒度分布。 (A)OMV-SC.(B) OMV-RBD. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:TEMによるOMVの可視化。 (A) OMV-SC (200 μg/mL)。(B) OMV-RBD (200 μg/mL) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル名 | 気温(°C) | Zアベニュー (d.nm) | PdI |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
表1:DLSによって測定されたパラメータ。
補足ファイル1:本研究で用いたプラスミド配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォームを作成するために、SC融合ClyAは、タンパク質発現24の利点のために組換えタンパク質生産に最も広く使用されているモデルの1つであるBL21(DE3)株で発現され、細菌増殖の過程でOMVの表面に十分なSCフラグメントが表示されます。同時に、抗原とOMVの間の化学的カップリングのためにST融合標的抗原を調製した。この実験スキームの利点と将来の適用の見通しは、主に3つの側面に反映されています。まず、異なる抗原と生体ナノ粒子の「プラグアンドディスプレイ」システムが実現されます。反応と精製のプロセスは迅速かつ簡単であり、緊急感染症やその他のシナリオのワクチンの開発に大きな利点があります。第二に、高密度抗原提示の目標を達成し、免疫原性の低い一部の抗原に対するワクチン設計方法を提供します。第三に、OMVおよびRBD(抗原タンパク質)の個々の発現は、従来の原核生物発現系が特定の補因子、分子シャペロン、および翻訳後修飾などの機能を欠いており、タンパク質の損失およびミスフォールディングにつながる可能性があるため、高い抗原活性を確保するのに有益である。
プラスミド構築の過程で、ClyAは、主にClyAのC末端の緩い樽型構造のためにSCと結合するターゲットとして選択されました。研究によると、ヘモグロビンプロテアーゼ(Hbp)オートトランスポーターは、連鎖球菌肺炎および結核菌からの抗原を表示できることが示されています25,26。それ以外の場合、表示する抗原が原核生物由来のものである場合、SC/ST結合を使用せずにClyAのC末端に直接抗原を構築することが可能です。この方法では、OMVの表示密度が高くなる可能性がありますが、抗原タンパク質が正しく折りたたまれないリスクがあります。SC/STをターゲットフラグメントに挿入する際には、SCとSTの反応効率を向上させる柔軟なリンカーを設計して使用する必要があることに注意することが重要です。ここで用いたリンカー配列はGSGGSGGSGTGであり、他のフレキシブルリンカーも選択することができる。
クリックケミストリー結合のためのSC/STシステムに加えて、スヌープタグ/スヌープキャッチャーおよびソルターゼA結合もタンパク質間の共有結合に一般的に使用されます27,28。同時に、同じベクター29上に複数の異なるリンケージシステムを導入するか、複数の抗原19に対して同じリンケージシステムを使用することで、同じベクター上に複数の異種抗原を提示するという目的を達成し、多価または多機能のワクチンを調製できることも報告されている。
高い細胞毒性と低い収量は、ワクチンプラットフォームとしてのOMVの広範な使用を制限します4,30。いくつかのLPS関連遺伝子は、OMVの細胞毒性を減少させるために、関連文献31、32、33によれば、このプロトコルで使用される株においてノックアウトされている。このプロトコルで導入された方法により、1.18 Lの細菌溶液から1.18 mgのOMVを抽出できます。収量は、いくつかの遺伝子組み換え高小胞産生株の収量よりもまだ低い34。必要に応じて、高圧均質化は、細菌膜の発芽を促進してより多くのOMVを生成することもでき、これにより、収量の向上と表示密度を同時に達成できます35。
誘導条件は、OMVの表面に表示されるSCの密度にとって非常に重要です。SDS-PAGEで標的タンパク質の発現をモニタリングし、比較的穏やかでより多くのタンパク質を発現する誘導条件をスクリーニングしました。タンパク質が異なれば誘導条件も異なり、誘導条件の変化により、OMVの表面に表示されるSCの密度に違いが生じる可能性があります。実験条件変更後に抗原とキャリア比を調整して、最も適切な反応比を探索することが示唆される。さらに、OMV−RBDの精製は、SEMまたは超遠心分離によって達成することができる。両方の方法が試されました。超遠心分離はより便利であり、得られたOMVはSEMプロトコルと同様の純度を有していた。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、重慶自然科学基金会の主要プログラム(No.cstc2020jcyj-zdxmX0027)および中国国家自然科学財団プロジェクト(第31670936号、82041045)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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